Name: 말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 배우세요 말초 혈액 유래 iPSC에서 연골 세포로 분화하는 방법을. 혈청 및 제노 프리 조건에서 21일간 3D 펠릿 배양으로 환자 특이적 연골 재생을 위한 재현 가능한 프로토콜을 확인하세요.

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저자는 자신의 플라스미드 인 Xiaobin Zhang에게 감사 드리고자합니다. 우리는 또한 Shaorong Gao와 Qianfei Wang에게 실험 중에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81101346, 81271963, 81100331), 베이징 215 고급 인재 프로젝트 (No.2014-3-025) 및 베이징 차오양 병원 기금 (No CYXX-2017-01), 중국 과학 아카데미 청소년 혁신 진흥 협회 (YL).

PBCs로부터 hiPSC를 생성하기위한 프로토콜은 이전의 연구 5 에서 찾을 수있다. 이 연구는 우리 기관의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 1. 배아 체 (EB) 형성 <ol><li> hiPSC 배지 50 ML : 15 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 × 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올, 2 MM L을 보충 한 녹아웃 Dulbecco의 수정 이글 매체 (DMEM) - 글루타민 및 8 ng / mL 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF). </li><li> 50 ML의 EB 형성 매체 : 15 % KSR, 5 % FBS, 1x 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오. </li><li> 기본 배양 배지 50 ML : 20 % FBS, 1 × 비 필수 아미노산, 55 μm의 2 - mercaptopoethanol, 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오. </li><li> 디스 패아 제 용액 10 mL를 녹아웃 DMEM에 1 mg / mL로 준비합니다. </li><li> 문화피더 세포 ( 즉, 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 세포의 단일 층)를 갖는 60-mm 조직 배양 접시에 hiPSCs를 재현한다. 세포가 80-90 % 합류되면 dispasis로 세포를 분리하고 4-5 일마다 hiPSCs 1 : 3을 통과시킵니다. 37 ° C와 5 % CO 2 배양기에 세포를 놓습니다. </li><li> iPSCs가 80-90 % 합류하는 경우, 불 - 그린 유리 바늘을 사용하여 미분 hiPSC 식민지를 작은 조각 (직경 약 50-100 μm)으로 해부합니다. 일반적으로, 100mm 페트리 접시에 EBs를 생성하는 60mm 요리에 hiPSC 식민지를 사용하십시오. <ol><li> 10 mm의 EB 형성 배지가 들어있는 100 mm 비 접착 성 배양 접시에서 100 개 미만의 작은 콜로니 조각을 배양합니다. 접시를 37 ° C 및 5 % CO 2 배양기에 넣으십시오. </li></ol></li><li> 초기 배지의 약 25 %를 2 일마다 동일한 양의 배양 배지로 교체하십시오. EB를 고정 시키도록 접시를 기울이십시오. 조심스럽게 3 mL신선한 배지 4 mL를 넣는다. EB를 방해하지 마십시오. 참고 : EBs는 현미경으로 부드러운 테두리와 둥근 모양을 취하는 식민지 조각에 의해 형태학 특징입니다. </li><li> 비 접착 성 배양 접시에서 10 일간 배양 한 후 사용하기 전에 37 ℃에서 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 4 mL로 새로운 100 mm 조직 배양 접시를 코팅하십시오. </li><li> 매체 플러스 EB를 100mm, 비 접착 성 페트리 접시에서 15mL 원추형 튜브로 옮기십시오. EBs가 4-5 분 동안 침전되게하십시오. 조심스럽게 상청액을 흡인하고 중성 플러스 EB 0.5 mL 미만을 남겨 둡니다 </li><li> 10 ㎖의 기본 배양 배지가있는 100 mm 젤라틴 코팅 조직 배양 접시에 100 EB 미만의 종자를 뿌립니다. 접시를 37 ° C 및 5 % CO 2 배양기에 넣으십시오. </li></ol> 2. 세포 펠렛 형성과 연골 세포의 분화 <ol><li> 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 10 mL를 만든다. bas의 80 ML을 확인하십시오α 배양 배지 : 20 % FBS, 1x 비 필수 아미노산, 55μM 2- 메르 캅토 에탄올 및 2mM L- 글루타민으로 보충 된 DMEM. </li><li> 10 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 용액 (ITS), 0.1 μM dexamethasone, 1 mM ascorbic acid, 1 % sodium pyruvate 및 10 ng / mL transforming growth factor-로 보충 된 DMEM (고 포도당) 10 ml를 연골 분화 배지로 만든다. 베타 1 (TGF-β1). </li><li> 48 시간 후 기본 배지 10 ML로 매체를 새로 고침. 그 후, 기본 배지 10 mL로 3 일마다 배지를 새로 고친다. 참고 : 배양 10 일 후, 섬유 아세포 세포의 성장은 EB에서 확장되어야합니다. <ol><li> 37 ° C에서 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 4 mL로 100 mm 접시를 코팅하십시오. 세포 상등액을 버리고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 한 번 씻으십시오. </li><li> 37 ℃에서 0.25 % 트립신 / EDTA 3 mL로 세포를 소화시키고 5 분간 처리하고 4 mL의 기본 배지. </li></ol></li><li> 5-10 배 위아래로 pipetting하고 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 그들을 통과하여 단일 세포에 세포를 떼어. 5 분 200 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 세포를 새로운 100mm 젤라틴 코팅 조직 배양 접시에 다시 넣고 기본 배지 10 mL를 넣으십시오. </li><li> 48 시간 후 기본 배지 10 ML로 매체를 새로 고침. 그 후, 기본 배지 10 mL로 3 일마다 배지를 새로 고친다. 참고 : 세포는 균일 한 섬유 모세포 유사 형태를 획득합니다. </li><li> ~ 90-100 % 합류 ( 즉, 약 5-7 일)에 도달하면, 세포를 37 ℃에서 0.25 % 트립신 / EDTA 3 mL로 5 분 동안 수확한다. 4 mL의 기본 배지로 중화시킨다. 5 회 위아래로 pipetting하여 단일 세포로 세포를 떼어. hemocytometer를 사용하여 세포 번호를 계산합니다. <ol><li> 15 mL 폴리 프로필렌 튜브에 3 x 10 5 세포를 놓습니다. 200 xg로 원심 분리기실온 (RT)에서 5 분간. chondrogenic 차별화 매체 1 ML의 세포를 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 3 분 동안 300 XG에서 세포를 재 원심 분리하고 작은 펠렛 형태로 세포를 유지하십시오. 21 일 동안 튜브를 37 ° C와 5 % CO 2 배양기에 넣으십시오. 뚜껑을 단단히 조이고 가스 교환을시키지 마십시오. </li><li> 신선한 chondrogenic 차별화 매체와 3 일마다 문화 매체 3/4을 교체하십시오. 참고 : 배양 후 21 일이 지나면 hiPSC 연쇄 펠릿 (hiPSC-Chon)이 형성되었을 것입니다. 양성 대조군 인 인간 간엽 줄기 세포 (MSCs)도 수집하여 연골 분화 배지에서 21 일간 배양하여 연골 형성 펠렛 (hMSC-Chon)을 형성시킨다. </li></ol> 3. 연골 분화 분석 <ol><li> 10 % 중성 완충 포르말린 10 ML을 준비합니다. </li><li> 0.1 % 알 시안 블루 시약 50 mL와 1 % 톨루이딘 블루 시약 50 mL를 준비한다. </li><li> Pr콜라겐 II (1:50)에 대한 토끼 폴리 클론 항체 또는 콜라겐 X (1:50)에 대한 마우스 단일 클론 항체의 1 차 항체를 발현. 또한, 항 토끼 또는 마우스 보조 항체를 준비하십시오. </li><li> 파파인 솔루션 1 ML : 0.1 M 나트륨 아세테이트, 2.4 MM EDTA 및 5 MM L - 시스테인과 PBS에 10 U / ML하십시오. </li><li> 100 mL의 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 염료 용액을 만든다. 16 mg / L 1,9- 디메틸 메틸렌 블루, 40 mM 글리신, 40 mM NaCl, 9.5 mM HCl 100 μL; pH 3.0. </li><li> 펠렛 섹션의 alcian blue 및 toluidine blue 얼룩에 의한 연골 분화를 평가하십시오. <ol><li> 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린 1 ML에 하나의 hiPSC - 롱 펠렛 또는 hMSC - 롱 펠렛을 수정. </li><li> 펠렛을 H 2 O 중 70 % 에탄올 1 mL에 옮긴다. 펠렛을 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 ( 즉, 25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %, 각 3 분) 1 mL로 탈수시킨다. </li><li> 100 % 자일 렌 1 mL에 넣고 펠릿을 세 번 분쇄한다. 침입자65 ℃ 오븐에서 1 시간 동안 파라핀으로 펠렛을 만든다. 일상적인 조직학 절차 6 다음, 7 X 7 X 5 밀리미터 3 기본 금형과 파라핀 블록에 펠렛을 삽입. </li><li> 약 4 μm 두께의 마이크로톰으로 인접한 섹션을 만듭니다 7 . 유리 슬라이드 위에 섹션을 부착하십시오. </li><li> 슬라이드를 60 ° C에서 2 시간 동안 오븐에서 건조시킵니다. 100 % 크실렌을 사용하여 3 사이클 (각 3 분)으로 섹션을 비 파라핀 화합니다. </li><li> rehydration ( 즉, H 2 O에서 100, 100, 95, 95, 70, 50 및 25 %, 각각 3 분)을 위해 감소하는 알코올 시리즈를 사용하고 5 분 동안 탈 이온수로 최종 헹굼을 수행하십시오. </li><li> 0.1 % alcian blue 시약 또는 1 % toluidine blue 염색으로 4-5 시간 동안 염색 한 후 증류수로 헹구십시오. </li><li> 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 ( 즉, 25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %, 각각 3 분씩)로 3 번 연속해서 탈수하십시오eps of 100 % xylene. 슬라이드를 마운트하고 현미경으로 시각화하십시오. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 검사를 수행하십시오. 참고 : 추가 펠렛 섹션은 면역 조직 화학에 의해 추가로 평가됩니다. <ol><li> 탈 파라핀 및 rehydration 후, 1 밀리미터 EDTA, 산도 8.0 (오토 클레이브로 삶은 물에 방수)에서 종기에 슬라이드를 가져와. 그들이 끓는 온도에서 8 분 동안 앉아서 슬라이드를 RT에서 식히도록하십시오. </li><li> 탈 이온수로 슬라이드를 3 회 헹굽니다. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해 15 분 동안 3 % H에 RT에서 메탄올 2 O 2 용액 섹션을 인큐베이션. </li><li> 탈 이온수로 슬라이드를 헹구고 DPBS에 5 분 동안 담그십시오. 슬라이드의 섹션에 적절하게 희석 한 (1시 50 분) 기본 항체의 50-100 μL를 적용 후 RT에서 습기 챔버에서 1 시간 품어. </li><li> DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​(각각 5 분씩) 씻으십시오. sa를 품어 라.RT에서 15 분 동안 해당 이차 항체 ( 즉, 항 토끼 또는 마우스)와 mple. </li><li> DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​(각각 5 분 동안) 씻으십시오. 현미경으로 DAB 탐지를 수행하십시오. </li><li> DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​씻으십시오 (각각 2 분씩). 1 ~ 2 분 동안 헤 마톡 실린에 슬라이드를 담그어 세포 핵을 대조합니다. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 (25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %; 각 3 분)로 탈수 한 다음 자일 렌으로 3 회 연속 해리합니다. 마지막으로, 슬라이드를 마운트하고 현미경으로 시각화하십시오. </li></ol></li><li> sGAG 콘텐츠를 탐지합니다. <ol><li> 60 ° C에서 2 시간 동안 파파인 용액으로 연골 화 펠렛을 분해하십시오. </li><li> dsDNA 분석 키트 및 형광 계 시스템을 사용하여 DNA 함량을 결정합니다. 525 nm에서 흡광도를 측정하여 DMMB 염료 용액과 혼합하여 sGAG 함량을 측정하십시오 8 . </li><li> 표준 곡선에 대한 sGAG의 농도를 계산하십시오.상어 콘드로이틴 황산염. </li></ol></li><li> hiPSC-Chon pellets에서 연골 분화 마커의 실시간 PCR 분석을 수행하십시오. <ol><li> 하나의 튜브에 500 μL의 얼음 차가운 추출 시약을 첨가하여 동일한 연질 펠렛 중 3-4 개를 수확하십시오. 완전히 소용돌이 치고. RT에서 5 분 샘플을 품어. </li><li> 클로로포름 0.1 mL를 넣는다. 샘플을 15 초 동안 볼 텍싱하고 3 분 동안 실온에서 배양합니다. 12,000 xg 및 4 ° C에서 15 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. 상부 수성 상 (약 250 μL)을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 옮긴다. </li><li> 샘플에 아세트산 나트륨 25 μL와 글리코겐 1 μL를 첨가하십시오. 250 μL의 이소 프로필 알코올과 혼합하여 RNA를 침전시킵니다. 철저히 섞는다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. </li><li> 12,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 완전히 제거하십시오. 75 % 에탄올 500 μL로 RNA 펠렛을 두 번 씻으십시오. </li><li> 5 분간 원심 분리기7,500 xg 및 4 ° C. 모든 남은 에탄올을 제거하고 RNA 펠렛을 5-10 분 동안 공기 건조시킵니다. RNA를 10 μL의 nuclease가없는 물에 녹입니다. </li><li> 역전사 효소 시스템을 사용하여 RNA를 cDNA로 전환하십시오. qPCR 키트 마스터 믹스 (2x)와 실시간 PCR 시스템을 사용하여 cDNA 샘플을 실시간 PCR에 적용하십시오. 9 . 참고 : 프라이머 순서는 다음과 같습니다 : h AGGRECAN -F : TCGAGGACAGCGAGGCC; h AGGRECAN -R : TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; h β-ACTIN -F : TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; h β-ACTIN -R : GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; h COL2- F : TGGACGATCAGGCGAAACC; h COL2 -R : GCTGCGGATGCTCTCAATCT; h SOX9- F : AGCGAACGCACATCAAGAC; h SOX9 -R : CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; h COL10 -F : ATGCTGCCACAAATACCCTTT; h COL10 -R : GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT. </li></ol></li></ol>

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여기, 우리는 iPSCs를 통해 PBCs에서 연골 세포를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. PBC는 임상 분야에서 보편적으로 널리 사용되기 때문에 재 프로그래밍을위한 잠재적 대안으로 제시됩니다. 이 연구에서, episomal vectors (EV)는 Zhang et al.에 의해 확립 된 방법에 따라 PBC를 iPSC로 재 프로그램하기 위해 이용되었다 . 11 . 이러한 통합이없는 접근 방식은 임상 필드 (12), (13)의 폭 넓은 영향을 미칠 것으로 생각됩니다 바이러스 관련 유전 독성을 통합 포함되지 않습니다. 이 연구에서 혈액 세포로부터 무결점 iPSC를 생성하는 재 프로그래밍 효율은 만족 스러웠다. 말초 혈액 2 mL에서 30 개 이상의 iPSC를 생산할 수있었습니다. 따라서 PBC는 연골 조직 및 기타 임상 적용을위한 iPSC를 생성하는 데 ...

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The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

연골 조직은자가 수복 및 재생 능력이 매우 낮습니다. 다양한 외과 적 중재 및 생물학적 치료법이 연골 및 관절 기능을 회복시키는 데 사용되고 있으며 만족스럽지 못한 결과가 있습니다. 최근 줄기 세포 기술의 발달로 전체 연골 치료 분야가 바뀔 수 있습니다 1 . 다양한 줄기 세포가 종자 세포로 연구되었지만 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 거부 반응을 일으키지 않으면 서 여러 유형의 환자 특정 세포를 제공 할 수 있기 때문에 가장 유망한 선택 인 것으로 보인다 2 . 또한, 그들은 성체 세포의 제한된 증식 성을 극복하고 자신의 재생 능력과 만능 능력을 유지할 수 있습니다. 또한, 유전자 표적화는 연골 세포의 특정 유형을 얻기 위해 유전자형을 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 섬유 아세포는 재 프로그래밍 잠재력이 잘 연구 되었기 때문에 iPSC 생성에 널리 사용되었습니다.그러나 환자의 고통스런 생검 및 섬유 아세포의 시험 관내 팽창에 대한 필요성과 같이 유전자 돌연변이를 야기 할 수있는 몇 가지 한계가 아직 극복되어야합니다 3 . 최근, PBC는 리 프로그래밍 4에 유리한 것으로 나타 났으며; 게다가, 그들은 일반적으로 활용되었고 풍부하게 저장되었다. 연구 초점을 피부에서 방향을 바꿀 수도 있습니다. 그러나 우리가 아는 바로는 PBC 재 프로그램과 연골 세포로의 분화에 관한보고는 거의 없습니다. 현재 연구에서 우리는 연골 세포 형성을 모방하기 위해 pellet 배양 시스템을 통해 iPSCs를 연골 세포 계통으로 분화시킨 다음 iPSCs로 분화시켜 PBCs를 대체 소스로 이용한다.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>HiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td> Basal 배지</tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는 보다 정의된 FBS가 없는 배지 보충제</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되며 세포에 탁월한 가치를 제공합니다. 배양</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>세포 성장과 생존력을 증가시키기 위해 모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>세포 배양에 필요한 아미노산</td></tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>hiPSC의 다능성 및 자가 재생을 유지하는 데 사용되는 사이토카인</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>계대배양을 위한 hiPSC 해리에 사용</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>MSC 배양 배지에 사용되는</td></tr><tr><td>기초 배지 0.1% 젤라틴</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>접시에 세포 부착에 사용</td></tr><tr><td>0.25% 트립신/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>세포 해리에 사용</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>세포 세척 또는 시약에 사용되는 균형 잡힌 염 용액으로</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>인비트로겐</td><td>21985023</td><td>모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>그것의</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>인슐린, 트랜스페린, 연골 생성 감별법을 위한 셀레늄 Solution.Used.</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마</td><td>4403</td><td>비타민 C로 알려져 있습니다. 활발한 성장에 도움이 되며 항산화 특성이 있습니다.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>포도당 외에 에너지 원으로 세포 배양 배지에 첨가됩니다.</td></tr><tr><td>변형 성장 인자 - 베타 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>세포 증식, 성장 및 연골 생성 분화를 조절하는 사이토 카인.</td></tr><tr>Collagen II <td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>에 대한 토끼 다클론 항체</td><td>이 항체는 연골 조직에 특이적인 II형 콜라겐과 반응합니다.</td></tr><tr>Collagen X <td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>에 대한 마우스 단클론 항체</td><td>이 항체는 hyperthrophic 연골 세포의 산물인 X형 콜라겐과 반응합니다.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>슬라이드 장착 및 장기 보관용</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>프로테오글리칸 검출에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>글루코사미노글리칸 검출에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>연골 생성 펠릿을 소화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>디메틸메틸렌 블루</td><td>시그마</td><td>341088-1G</td><td>글리코사미노글리안을 정량화하는 데 사용</td></tr><tr><td>상어 연골에서 콘드로이틴 황산염 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>C4384-250MG</td><td>sGAG 함량 측정을 위한 표준 곡선을 그리는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>DNA 함량 측정에 사용</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>세포에서 RNA 분리에 사용</td></tr><tr><td>역전사 효소 시스템</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA를 cDNA,</td></tr><tr><td>SYBR, FAST, QPCR 키트로</td> 변환하는 데 사용, Master Mix <td>Kapa</td><td>KK4601</td>, <td>Real-time PCR에 사용</td></tr></tbody></table>

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

이 연구에서, 우리는 말초 혈액 세포 (PBCs)를 통합 된 방법으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 연골 세포를 생산하는 종자 세포로 사용했다. 배아 체 형성 (EB) 형성 및 섬유 아세포 세포 확장 후, iPSCs는 무 혈청 및 이종없는 조건 하에서 21 일 동안 연골 분화 유도된다. 연골 세포 유도 후 형태 학적, 면역 조직 화학적 분석 및 생화학 적 분석뿐만 아니라 연골 분화 마커의 정량적 실시간 PCR 검사를 통해 세포의 표현형을 평가한다. 연골 형성 펠릿은 알 시스 파랑 및 톨루이딘 블루 염색 양성 반응을 보였다. 콜라겐 II와 X 염색의 면역 조직 화학도 양성이다. 황화 글리코 사 미노 글 라이칸 (sGAG) 함량과 연골 분화 마커 인 콜라겐 2 ( COL2 ), 콜라겐 10 ( COL10 ), SOX9 및 아그로 칸 (AGGRECAN)hiPSCs 및 섬유 아세포와 비교하여 rogenic pellets. 이러한 결과는 PBC가 연골 수복을위한 iPSC를 생성하기위한 종자 세포로 사용될 수 있음을 시사한다.

hiPSCs의 연골 형성 분화 : EB 형성 배지 및 기초 배양 배지를 사용하여 hiPSC를 중간 엽 계통으로 분화시켰다. 다중 단계 배양 방법이 사용되었습니다 ( 그림 1 ). 첫째, hiPSCs는 10 일 동안 EB 형성을 통해 자발적으로 분화되었다 (D10, 도 2A ). 둘째, EBs에서 10 일 (D10 + 10) 동안 더 많은 세포가 빠져 나간다. 이 두 단계 동안, iPSCs는 점차 원래 형태학을 잃어 버렸고 방추형 모양을 얻었고 ( 그림 2B ), 통과 후 섬유 아세포 모양으로 바뀌었다. 셋째, 계대 배양 후 단층에서 세포를 확장시켰다 ( 그림 2C</st...

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 말초혈액 유래 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, IPS 세포)로부터 연골 분화 계통 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 연골 재생 분야의 핵심 질문인 환자 유래 말초혈액 세포를 연골 수복을 위한 IPS 세포 생성용 C 세포로 사용하는 것에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 용이하며, 무혈청 및 무이종 성분(serum and xeno-free) 조건에서 연골세포 분화가 일어난다는 점입니다.먼저 조사된 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast) 피더 세포 단층이 포함된 60 mm 조직 배양 접시에 4 mL의 인간 IPSC 배지를 사용하여 인간 IPS 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 줄기세포의 합류도가 80~90%에 도달하면, 계대 배양을 위해 dispace 용액으로 세포를 해리시킵니다.2~3회 계대 배양 후, 화염 연마된 유리 니들을 사용하여 80~90% 정도 융합된 미분화 iPSC 콜로니를 작은 조각으로 분리하고, 10 mL의 배아체 형성 배지가 담긴 새로운 비부착성 100 mm 페트리 접시에 100개 이하의 세포 배양 조각을 옮깁니다. 기계적 분리는 자동 소화 방식보다 세포 손상을 줄여 새로운 배양 용기로 옮길 작은 세포 조각들을 보호할 수 있으며, 인간 iPS 세포의 분화를 억제하는 피더 세포를 수동으로 제거할 수 있기 때문에 더 바람직합니다. 인간 iPS 세포를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다.이틀 후, 배양 접시를 기울여 배아체(embryoid bodies)를 가라앉히고, 배아체 형성 배지 3 mL를 신선한 기초 배양 배지 4 mL로 조심스럽게 교체합니다. 10일이 지나면 배아체가 형성됩니다. 새로운 100 mm 배양 접시에 0.1% 젤라틴 4 mL를 코팅하여 37 °C에서 30분 동안 둡니다.상층액과 함께 배아체(embryoid bodies)를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기고, 배아체가 가라앉을 때까지 4~5분 동안 둡니다. 마지막 0.5 milliliters의 배지를 제외한 모든 배지를 흡입하여 제거하고, 10 milliliters의 신선한 기초 배양 배지에 배아체를 다시 부유시킵니다. 젤라틴이 굳으면 젤라틴을 폐기합니다.그런 다음 젤라틴이 코팅된 디쉬에 세포를 파종하고, 디쉬를 세포 배양 인큐베이

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

여기, 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 인간 유도 pluripotent 줄기 세포에서 연골 분화에 대한 프로토콜을 제안합니다.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

배우세요 말초 혈액 유래 iPSC에서 연골 세포로 분화하는 방법을. 혈청 및 제노 프리 조건에서 21일간 3D 펠릿 배양으로 환자 특이적 연골 재생을 위한 재현 가능한 프로토콜을 확인하세요.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

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