최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

이 기술의 전반적인 목표는 기증자 세포 매개 근형성을 촉진하기 위해 기증자 근육 조직의 작은 부분을 숙주 근육에 이식하는 것입니다. 이 방법은 재생 근육 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 사후 적출된 근육 조직이 숙주 근육에서 기증자 세포 매개 근육 형성을 촉진할 수 있는지. 이 기술의 가장 큰 장점은 최소 침습적이라는 것입니다.

이 기술의 의미는 치명적이지 않은 근이영양증 치료로 확장되는데, 그 이유는 근육 임베딩, 운동 및 면역 요법의 조합이 영향을 받은 특정 근육의 재생 잠재력을 젊어지게 할 수 있기 때문입니다. 물리 치료사이자 생체 의학 엔지니어로서, 저는 MIME 시술이 숙주 근육 구조와 기능을 과도하게 방해하지 않으면서 자연 조직 골격과 함께 근육 세포의 공급원을 제공하기 때문에 최소 침습적 특성이 중요하다고 생각합니다. 그 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 모리움 베감(Morium Begam) 양입니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 12주에서 16주 된 C57 블랙 6 기증자 마우스를 안락사시킵니다. 수술용 가위를 사용하여 뒷다리 앞쪽 표면의 피부를 엽니다. TA 근육을 찾은 후 제거하면 TA 근육 뒤에 위치한 EDL 근육을 시각화할 수 있습니다.

겸자의 끝을 근육 뒤로 밀고 부드럽게 당겨 발가락이 펴지는지 확인하여 근육이 EDL인지 확인합니다. EDL 근육을 확인한 후 약 10cm 길이의 4-0 실크 세그먼트를 사용하여 안내 봉합사를 원위 및 근위 힘줄에 묶습니다. 근육의 근위부와 원위부 힘줄의 봉합사에 두 개의 이중 매듭을 만듭니다.

원위 EDL 힘줄을 자르고 근육을 반사합니다. 그런 다음 근위 힘줄을 잘라 근육을 풀어줍니다. 수집된 EDL 근육을 마우스 링거 용액을 채운 페트리 접시에 넣습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 8주에서 10주 된 수컷 NSG-GFP 숙주 마우스를 마취합니다. 건조를 방지하기 위해 바셀린을 눈에 바르십시오. 피부를 정돈하려면 왼쪽 뒷다리 앞쪽에 제모 크림을 바르고 2분 동안 그대로 둔다.

PBS에 적신 물티슈를 사용하여 털과 함께 제모 크림을 제거합니다. 피부를 청소하려면 포비돈 요오드 용액과 70% 에탄올을 세 번 닦아 번갈아 가며 문지릅니다. 숙주 TA 근육에 바늘관을 만들려면 근육의 긴 축을 따라 근육 중심을 통해 수술용 바늘을 통과시킵니다.

바늘을 두부-꼬리 방향으로, TA 근육의 길이를 따라 근육 배의 중심을 통과하도록 합니다. 바늘 삽입 후 기증자 조직의 한쪽 끝에서 수술 바늘의 내강을 통해 꼬리-두부 방향으로 안내 봉합사를 통과시킵니다. 숙주 근육에서 바늘을 꼬리두부 방향으로 후퇴시켜 기증자 조직이 바늘관을 통해 안내되도록 합니다.

기증자 EDL 근육 조직을 숙주 TA 근육 내에 적절하게 배치하고, 기증자 근육의 꼬리 및 두부 끝에 있는 안내 봉합사를 사용합니다. 기증자 조직을 삽입한 후 안내 봉합사를 절단하고 끝이 미세한 집게로 조정합니다. 마지막으로 집게로 상처 움푹 들어간 곳을 봉합하고 27 게이지 수술 바늘 끝으로 수의학 조직 접착제를 도포하여 근육 조직의 바늘 상처를 봉합합니다.

MIME 후, 50-60마이크로리터의 1.2% 염화바륨을 근육의 길이를 따라 근육 배의 근위부, 중간 및 원위 1/3의 3개 부위에서 숙주 TA 근육에 주입합니다. 주사 후 숙주 마우스의 다리를 에탄올로 청소하고 바셀린을 얇게 펴 피부를 보호하십시오. 마우스를 침구가 없는 독방 회복 케이지에 넣습니다.

등온 젤 가열 패드는 케이지의 절반 아래에 배치하여 호스트 마우스에 열 지원을 제공하는 동시에 마우스가 가열되지 않은 절반으로 이동할 수 있도록 해야 합니다. 복구가 완료되면 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 수술용 가위를 사용하여 다리 앞쪽 표면의 피부를 엽니다.

TA 근육을 찾은 후 원위 힘줄을 자르고 근육을 반사합니다. 근위부 근육 힘줄을 잘라 TA 근육을 풀어줍니다. 왼쪽 또는 치료된 근육과 오른쪽 또는 제어 TA 근육을 모두 수집합니다.

적출된 근육을 계량지와 계량계에 올려 무게를 잰다. 동결 보호를 위해 근육을 미네랄 오일에 잠시 담근 다음 여분의 오일을 닦아내십시오. 근육을 스냅 얼리려면 알루미늄 호일에 놓고 액체 질소로 채워진 이중 플라스크에 빠르게 담그십시오.

냉동 샘플을 라벨링된 극저온 바이알로 옮깁니다. 숙주 근육 내에 기증자 조직을 정확하게 삽입하는 것은 MIME의 성공에 매우 중요합니다. 3일 후, 기증자 EDL 근육은 숙주 근육에 이식된 상태로 남아 있으며 숙주 근육에 바늘 자국이 여전히 보입니다.

또한, 기증자 근육의 단면은 녹색 형광을 나타내지 않습니다. 반면에, 숙주 근육의 단면은 그렇습니다. 이식된 근육의 단면에는 GFP 양성 껍질 근육 섬유와 GFP 음성 기증자 근육 섬유 사이에 명확한 경계가 있습니다.

치료 14일 후, 모든 근육 섬유와 치료되지 않은 근육은 GFP 양성 반응을 보입니다. 그러나 처리된 숙주 근육에는 그렇지 않습니다. 이러한 GFP 음성 섬유의 대부분은 빨간색 desmin 라벨링으로 생존 가능한 것으로 나타났습니다.

이는 MIME이 공여체 세포 유래 근육 형성으로 이어진다는 것을 보여줍니다. TA 근육에는 키메라 근육 섬유가 있습니다. 낮거나 중간 정도의 형광으로 감지되며, 숙주와 공여자 근육 세포의 융합으로 인해 발생할 수 있습니다.

숙주 근육의 전체 직경에 걸친 이들의 존재는 기증자 근인성 세포가 근육 내에서 수백 미크론을 이동할 수 있음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 15분에서 20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기증자 세포 매개 근형성을 촉진하기 위해 MIME 기술을 사용하여 기증자 근육 세그먼트를 숙주 근육에 삽입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

MIME 기술은 사체 인간 근육이 숙주 마우스에서 기증자 세포 매개 근형성을 촉진할 수 있는지 여부를 연구할 수 있는 길을 열어줍니다. 또한 신경근 전기 자극이 기증자 세포 매개 근형성을 향상시킬 수 있는지 평가하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 또한 생체 검사 인간 근육을 숙주 동물에 내장하여 인간 질병의 동물 모델을 생성하고 근육 세포를 포함하는 근육 조직 모방체가 근육 발생을 촉진할 수 있는지 테스트하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.