Name: 설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 학습하세요 재조합 아데노 관련 바이러스 세로타입 9를 이용한 miRNA 전달 방법으로, 쥐의 골격근과 운동신경에 miR-298을 전달하여 척수성 구근근위축증의 신경근육 질환 표현형을 개선하고 병적 AR 전사체 수준을 감소시키는 유전자 치료 전략을 평가합니다.

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저자는 충돌의 관심을 선언합니다. 우리는 AAV9 바이러스 생산을 위한 SignaGen 연구소 (Rockvile, 메릴랜드, 미국) 감사합니다. 이 연구는 NIH NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 필립 R. 리는 사단의 교내 연구의 NICHD에서 기금에 의해 지원 되었다. 카를로 Rinaldi 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 절차 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다 (8 에디션., 국가 아카데미 압박, 개정 2011), NINDS 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. AAV9-미르 디자인 전략 및 미르 선택
<ol><li>MiRWalk 예측 데이터베이스를 사용 하 여 후보 miRNAs는 mRNA 3' UTR 지역 대상 유전자의 상호 작용을 선택. 15 참고: 최소 7 뉴클레오티드를 최소 씨 미르 시퀀스의 길이 제한 합니다. 비교 분석에 대 한 다른 설립된 미르 예측 프로그램 (미 란다, miRDB, Targetscan)를 선택 합니다. 이러한 선택 기준에 따라, 여기, 미르-185, 미르-298, 미르-873, 및 미르-877 선정 되었다 더 평가 위해.</li>
	<li>MiRBase (http://www.mirbase.org/)에서 선택 된 miRNA의 시퀀스를 검색 합니다.</li>
	<li>Pri-미르 복제 (60-70 국세청) 및 cis 적절 한 AAV에 측면에 서는 모두 양쪽 게놈 시퀀스 또는 모의 시퀀스의 250-300 국세청, 벡터. 참고: 측면에 서 순서는 올바른 pri-미르 표현과 성숙한 예측에 관한 처리에 필요 합니다. 예를 들어 선택한 미르 또는 모의 시퀀스, 인간 신장 요인 1 알파 (EIF1α) 발기인의 구성 된 식 카세트 듀얼 모터 rAAV cis 벡터를 선택 하 고 인간의 세포 (CMV) 발기인 cDNA 인코딩 뒤 GFP 형광 태그입니다. EIFα 모터는 안정적이 고 균질 식, 침묵의 최소한의 위험을 보장 하기 때문에 선택 되었다. 조직의 특정 또는 조건부 발기인, 특정 응용 프로그램에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>준비 하 고 정화, AAV, 다음 게시 프로토콜을 적정 하십시오. 16 참고: 여기는 AAV에 pri-미르의 클로닝 벡터와 바이러스 생산 수행 했다 외부 제조 업체에 의해.</li>
</ol>2. 꼬리 정 맥 주입 AAV 미르 플라스 미드의
참고:이 단계는 대상 유전자와 연령과 마우스의 무게 조정을 해야합니다. 복용량 범위, 볼륨, 나이 및 쥐의 체중에 따라 관리의 최적의 경로 결정 하는 기관 및 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침을 사용 합니다. GFP 형광 신호 및 미르 식 수준 대상 조직에 피크 시작 주사 후 2 주 예상 된다. 다음 프로토콜은 초기 성인 기에 남성 쥐를 말합니다. AAV는 Biosafety 수준 1 지침에 따라 생물 학적으로 처리 되어야 합니다.
<ol><li>버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)를 사용 하 여 (vg/mL) 당 1010-1011 바이러스 성 게놈의 바이러스 부하를 포함 하는 100-200 µ L aliquots에서 AAV 미르 플라스 미드 주식 분할. 실험실 생물 학적 개인 보호 장비는 AAV 솔루션을 처리 하기 위해 사용 되어야 한다. 참고: 한 약 수 해 동 되 면 그것은 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안. 바이러스 성 주식-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>적절 한 크기의 플라스틱 필름 플라스틱 또는 테이퍼 튜브 같은 상용 restrainers에 마우스를 제 지.</li>
	<li>70% 알코올 잎사귀와 꼬리의 표면 청소.</li>
	<li>30에 대 한 혈관 확장 증가 꼬리 아래 따뜻한 패드 (28-30 ° C)를 개최 또는 s., (2-3 피트의 거리)에 적 열 램프를 사용 하 여 동물을 따뜻한 또는 따뜻한 물으로 꼬리 찍기.</li>
	<li>
꼬리의 원심 부분에서 삽입 바늘 (27-30 G) 바이러스 약 수와 함께 로드, 정 맥으로, 꼬리에서 15 °, 경사. 주입 하기 전에 바늘이 제대로 삽입 확인 합니다.
	<ol>
<li>주입, 동안 저항을 느꼈다 또는 붓기 피부 아래에 나타납니다, 경우 절차를 중지 합니다. 바늘을 제거 하 고 다시 이전 주사 부 위에 바늘을 삽입. 참고: 또는,이 얻을 수 있습니다 부드럽게 바늘을 발음 하 고 혈액을 관찰 하 여. 하드 포부 꼬리 정 맥을 축소 수 있습니다. 정 맥 주입 하는 동안 blanches, 바늘 올바르게 삽입 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주입 완료 후 바늘을 발생 하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.</li>
	<li>출혈에 대 한 사출 사이트를 관찰 합니다. 출혈이 중지까지 사이트에 두 손가락을 사용 하 여 적당 한 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>그것의 감 금에 있는 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3. 행동 분석 실험
참고: 모든 실험은 맹목적으로 유일 하 게 코딩 된 튜브에 의해 치료의 은폐와 제 3 자에 의해 실시 했다. 치료의 순서를 무작위로 했다. 아래 설명 하는 테스트를 수행할 때 실험 조건 (방의 유형) 및 일의 시간 편차를 줄이기 위해 제어 해야 합니다. 이 테스트는 마우스 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 4 주 이상에서 수행 되어야 합니다. 마우스의 정상적인 성능 기준선을 얻기 위해 나이의 5 주에 바이러스 주입 전에 행동 평가 받았다. 바이러스 주입 후 마우스는 최대 나이 40 주 48 h 주입 후 시작 일주일에 한 번 평가 됐다.
<ol><li>테스트를 시작 하기 전에 잡음 또는 다른 소요 적어도 30 분은 조용 하 고, 어두운 방에 AAV 주사 마우스를 가져와. 순응의이 기간 동안 동물을 방해 하지 마십시오.</li>
	<li>30 분을 위한 새로운 공간에 마우스를 순응 하 고 다음 행동 분석 실험 (3.3 및 3.4 단계)을 시작 합니다. 각 행동 분석 결과 사이 10 분의 간격을 유지 합니다.</li>
	<li>
와이어 테스트를 거 참고:이 테스트 근육 강도 및 모터 역 기능을 모니터링합니다.<ol>
<li>패딩 시트를 사용 하 여 쿠션 역할을. 그것의 꼬리에 의해 마우스를 선택 하 고 와이어 그리드 랙의 중앙에 놓습니다. 랙 표면 위에 15-20 인치를 천천히 조정 화면에 그것의 그립을 동물 수 있도록 화면을 반전.</li>
		<li>랙 완전히 반전 되 면 타이머를 시작 하 고가을 시간 기록. 참고: 마우스 눈금 4 개의 사지와 끊지 것 이다. 와이어는 너무 낮게 설정 되어 쥐 하지 만요 수 있습니다. 쥐 60 전에 그리드에서을 s, 눈금에 다시, 타이머, 리셋 및 2 개의 더 시도까지이 절차를 반복. 최상의 성능을 등록.</li>
		<li>60의 시간 제한 하는 때 s에 도달 하면, 감 금 소 동물 다시 돌아갑니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
발 인쇄 분석 결과 참고: 흡수 성 시트 길고 높은 벽을 5cm 폭 5 c m 좁은 활주로 약 70 cm 이어야 한다.<ol>
<li>한 손으로 마우스를 부드럽게 잡고 고 앞 발을 푸른 잉크 브러시와 뒷 발에 빨간 잉크를 적용 합니다.</li>
		<li>좁은 통로의 바닥에 흡수 성 시트를 놓습니다.</li>
		<li>산책 이나 활주로에 직선에서 흡수 성 시트 한쪽 끝에서 다른 실행 마우스를 수 있습니다.</li>
		<li>신선한 흡수 성 시트를 사용 하 여 마우스와 함께 과정 2 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>앞으로 운동에 두 개의 연속 단계 사이의 거리를 측정 합니다. 먼저 포함 그리고 마지막으로 몇 발자국 어디 동물은 단지 시작 하 고 그것의 실행을 완료 하지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 안락사와 조직 수확
<ol><li>사용 하 여 안락사 챔버 또는 벨 항아리. 벨 항아리를 사용 하는 경우 증기 두건 아래 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>벨 항아리에 배치와 isoflurane와 목화를 담근 다. 동물 마 취 자료와 물리적 접촉에서 유지 하는 물리적 구분 기호를 사용 합니다. 이 단계 후에 즉시 항아리에 동물을 배치 합니다. 참고: 벨 항아리는 미리 hypoxemia는 동물에서의 가능성을 피하기 위해 isoflurane로 기소 해서는 안 됩니다.</li>
	<li>30까지 isoflurane 노출 계속 호흡 중지 후 s.</li>
	<li>항아리에서 마우스를 제거 후 바로 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 참고:이 단계 일어나 야 한다 조직 저하를 피하기 위해 최대한 빨리.</li>
	<li>
척추 코드 처음 수확 한 다음 허벅지 근육 골격 근육.
	<ol>
<li>척수를 수확, 마우스의 뒷면을 노출 하 고 해 부 보드에 4 개의 사지를 수정 합니다.</li>
		<li>70% 에탄올과 해 부의 사이트를 씻어.</li>
		<li>자 궁 경부 전위 날카로운가 위를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
		<li>중간 라인에서 피부에 절 개를 확인 합니다. 절단 또는 피부 및 머리는 펠트를 당겨서 뒤 가로 평면에서의 주의 끊어지고 펠트를 제거 합니다. 양 어깨 아래와 (두개골의 기지에 인접 한 발견) 열 C1-2 지역에서가 위로 절단 하 여 머리를 제거 합니다.<ol>
<li>복 부 측에 복 벽 근육을 잘라내어 옆으로, 척추에 도달할 때까지 한 번에 한 방향으로 계속.</li>
		</ol>
</li>
		<li>자 궁 경부 척수에서 시작 날카로운가 위 제거 척추를 사용 하 여. 양쪽에서 척추 아치에서 절단 하 여 척추의 옆 부분을 제거 합니다.</li>
		<li>전체 척추를 제거 후 척수를 해제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스냅인에서 다음 방법을 사용 하 여 미리 냉장된 2-methylbutane 수확된 조직 고정:
	<ol>
<li>반 2-methylbutane와 스테인리스 그릇을 액체 질소로 채워진 컨테이너에서 그릇의 하단 분기 잠수함.</li>
		<li>중 2-1-2 분에 대 한 액체 질소에 methylbutane 진정.</li>
		<li>흰색 바뀌면 2-methylbutane에 집게와 골격 근육을 놓습니다. 즉시 전송 얼음을 건조 하 고 다음-80 ° c.에 그것을 저장 하는 조직</li>
	</ol>
</li>
	<li>척수 immunostaining에 대 한 설명 된 대로 동결 스냅 전에 실내 온도에 파라핀 블록에 조직을 포함 합니다. 17
</li>
	<li>생 화 확 적인 분석 및 미르 정량화에 대 한1 수확된 조직은 cryovial에 놓고 액체 질소에서 동결 합니다. -80 ° c.에 샘플 저장</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 선택 골격 근육 및 모터 뉴런 쥐에서 바이러스 성 벡터로 rAAV9를 사용 하 여 미르 꼬리 주입을 통해 제공 하 고 접근 방법론을 설명 합니다. 14 다른 RNAi 전략에 비해, miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 있습니다. 18 또한, 그들의 소형 그들 바이러스 성 벡터의 한정 된 포장 용량에 적합 확인 합니다. 2 계산 알고리즘 및 예측 도구 putative 미르 mRNA 표적 식별을 수 있습니다. 일단 확인, 대상 유전자 발현에 미르의 효과 확인 해야 합니다. 일반적인 방법은는 주어진된 미르에 생체 외에서 overexpress 서쪽 분석을 사용 하 여 대상 단백질 식 레벨을 감지 하는 것입니다. 14 , 19
다양 한 연구는 miRNAs 제공 하기 위한 바이러스 성 및 비 바이러스 성 전략을 사용 했습니다. 13 여기 우리가 사용 adeno 관련 바이러스 (AAV) 유전자 납품 공구로. 장기적인 유전자 전송을 허용 다른 바이러스 벡터에 비해, AAV elicits 낮은 immunogenicity 고 분할에 차 있는 굴곡 운동의 광범위 한 스펙트럼 및 비 분열 세포. 18 이 전달 방법 또한 기능 및 RNA 분자의 특이성에 영향을 미칠 수 있는 화학 수정에 대 한 필요를 우회할 수 있습니다. 있다 capsid 단백질의 구성에 의해 주로 결정 된다 AAV의 여러 serotypes. 이러한 serotypes과 그들의 차 있는 굴곡 운동에 다 다른 세포 유형 transduce. 그것은 대상 조직 고려할 때 올바른 serotype를 선택 해야 합니다. 우리는 rAAV9, 중앙 신 경계와 골격 근육 주변 관리19,20다음에 높은 변환 효율성으로 인해을 선택. 이 방법은 신생아 동물 세포 외 기질 성분, 신경 명과 비율 및 성숙 혈액 두뇌 방 벽의 차이로 인해 가능성이 성인 동물에 비해 큰 변환 효능을 보이고 있다. 21 , 22
이 프로토콜에서 중요 한 단계 식 벡터의 디자인입니다. 낮은 표현의 발기인 옆 첫 번째 유전자와 비교 하는 두 번째 유전자에 의해 방해는, bicistronic 벡터에 비해 듀얼 발기인 벡터 수 따라서 miRNA EGFP의 높은 식 저조한 다시 구성 면역 형광 검사 하 여 마우스 조직에는 미르의 지역화를 허용합니다.
AAV9의 정 맥 주입 고효율 및 대상 조직, 골격 근육, 그리고 모터 신경에 균질 성 변환 귀착되는. 주입의이 경로 전신 순환에 도달 하 고 교차 하는 중앙 신 경계를 대상으로 하는 치료를 위한 중요 한 뇌 혈액 장벽 관리 복용량을 수 있습니다. 또한, CNS에 배달에 대 한 비-침략 적 방법입니다. 미르-298 식 나이의 5 주에서 단일 주변 주입으로 2-4 주 후 척수와 근육에 증가 했다. 때 단일 가닥 게놈 AAV 벡터, 두 번째 DNA 가닥의 de novo 종합을 사용 하 여 지연된 변환에 대 한 계정 수 있습니다. 23
인간의 미르-298의 수준 아니었다 치료 쥐에서 감지 단일 관리, 만성 질환에 대 한 여러 주사 치료 혜택을 도달 하는 데 필요한 될 수 있습니다 그 제안 후 20 주. 그러나, 시간이 지남에 미르 저하 평생 반복된 관리 필요한 경우 제한 수 있습니다. 또한, AAV 벡터에 적응 면역 성공적인 유전자 배달에 다른 방 벽을 형성할 수 있다. 24 는 면역학 불활성 AAV 벡터의 따라서 세대 반복 행정과이 유망한 배달 시스템으로 장기 효과 달성에 결정적 이다. 25
치료 전략으로 miRNA의 사용에 제한 대상에서 효과의 위험입니다. MiRNAs는이 방식으로 안전 위험이 다른 유전자 녹취 록과 함께 incomplementary 기본 페어링 통해 상호 작용 수 있습니다. 마이크로 프로세서 복잡 한을 무시 하 고 광범위 한 장기 안전성 및 내성 연구는 중요 한 안전에이 전략을 번역 하기 전에 비 정식 miRNAs, mirtrons, 등의 사용을 포함 하 여 RNAi 시퀀스의 설계 개선 및 효과적인 치료입니다. 26 , 27 , 28
여기 설명 하는 방법을 미르 overexpression를 위해 원래 개발 되었다 그러나 그것은 또한 antagomirs를 사용 하 여 미르 억제 치료에 이용 될 수 있다.

MiRNAs는 비-코딩 RNAs, 21-23 뉴클레오티드 길이, 유전자 발현의 규칙 및 다양 한 셀룰러 및 대사 경로의 제어에 중요 한 역할을. 1 유전자 발현 post-transcriptional 유전자 침묵 또는 mRNA 분해를 유도 의해 주로 통제 된다. 2 MiRNAs는 일반적으로 3' 되지 않은 지역 (UTR) 5' UTR에 바인딩 하지만 유전자, 코딩 및 코딩 mRNA 설명도 대상의 영역을 보완. 3
현재 인간의 질병의 병 인에서 miRNA의 역할 이해 확장, 개별 miRNAs 또는 미르 가족의 약리 변조 가능한 치료 옵션 점점 되고있다. 다른 RNA 억제 전략에 비해, miRNAs는 많은 이점이 있다: miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 및 전달 될 수 쉽게 셀에 그들의 작은 크기 때문에. 4 , 5 , 6 MiRNAs 일반적으로 있고 셀룰러 네트워크 내의 많은 대상 따라서 잠재적인 대상 오프 효과 고려 되어야, 효율적인 배달 대상 조직에 함께 하는 데 필요한 안전 관심사.
신경 근육 학 질병 인수 하거나 근육 및 모터 신경에 영향을 주는 조건을 상속 합니다. 골격 근육에 약물을 대상으로 한 신흥 지역 연구의 주요 과제 치료 창 내에서 광범위 한 배포를 달성 하기 위해입니다. 7 모터 신경은 주로 하기 때문에 마약 사용은 혈액 뇌 장벽에 의해 배제 대상, 더 어렵습니다.
척추과 안구 근육 위축 (SBMA)의 세포 문화와 마우스 모델은이 연구에 사용 되었다. SBMA 있는 근육과 운동 신경 영향을 받는 함수 메커니즘의 독성 증가 의해 발생 하는 신경 근육 학 질병 이다. 8 , 9 SBMA (케네디의 질병; OMIM #313200)는 X 연결 된 질병, 근육의 약점에 의해 특징 및 위축, 아칸소 단백질에 확장된 polyglutamine로 인코딩하는 AR 유전자의 CAG 반복 확장으로 인 한. 10 질병 수정 치료는 현재이 장애에 대 한 합니다. 이 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스 모델이 질병, 성별 특이성, 모터 신경 병리학, 진보적인 근육 위축 등의 기능. 11
이 연구에서 우리의 노력에 초점을 맞춘 한 미르 식별을 직접 downregulates 식 돌연변이 아칸소 transgene의 및 척수에 미르의 배달 및 우리의 질병 마우스 모델의 골격 근육의 안전 하 고 효율적인 모드 설계에.
여기 우리는 비교적 새롭거나 미르, 미르-298 (승인 번호 MIMAT0004901), 직접 SBMA 모델에 돌연변이 아칸소 식을 줄이기 위해12 확인. 대상 조직에 미르-298의 납품을 달성 하기 위하여 우리는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9 (rAAV9)와 함께 바이러스 전략 사용. rAAV9는 혈액 두뇌 방 벽을 교차 하 고 신경 세포를 포함 하 여 분할 되지 않은 셀에 장기 유전자 발현을 중재 수 있습니다. 13 AAV9-미르-298의 단일 조직 행정 결과 미르, 근육 및 모터 신경의 효율적인 변환, 다운-아칸소 식의 규정과 SBMA 쥐에 있는 질병 표현 형의 개량의 지속적인된 표현. 14 미르 또는 antagomirs overexpression에서 vivo에서제공 하는이 방법을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>QIAzol Lysis 시약</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>RNA 분리 전 지방 및 표준 조직의 용해</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>miRNA 및 총 RNA 정제</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4366596</td><td>성숙한 miRNA만 정량화하는 매우 특이적인 키트</td></tr><tr><td>snoRNA202 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1232</td><td>Taqman miRNA control assay in mouse</td></tr><tr><td>miR-298 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2190</td><td>Taqman miRNA-298 assay in mouse</td></tr><tr><td>Anti-GFP anti-GFP anti abcam</td><td></td><td>ab290</td><td>Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade</td></tr><tr><td>Red ink pad</td><td>Dovecraft Essentials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블루 잉크 패드</td><td>Dovecraft Essentials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV9-GFP Vector</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100840</td><td>대규모 AAV 플라스미드 구조, 패키징 및 정제</td></tr><tr><td>mmu-miR-298-5p</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MC12525</td><td>mirVana miRNA 모방</td></tr><tr><td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td><td>Vector Biosystems Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

내 생 미르 통로 통해 RNA 간섭 post-transcriptional 유전자 입을 통해 단백질 합성을 조절 하 여 유전자 발현을 통제 한다. 최근 몇 년 동안, 중재 하는 miRNA 유전자 규칙으로 기능 메커니즘의 독성 이득으로 인 한 신경 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 나타났습니다. 그러나, 대상 조직에 효율적인 배달 응용 프로그램을 제한 했다. 여기 우리 척추과 안구 근육 위축 (SBMA) 유전자 변형 마우스 모델 사용, 신경 근육 학 질병에에서 의해 발생 polyglutamine 확장 androgen 수용 체 (아칸소 주), 유전자 침묵에 의해 테스트 하는 새로 확인 된 아칸소 타겟팅 미르, 미르-298. 우리 overexpressed 미르-298 비 분할 셀의 변환 용이 하 게 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype 9 벡터를 사용 하 여. SBMA 쥐에서 단일 꼬리 정 맥 주입 미르-298 골격 근육에 모터 신경의 지속적이 고 광범위 한 overexpression를 유도 하 고 쥐에서 신경 근육 학 형의 개량 결과.

AAV9-미르-298의 1011 vg의 바이러스 부하 5 주 된 SBMA 쥐로 단일 꼬리 정 맥 주사를 통해 주입 했다. 이러한 마우스 비정상적으로 확장 된 polyglutamine로 ar (AR97Q)와 인간의 아칸소 transgene 고 연령 (체중 감소, 돌출된 다시, 그리고 근육 위축) 10 주 신경 근육 학 질병의 징후를 개발. 11 요 추 척수 및 quadriceps 근육 미르 정량화, 생 화 확 적인 분석 결과 및 immunohistochemistry (그림 1)에 대 한 관리 후 2, 4, 8, 12 주에 수확 했다. 치료 및 후속 분석 관리는 멀게 조사자에 의해 수행 되었습니다.
qRT-PCR 분석 피크 식 레벨 골격 근육에서 및 척수 주사 (그림 2 후에 12 주 8 주에 각각, 골격 근육 및 척수 2 주와 4 주 치료 후에 미르-298 식 보였다 ). 현미경 (Axiovert 100 M)를 사용 하 여, 녹색 형광 신호 했다 척추 모터 신경 및 근육 조직에 의해 감지 GFP의 모터 신경 마커 콜린 acetyltransferase (채팅) 치료, 쥐 쇼 시작 후 10 주 공동 지역화 질병 발현 (그림 2)
동일한 복용량 처방을 사용 하 여, SBMA 마우스의 코 호트 중 미르-298를 받거나 생화학 분석 및 기능 특성에 대 한 꼬리 정 맥 주입을 통해 나이의 7 주에 모의를 무작위로 했다. 주입은 시대의 40 주 주간 체중 및 행동 평가에 선행 되었다. qRT-PCR 분석은 미르-298 치료 (그림 3), 영향을 받는 조직에 돌연변이 AR의 레벨을 감소 체중 증가 및 향상 된 모터 성능 (그림 4) 주사 후 10 주에 시작 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> 그림 1: 연구 디자인의 도식. 미르-298 vivo에서 의 식 수준을 높이려면 우리 GFP 미르-298 및 모의 표현 (A) 이중 발기인 AAV 벡터 플라스 미드와 SBMA 쥐를 주입. (B) 마우스는 연령 (사전 증상 단계)의 7 주에 단일 꼬리 헛된 주사를 통해 주입 했다. 척추 및 quadriceps 근육 조직 분포 분석 (녹색)에 대 한 다른 시간 지점에서 SBMA 마우스의 코 호트에서 수집 되었다. SBMA 마우스의 코 호트 취급 하 고 생 화 확 적인 분석 (빨간색)에 대 한 나이의 16 주에 희생 되었다. 무게와 행동 분석 수행 했다 주간 최대의 기능적 특성 (파란색) 나이 40 주. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> 그림 2: 쥐에 AAV9-미르-298 배달. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 마우스 받았다 AAV9-미르-298-GFP 또는 AAV9-모의-GFP 정 맥 주사를 통해. 총 미르 요 추 척수와 2,4,8 및 주입 후 12 주에 quadriceps 근육에서 수집 되었다. qRT-PCR 식 수준 (A) 미르-298 quadriceps 근육의 추정을 수행한 (n = 5) (B) 요 추 척수 (n = 5, P < 0.01). 모든 데이터는 ± 표준 오차 평균을 수단으로 보고 됩니다. 10 주 치료 (C) quadriceps 근육 (원래 확대, 10 X에에서 GFP에 대 한 얼룩의 지역화에 의해 확인 되었다 후에 수확 하는 조직에서 AAV 벡터의 광범위 한 변환. 눈금 막대 = 100 µ m)과 요 추 척수 (원래 확대, 40 X에에서 (D) 모터 신경. 눈금 막대 = 10 µ m. GFP (녹색), 채팅 (레드)와 DAPI (파란색). 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> 그림 3: 미르-298-식 downregulates 돌연변이 아칸소 척추 및 quadriceps 근육에 쥐에. qRT-PCR 추정 식 (A) 요 추 척수와 AAV9-미르-298-GFP 또는 AAV9-모의-GFP 치료 (B) quadriceps 근육에 아칸소 mRNA의 레벨에 수행 되었다. 대 본 수준 snoRNA202로 표준화 되었다 (n = 치료 당 5). * P < 0.05, * * P < 0.01. 모든 데이터는 ± 표준 오류를 수단으로 보고 됩니다. 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> 그림 4: 미르-298-식 모터 기능 향상과 체중 감소. 행동 평가 일주일에 한 번 (w), 주 5 ~ 40 사이 수행 되었다. 몸 무게 (왼쪽)와 거 쥐의 와이어 (오른쪽) 성능 (n = 그룹 당 15). 모든 데이터는 ± 표준 오류를 수단으로 보고 됩니다. 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

이 방법의 전반적인 목표는 재조합 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터를 사용하여 microRNA를 선택하고 전달하는 것입니다. 이후 이를 마우스의 골격근과 운동 신경세포에 전달하여 질환 표현형을 개선하는 효능을 평가합니다. 이 방법은 microRNA 기반의 유전자 억제 전략이 신경근 질환 치료에 활용될 수 있는지라는 중요한 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 아데노 관련 세로타입 9 바이러스를 사용하여 마우스의 척수와 골격근으로 마이크로RNA를 전신 순환을 통해 전달함으로써 표적 질환 유전자를 직접적으로 억제할 수 있다는 점입니다. AAV-microRNA 플라스미드 스톡을 밀리리터당 10조에서 100조 게놈의 바이러스 부하를 포함하는 100 내지 200 µL 분량으로 분주합니다. 그다음, 분주액 하나를 시린지에 넣고 27 내지 30 gauge 바늘을 장착합니다.이제 표준 마우스 보정기를 사용하여 꼬리가 노출되도록 마우스를 고정합니다. 그런 다음 꼬리를 70% alcohol로 닦아내고, 혈관 확장을 유도하기 위해 꼬리 아래에 약 30초 동안 온열 패드를 댑니다. 이제 꼬리의 원위부에 바늘의 사면이 위로 향하게 하여 약 15도의 낮은 각도로 꼬리 정맥에 삽입합니다.그 다음, 바이러스를 주입하고 바늘을 뽑기 전 몇 초 동안 기다립니다. 바늘을 뽑은 후에는 두 손가락으로 적당한 압력을 가해 출혈을 멈춥니다. 그 후, 동물을 원래의 케이지로 돌려보냅니다.꼬리 정맥 주사 중에 바늘 허브에 혈액이 역류하는 것이 보이는 것은 흔한 일입니다. 주입 시 저항이 느껴지지 않아야 합니다. 만약 꼬리가 창백해지거나 부어오르기 시작하면 바늘을 제거하고 이전 삽입 지점보다 몸 쪽에 가까운 곳에서 다시 시도하십시오.이 테스트를 위해서는 생후 4주 이상의 생쥐를 사용해야 하며, 처치 전 반드시 기초 측정값을 수집하십시오. 테스트실은 소음과 방해가 없는 조용하고 어두운 환경이어야 합니다. 모든 테스트를 수행하기 최소 30분 전에 생쥐를 해당 실내로 옮겨 주십시오.이 순응 기간 동안 동물들을 방해하지 마십시오. 매달리기 와이어 테스트(hanging wire test)부터 시작하십시오. 마우스의 꼬리를 잡아 와이어 그리드 중앙에 놓으십시오.그 다음, 격자를 15~20인치 높이로 올린 후 스크린을 천천히 뒤집어 생쥐가 잡는 위치를 조정할 시간을 줍니다. 격자가 완전히 뒤집히면 타이머를 시작하고 낙하 시간을 기록합니다. 생쥐가 60초 동안 매달려 있도록 하며, 만약 그보다 빨리 떨어진다면 다시 격자에 올려놓고 절차를 반복합니다.마우스가 60초 동안 완전히 매달려 있으면 점수를 60초로 기록하고 마우스를 케이지로 돌려보냅니다. 각 마우스에게 60초를 버틸 수 있도록 세 번의 기회를 줍니다. 그 외의 경우에는 가장 길게 매달려 있었던 시간을 점수로 기록합니다.마우스를 안락사시킨 후 척수를 채취하고, 이어서 대퇴사두근 골격근을 채취하십시오. 채취한 조직을 급속 냉동시키기 위해 스테인리스 스틸 볼의 절반을 2-methylbutane으로 채우고, 볼의 하단 4분의 1 지점을 액체 질소에 담급니다. 다음 단계로 넘어가기 전 2분 동안 기다리십시오.몇 분 후, 샘플을 2-methylbutane으로 옮깁니다. 샘플이 하얗게 변하면 즉시 드라이아이스에 박힌 용기에 옮깁니다. 이후 샘플을 80 °C에서 보관하십시오.생화학적 분석 및 microRNA 정량을 위해, 채취한 조직을 크라이오바이알(cryovial)에 넣고 액체 질소에서 급속 냉동하십시오. 그 후 -80 °C에서 보관하십시오. SBMA 마우스의 5주령에 AAV microR-298 100 trillion genomes를 주입하였습니다.SBMA 마우스는 비정상적으로 확장된 폴리글루타민 트랙을 가진 인간 안드로겐 수용체 트랜스제네를 보유하고 있습니다. 보통 10주가 되면 신경근육 질환의 징후가 나타납니다. 분석을 위해 처리 후 여러 시점에서 요수 척수와 대퇴사두근을 채취하였습니다.정량적 RT-PCR 결과, micro-R298의 발현은 8주 후에 골격근에서 정점에 도달했으며, 12주 후에 척수에서 정점에 도달한 것으로 나타났습니다. 주입 10주 후, 두 조직 모두에서 GFP가 검출되었습니다. 또한 GFP 발현은 운동 신경세포 마커인 choline acetyltransferase와 공존했습니다.후속 실험에서 7주령의 생쥐에게 바이러스 또는 vehicle을 무작위로 주입한 후, 40주령까지 매주 체중을 측정하고 행동 분석을 수행했습니다. 주입 10주 후, 처리군 생쥐들의 체중이 증가하기 시작했으며 운동 성능의 개선이 나타나기 시작했습니다. 정량적 실시간 PCR 분석 결과, 해당 처리가 질환 부위 조직의 AR 전사체 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다.이 영상을 시청하고 나면, 재조합 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터를 이용해 꼬리 정맥 주사로 microRNA를 전달하는 방법과, 전달된 microRNA가 생쥐의 하지 위축 및 근력 약화를 개선하는 효율을 평가하는 데 도움이 되는 행동 분석법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술의 함의는 유전자 치료 접근법으로 확장되는데, 이는 안전하고 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료용 트랜스진(transgene)의 표적 조직 특이적 전달이 필요하기 때문입니다.우리는 SBMA와 같이 독성 기능 획득 기전에 의해 발생하는 질환의 경우, 질환 전사체의 3-프라임 말단을 구체적으로 표적으로 하는 천연 마이크로RNA를 과발현시키면 도움이 될 것이라는 점을 깨달았을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

systemic-delivery-microrna-using-recombinant-adeno-associated-virus

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

이 비디오에서는 새끼 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달을 보여줍니다. 이 방법은 표적 세포의 유전자 발현을 연구하는 데 도움이 됩니다.

재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달: 설치류 모델에서 이식유전자 전달 및 심장 특이적 발현을 위한 기술

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처:Pourshafie, N., et al. 설치류의 신경근 질환을 치료하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 9를 사용한 MicroRNA의 전신 전달. J. Vis. Exp. (2018).이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.

척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

신생아 마우스의 정맥 주사

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

학습하세요 재조합 아데노 관련 바이러스 세로타입 9를 이용한 miRNA 전달 방법으로, 쥐의 골격근과 운동신경에 miR-298을 전달하여 척수성 구근근위축증의 신경근육 질환 표현형을 개선하고 병적 AR 전사체 수준을 감소시키는 유전자 치료 전략을 평가합니다.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

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