extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

이 시술의 전반적인 목표는 줄기세포에서 여분의 세포 소포체와 엑소좀을 전달하는 줄기세포를 분리하는 것입니다. 그리고 이러한 나노 입자의 줄기 전달 능력을 평가합니다. 메소는 줄기세포 분야의 날씨에 대한 주요 질문에 답할 수 있으며, 줄기세포는 트랜스 세포 또는 소포에서 파생됩니다.

또는 엑소좀은 줄기세포의 특성을 줄기세포가 아닌 세포로 전달할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도 줄기 세포가 트랜스 세포 소포체에서 파생된다는 것입니다. 그리고 엑소좀은 비줄기세포를 줄기세포로 직접 재프로그래밍하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 우편 연구원 LeMonsier와 수술 조교인 Pei-Ling, Wen-Tin, Shih-Yin이 모두 제 연구실에서 왔습니다. 세포 배양 인큐베이터에서 4일 동안 배양하기 위해 15cm 접시당 배지 12ml에 1점씩 1점을 2배하여 6번째 비부착/중간엽 유방 상피 세포 또는 NAMEC를 파종하는 것으로 시작합니다. 4일차에는 탁상용 중심화를 위해 배양 배지를 수확합니다.

그런 다음 두 번째 테이블 탑 원심분리를 위해 상층액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 상층액을 새로운 울트라 원심분리기로 옮기고 30분 동안 초원심분리를 수행합니다. 스핀이 끝나면 상층액을 새로운 초원심분리기 튜브로 옮기고 상층액을 다시 초원심분리합니다.

상층액을 제거하고 PBS에서 세포외 소포 엑소좀 구개를 다시 현탁시켜 세 번째 초원심분리를 진행합니다. 그런 다음 새로운 PBS에 입천장을 다시 현탁시키고 세포 입자를 마지막으로 한 번 초원심분리합니다. 상층액을 제거하고 여분의 세포 소포 엑소좀 구개를 100마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 bicinchoninic acid assay로 extra cellular vesicle suspension의 단백질 농도를 측정합니다. 농도는 100 마이크로 리터 당 약 20-40 마이크로 그램이어야합니다. 여분의 세포 소포체와 엑소좀의 농도와 크기를 측정하려면 세포 입자를 PBS 100밀리리터당 단백질 2마이크로그램으로 희석합니다.

그리고 나노 입자 추적 분석으로 입자를 분석합니다. 밀도 구배(density gradient)로 엑소좀을 정제하려면 세 번째 초원심분리 후 PBS에 40% 요오딕산올을 2ml 농도로 주입하여 입천장을 재현탁합니다. 그리고 세포 현탁액에 30%, 20%, 10% 및 5%의 순차적인 2밀리리터 부피의 요오딕산올을 오버레이합니다.

피펫을 사용하여 밀도 구배 초원심분리로 세포 분획을 분리하여 원심분리 종료 시 10개의 구배 층 각각을 수확합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 SDS 페이지와 웨스턴 블롯을 통해 각 분획에서 엑소좀 마커의 존재 여부를 분석합니다. 적절한 관심 엑소좀 마커에 대한 항체 사용.

여분의 세포 소포와 엑소좀을 가진 유방 상피 세포를 먼저 치료하기 위해, 젤라틴이 코팅된 6개의 웰 플레이트에 플레이트당 5번째 플로우 정렬 epcam hi-CD 49F 저광강 유방 상피 세포에 2회 텐트를 파종합니다. 그런 다음 각 세포 배양물을 NAMEC 유래 추가 세포 소포체 및 엑솜의 밀리리터당 2마이크로그램으로 처리합니다. 배양된 배지를 10일 동안 이틀에 한 번씩 새로운 여분의 세포 소포체와 엑소좀으로 교체합니다.

치료 기간이 끝나면 마취된 3주 된 암컷 57 BL6 마우스를 누운 자세로 놓고 복부 중앙의 털을 제거합니다. 70% 알코올과 포보돈 요오드를 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다. 그리고 복부 흉부 서혜부 부위를 따라 피부를 통해 1점 5cm 수직 절개를 만듭니다.

오른쪽과 왼쪽 네 번째 유방 뚱뚱한 패드를 번갈아 노출시킵니다. 각 지방 패드에서 림프절을 찾아 림프절 아래의 전체 분비샘 페랑카마를 제거합니다. 다음으로, prodialitic 및 cologenalitic 활성을 가진 천연 효소를 사용하여 여분의 세포 방광 및 외부 처리된 내강 유방 상피 세포를 분리합니다.

10 분 후에 PBS에 있는 5% FBS와 더불어 효소 활동을, 중화. 원심분리로 세포를 모으고 상층부를 버립니다. 계산 후에, PBS 농도의 15 마이크로리터당 세포를 1 곱하기 10에서 두번째 곱하기 10에서 4 세포에 묽게 하십시오.

그리고 27게이지 바늘이 장착된 100리터 마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 각 지방 패드에 15마이크로리터의 유방 상피 세포 현탁액을 주입합니다. 그런 다음 상처 클립으로 피부를 닫습니다. 주사 후 8주 후, 흉부 부위에서 서혜부 부위까지 피부를 수직으로 절개하고 좌우 제4 유방 지방 패드를 모두 노출시킵니다.

네 번째 유방 귀두를 제거하고 지방 패드를 개별 유리 현미경 슬라이드에 펴 바릅니다. 그런 다음 슬라이드를 화학 후드로 옮기고 실온에서 밤새 콜리 고정제로 패드를 고정합니다. 다음 날 아침, 70% 에탄올 250ml로 샘플을 15분 동안 세척합니다.

그런 다음 증류수 250ml를 5분 동안 붓습니다. 증류수 세척 후 실온에서 밤새 카민 명반으로 지방 패드를 염색합니다. 그 후 15분 동안 에탄올 배양에서 탈수가 발생합니다.

마지막 탈수 후 지방 패드가 투명해질 때까지 샘플을 화학 후드의 자일렌으로 옮깁니다. 그런 다음 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 뚱뚱한 패드를 인치당 2, 400도트로 이미지화합니다. 분리된 소포와 초원심분리기 구개개의 크기는 일반적으로 나노 입자 추적 분석으로 측정한 바와 같이 약 100나노미터입니다.

또한, NAMEC 컨디셔닝 배지의 초원심분리기 분획에 대한 투과 전자 현미경 분석은 풍부한 막 소포의 존재를 보여줍니다. 방금 설명한 바와 같이 밀도 구배 분리 후 엑소좀 마커는 20% 요오딕손 분획에서 검출될 수 있습니다. CFSE가 표지된 namic 유래, 여분의 세포 소포체 및 엑솜과 거래된 인간 내강 유방 상피 세포의 유동 측 emetric 분석은 엑소좀 처리된 배양액에서 10배 더 높은 CFSE 신호를 보여줍니다.

유방 상피 세포에 의한 CFSE 표지된 여분의 세포 소포 및 엑소좀의 특정 흡수를 나타냅니다. 또한, 음성 대조군, PBS 처리된 유방 상피 세포는 CFSE singnal을 나타내지 않지만, 엑소좀 처리된 세포에 의한 namic 유래 extra cellular vesical 및 exosome 흡수의 증거도 컨포칼 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 특히, 10일 동안 NAMEC 유래 추가 세포 소포체와 엑소좀으로 처리된 유방 상피 세포를 유선으로 분류한 epCAMhi/CD49Flo 유방 상피 세포를 주입한 마우스의 뚱뚱한 패드는 유선을 형성하는 능력을 획득했습니다.

개발 후 이 기술은 줄기세포 생물학 분야의 연구원을 위한 길을 열었습니다. 줄기 세포 유래 트랜스 세포와 소포 및 엑소좀의 사용을 재생 의학 및 직접 세포 재프로그래밍에서 탐구합니다.