설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

이 방법의 전반적인 목표는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터를 사용하여 microRNA를 선택하고 전달하는 것입니다. 그런 다음 생쥐의 골격근 및 운동 뉴런에 전달하고 질병 표현형 개선에 대한 효능을 평가합니다. 이 방법은 신경근 상태를 치료하기 위해 microRNA 기반 침묵 전략을 사용할 수 있는지에 대한 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 아데노 관련 혈청형 9형 바이러스를 사용하여 전신 순환을 통해 microRNA를 마우스의 척추 및 골격근에 전달하여 표적 질병 유전자를 직접 침묵시키는 것입니다. AAV-microRNA 플라스미드 스톡을 밀리리터당 10조 - 100조 게놈의 바이러스 부하를 포함하는 100 - 200 마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 다음으로, 주사기에 부분 표본 1개를 넣고 27-30 게이지 바늘을 부착합니다.

이제 표준 마우스 고정 장치를 사용하여 꼬리가 노출된 마우스를 고정합니다. 그런 다음 70% 알코올로 꼬리를 청소하고 꼬리 아래에 따뜻한 패드를 약 30초 동안 놓아 혈관 확장을 증가시킵니다. 이제 꼬리의 원위 부분에서 경사를 위로 향하게 하고 약 15도의 얕은 각도로 바늘을 꼬리 정맥에 삽입합니다.

그런 다음 바이러스를 주입하고 몇 초 동안 기다렸다가 바늘을 제거합니다. 바늘을 뺀 후 출혈을 멈추기 위해 두 손가락을 사용하여 적당한 압력을 가합니다. 그런 다음 동물을 집 우리로 되돌립니다.

꼬리 정맥 주사를 맞을 때 바늘 허브에서 피가 번쩍이는 것을 보는 것은 드문 일이 아닙니다. 주입하는 동안 저항이 없어야 합니다. 꼬리가 희고 부풀어 오르기 시작하면 바늘을 제거하고 이전 진입 위치 근처에서 다시 시도하십시오.

이러한 테스트의 경우 생쥐는 4주 이상이어야 하며 치료 전에 기준선 측정값을 수집해야 합니다. 시험장은 방해받지 않고 조용하고 어두워야 합니다. 테스트를 수행하기 최소 30분 전에 마우스를 방으로 데려옵니다.

이 순응 기간 동안 동물을 방해하지 마십시오. 행잉 와이어 테스트부터 시작하십시오. 꼬리를 잡고 마우스를 와이어 그리드의 중앙에 놓습니다.

그런 다음 그리드를 15-20인치 올리고 화면을 천천히 반전시켜 마우스가 그립을 조정할 시간을 줍니다. 그리드가 완전히 반전되면 타이머를 시작하고 떨어지는 시간을 기록합니다. 마우스가 더 빨리 떨어지면 60초 동안 기다렸다가 그리드로 되돌리고 절차를 반복합니다.

마우스가 60초 동안 멈춘 경우 점수에 60초를 등록하고 마우스를 케이지로 되돌립니다. 각 마우스가 60초를 세 번 시도할 수 있도록 합니다. 그렇지 않으면 가장 긴 정지 시간을 기록합니다.

쥐를 안락사시킨 후 척수를 적출한 다음 대퇴사두근 골격근을 적출합니다. 수확한 조직을 스냅 동결하려면 스테인리스 스틸 그릇에 2-메틸부탄을 절반으로 채우고 그릇의 아래쪽 4분의 1을 액체 질소에 담그십시오. 계속하기 전에 2분 정도 기다립니다.

몇 분 후, 샘플을 2-메틸부탄으로 옮깁니다. 샘플이 하얗게 변하면 즉시 드라이 아이스에 담긴 용기에 옮깁니다. 나중에 샘플을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

생화학 분석 및 microRNA 정량화를 위해 수확된 조직을 cryovial에 넣고 액체 질소로 동결합니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 보관하십시오. SBMA 마우스는 생후 5주에 AAV microR-298 게놈 100조를 주입했습니다.

SBMA 마우스는 비정상적으로 확장된 폴리글루타민관을 가진 인간 안드로겐 수용체 전이유전자를 가지고 있습니다. 10주가 되면 보통 신경근 질환의 징후가 나타납니다. 요추 척수와 대퇴사두근은 분석을 위해 치료 후 여러 시점에서 적출되었습니다.

정량적 RT-PCR은 micro-R298 발현이 8주 후에 골격근에서 최고조에 달하고 12주에 척수에서 최고조에 달하는 것을 보여주었습니다. 주사 후 10주 후에 GFP가 두 조직 모두에서 검출되었습니다. 및 GFP 발현은 운동 뉴런 마커 콜린 아세틸 전이효소와 공동 국소화되었습니다.

후속 실험에서, 생쥐는 생후 7주가 되면 바이러스 또는 차량을 무작위로 주입한 다음 체중을 측정하고 최대 40주까지 매주 행동을 분석했습니다. 주사 후 10주 후, 치료받은 쥐는 체중이 증가하기 시작했고 향상된 운동 성능을 보여주기 시작했습니다. 정량적 realtime PCR은 이 치료법이 영향을 받은 조직의 AR 전사체 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 꼬리 혈흔 주사를 통해 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터를 사용하여 microRNA를 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 생쥐의 하지 위축 및 약점을 개선하는 데 전달된 microRNA의 효율성을 평가하는 데 도움이 될 수 있는 행동 분석을 수행하는 방법. 안전하고 효과적인 유전자 치료는 치료용 전이유전자의 표적 조직 특이적 전달을 필요로 하기 때문에 이 기술의 의미는 유전자 치료 접근법으로 확장됩니다.

SBMA와 같은 독성 기능 기전으로 인한 질병이 질병 전사체의 3프라임 복구를 특이적으로 표적으로 하는 자연적으로 발생하는 microRNA의 과잉 발현으로 이점을 얻을 수 있다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.