말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

이 절차의 전반적인 목표는 인간 말초 혈액 유래 유도 만능 줄기 세포 또는 IPS 세포에서 연골 생성 계통 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 연골 복구를 위한 IPS 세포 생성을 위해 환자 유래 말초 혈액 세포를 C 세포로 사용하는 것에 대한 연골 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽게 재현할 수 있고 연골 세포 분화가 혈청 및 이종이 없는 조건에서 발생한다는 것입니다.

방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포 공급세포의 단층이 들어 있는 60mm 조직 배양 접시에 4mL 인간 IPSC 배지의 인간 IPS 세포를 도금하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도에서 세포를 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 줄기세포가 80-90% 융합되면 계대배양을 위해 dispace 용액으로 세포를 해리합니다.

2-3회 통과 후 불로 뽑은 유리 바늘을 사용하여 80-90% 합류 미분화 IPSC 콜로니를 더 작은 조각으로 해부하고 100개 이하의 세포 배양 조각을 10밀리리터의 배아체 형성 배지를 포함하는 새로운 비부착 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 기계적 해리는 새로운 배양 용기로 옮겨질 세포의 작은 조각에 대한 세포 손상을 줄이고 인간 IPS 세포 분화를 억제하는 공급 세포의 수동 처리를 알리기 때문에 자동 분해보다 낫습니다. human IPS 세포를 cell culture incubator로 되돌립니다.

이틀 후, 배아체가 가라앉을 수 있도록 접시를 기울이고 배아체 형성 배지 3ml를 신선한 기저 배양 배지 4ml로 조심스럽게 교체합니다. 10일이 지나면 배아체가 형성됩니다. 새 100mm 접시에 0.1% 젤라틴 4ml를 섭씨 37도에서 30분 동안 코팅합니다.

상등액이 포함된 배아체를 15ml 원추형 튜브로 옮기고 시체를 4-5분 동안 가라앉힙니다. 마지막 0.5 밀리리터의 배지를 제외한 모든 배지를 흡인하고 10 밀리리터의 새로운 기초 배양 배지에 배아체를 재현탁시킵니다. 젤라틴이 굳으면 젤라틴을 버리십시오.

그런 다음 젤라틴으로 코팅된 접시에 세포를 파종하고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양에서 10일이 지나면 배아체는 섬유아세포 파생물로 분화됩니다. 연골세포 분화를 유도하려면 DPBS로 배양액을 세척하고 섭씨 37도에서 5분 동안 0.25% 트립신 EDTA 3밀리리터로 세포를 분리합니다.

세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려지면 4ml의 새로운 기초 배양 배지로 반응을 중화하고 배양을 5-10회 부드럽게 적정합니다. 70미크론 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 그런 다음 100ml의 새로운 기초 배양 배지에 있는 새로운 젤라틴 코팅된 10mm 플레이트에 세포를 파종합니다.

배양액이 90-100% 포화도에 도달하면, 방금 카운팅을 위해 시연된 것처럼 0.25% 트립신 EDTA 3밀리리터로 세포를 수확합니다. 원심분리를 위해 세포의 3배 10에서 5번째 분취액을 15ml 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 그리고 펠릿을 1 밀리리터의 연골 생성 분화 배지에 재현탁시킵니다.

그런 다음 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 21일 동안 세포 배양 인큐베이터에 튜브를 놓습니다. 연골 생성 세포는 in vitro에서 조립되어 고밀도 배양 조건에서 특징적인 세포 외 메트릭을 생성할 수 있습니다. 배양 21일 후, 인간 IPS 세포 연골형성 펠릿이 형성됩니다.

배양 21일 후, 인간 IPSC 연골형성 세포는 파란색 염색에서 알시안 블루(alcian blue) 및 톨루이딘(toluidine)에 대해 양성이며, 이는 HIPSC 펠릿의 성공적인 연골형성 분화를 나타냅니다. 콜라겐 2 및 콜라겐 10에 대한 면역조직화학 분석은 연골세포와 유사한 표현형을 추가로 확인합니다. 황산화 글리코사미노글리칸 분석은 세포의 황산화 글리코사미노글리칸 함량이 인간 IPSC 섬유아세포 유사 세포, 배아체 및 미분화된 인간 IPS 세포에 비해 인간 IPSC 연골 형성 펠릿에서 유의하게 상향 조절되는 것을 보여줍니다.

또한, 인간 IPSC 연골형성 세포는 연골형성체 계통의 높은 유전자 발현 수준과 완전히 분화된 연골세포 마커를 보여주며, 이는 성공적인 연골형성 분화의 달성을 시사합니다. 인간 IPSC를 연골세포로 분화하는 데 사용되는 다단계 배양 방법으로, EB 형성을 통한 자발적 분화, EB로부터의 세포 성장, 세포 배양 후 단층 세포 배양 및 3D 펠릿 배양을 포함합니다. 연골세포 표현형은 조직학적 분석, 생화학적 분석 및 연골형성 유전자 발현에 의해 평가됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 인간 IPS 세포를 연골세포로 분화시키기 위해 다단계 배양 방법을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 환자에 따라 다르고 비용 효율적일 수 있습니다.