Name: extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 유방 기초 상피 세포에서 세포외 소포체와 엑소좀을 분리하여 유방 루미널 세포에 유선 형성 능력을 이전하는 방법을. 이 기법은 줄기세포 재프로그래밍 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건 연구원 (05A1-CSPP16-014, HJL)과 과학 기술부 (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL)의 연구비 지원에 의해 뒷받침되었다.

동물과 관련된 모든 연구는 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care Committee)가 승인 한 의정서를 준수했습니다. 1. 세포 외 소포 / 엑소 좀 격리 및 검증 <ol><li> 문화 유방 상피 기저 세포, NAMECs, 500 mL의 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 중탄산 나트륨 (0.2438 %)을 함유 한 DMEM / F12로 제조 된 신선한 무 혈청 배지; EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 소 뇌하수체 추출물 (BPE; 35㎍ / mL); 및 GW627368X (1 μg / mL)를 15 cm 접시에 넣었다. </li><li> hemocytometer로 세포를 계산 후 4 일 동안 0 일째에 15cm dish 당 12mL의 배지에 1.2x10 6 세포를 사육한다. </li><li> 배양 4 일 후 탁상용 원심 분리기를 사용하여 300 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 원추형 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다. </li><li> 상등액을 원심 분리한다.탁상용 원심 분리기에서 2,000 xg에서 20 분간. 뜨는 원심 분리기 튜브에 뜨는를 전송하고 죽은 세포와 세포 잔해를 남겨주세요 ( 그림 1 ). </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 상등액을 새로운 초 원심 분리기 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다. </li><li> 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거하고 PBS ( 그림 1 )에서 EV / exosome 펠렛을 resuspend. </li><li> 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거합니다. PBS에 EV / exosome 펠렛을 Resuspend ( 그림 1 ). 100 μL에서 NAMEC - 조건 매체 240-480 ML에서 격리 된 펠렛을 Resuspend. </li><li> BCA 단백질 분석으로 EV 현탁액의 단백질 농도를 측정하십시오. 농도가 20-40 μg / 100 μL 정도인지 확인하십시오. -20 ℃에서 보관추가 분석. </li><li> 이전에 Gardiner 등이 설명한 것처럼 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 통해 EVs / exosomes의 농도와 크기를 측정하십시오 . 11 . NTA 분석을 위해 PBS로 EVs / exosomes (20 μg / 100 μL)를 10,000 배로 희석합니다. 참고 : NTA 분석의 결과는 분석 된 소포의 수와 크기를 반영합니다. </li><li> 린 (Lin) 등 4 에 의해 이전에 기술 된 바와 같이, 투과 전자 현미경 (TEM)으로 EVs / 엑소 좀을 이미지화한다. </li></ol> 2. 밀도 구배를 이용한 Exosome 정제 <ol><li> PBS (2 mL) 중 40 % (w / v) iodixanol에서 1.7 단계의 110,000 g 펠렛을 재현 탁한다. Ultracentrifuge 튜브에 밀도 기울기를 형성하기 위해 PBS (각각 2 mL)에 30 %, 20 %, 10 % 및 5 % (w / v) iodixanol의 분량으로 혼합물을 중첩하십시오. </li><li> 4 ° C에서 8 시간 동안 200,000 xg에서 혼합물을 원심 분리하십시오. </li><li> 각 그래디언트 분율 (10도 프랙털ons; 1 mL / 분획)을 피펫으로 튜브의 꼭대기에서 꺼냈다. </li><li> SDS-PAGE 12 및 Western blot으로 각 분획에서 exosome marker ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)의 존재를 분석합니다. 0.1 % (w / v) SDS를 포함하는 10 % 겔에 각 분획의 50 μL 현탁액을 적재하고 겔 전기 영동으로 분획으로 단백질을 분리한다. </li><li> 단백질을 겔에서 PVDF 막으로 옮기고 exosome 마커 ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)에 대한 항체와 멤브레인을 4 ℃에서 하룻밤 동안 보관하십시오 (재료 표 ). 참고 : 결과는 exosomes를 포함하는 분획을 식별합니다. </li></ol> 3. 세포 외 소포 / 엑소 좀 표지 <ol><li> 엑소 솜 단백질 20 μg / 100 μL에서 10 μM carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester (CFSE)에 1.7 단계에서 얻은 EVs / exosomes를 정지시킨다. 병렬 샘플 공동 작성동일한 방식으로 처리 된 CFSE 및 PBS만이 나중에 EV / 엑소 좀 섭취 검정에 대한 음성 대조군으로 사용된다. 30 분 동안 37 ° C에서 혼합물을 둡니다. </li><li> EV 50 분의 PBS에서 EVs / exosomes를 일시 중지하고 4에서 60 분 동안 110,000 xg에서 현탁액을 원심 분리하십시오 ° C. 뜨는를 제거하고 PBS에 EV / exosome 펠렛을 resuspend. 한 번 단계 3.2를 반복하십시오. </li><li> exosomal 단백질 / 100 μL 20 μg의 농도에서 PBS에 EVs / exosomes을 일시 중지하고 세포에 EVs / exosomes를 추가하기 전에 0.22 μm의 세포막을 통해 EVs / exosomes를 필터링합니다. </li></ol> 4. 세포 외 소포 / 엑소 좀 흡수 분석법 <ol><li> 배양 배지를 만들기 위해 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 DMEM / F12를 중탄산 나트륨 (0.2438 %)과 혼합한다. EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 및 BPE (35 μg / mL) 4 . 6 잘 접시에 인간 mammary 상피 HMLE 세포를 플레이트 (1 × 10 6 &lt;/ sup&gt; 세포 / 웰) EV / 엑소 좀 처리 하루 전에. 2-6 H 조 HMLE 세포의 문화 매체에 단계 3.3에서 얻은 2 μg / ML CFSE 형광 라벨 EVS / exosome을 추가합니다. 단계 3.1에서 설명한 병렬 준비와 함께 부정적인 제어 그룹의 HMLE 세포를 처리합니다. </li><li> 2-6 시간 배양 후 실온에서 PBS 4 mL로 세포를 두 번 씻어 낸다. </li><li> 10 분 0.25 % 트립신으로 세포를 분리하고 0.2 % FBS를 포함하는 PBS에 세포를 다시 일시 중지합니다. 형광 셀 분석기 4 를 사용하여 세포의 형광 강도에서 EV / exosome 이해를 측정합니다. 공 촛점 현미경을 사용하여 EVs / exosomes 또는 부정적인 컨트롤로 치료 세포를 이미지. 참고 : 세포의 녹색 형광은 EV / exosome 섭취로 인해 발생합니다. 현미경 설정에 대해서는 그림 6 의 범례를 참조하십시오. </li></ol> 5. 일차 마우스 유방 상피 세포의 분리 <ol><li&gt; 10cm 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 12ml를 넣어 젤라틴 코팅 요리를 준비하십시오. 30 분 동안 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다. 젤라틴 코팅이 건조 될 때까지 젤라틴 용액을 제거하고 4 시간 동안 층류 후드에서 뚜껑을 접시에서 내려 놓습니다. </li><li> 가위를 사용하여 12 주 된 처녀 암컷 C57BL / 6 마우스에서 2, 3, 4, 5 번 유방 땀샘 ( 그림 2 )을 해부하고 면도기를 사용하여 작은 조각 (2mm 2 )으로 땀샘을 자릅니다. </li><li> 추가로 0.2 % 콜라게나 제 타입 IV, 0.2 % 트립신, 5 % FBS, 5 μg / ML gentamycin을 포함하는 DMEM / F12 50 ML와 37 ° C, 120 rpm의 교반에서 60 분 (10 생쥐) 유방 땀샘의 해리 , 1x pen-strep. </li><li> 10 분 동안 350 XG에서 원심 분리하여 혼합물에서 상피 organoids를 펠렛. </li><li> 상온에서 5 분 동안 0.1 MG / ML DNase I와 DMEM / F12의 4 ML에 상피 organoids를 중단. 최종 6 ML의 DMEM / F12를 추가10 mL의 부피. </li><li> 현탁액을 실온에서 10 분 동안 400 xg에서 원심 분리하고 상등액을 버린다. </li><li> 10 ML의 DMEM / F12에 펠렛을 Resuspend. 서스펜션을 원심 분리하지만 속도가 400 x g에 도달하면 브레이크를 맞 춥니 다. 뜨는 물을 버린다. 참고 : 브레이크를 치면, 상피 organoids 신속하게 pelleted, fibroblasts, 하나의 세포로, 여전히 뜨는에 머물러 있습니다. </li><li> 5.6 단계와 5.7 단계를 5-7 회 반복하십시오. hemocytometer에 정지 현탁액을 추가하고 원심 분리 ( 그림 3 ) 각 라운드 후 현미경하에 organoid 혼합물에서 fibroblasts의 정리를 확인하십시오. </li><li> 1x ITS, 5 % FBS, 50㎍ / mL gentamycin, 10ng / mL EGF 및 1x 펜 - 스트렙토닌을 함유하는 DMEM / F12로 단계 5.1에서 얻은 젤라틴 코팅 된 접시에 유기체를 플레이트한다. </li><li> 48 시간 후, FBS없이 새로운 배지로 배지를 교체하여 배양 물에서 부유 세포를 제거한다1 x ITS, 50 μg / mL gentamycin, 10 ng / mL EGF 및 1x pen-strep를 함유하는 DMEM / F12). </li><li> 유방 상피 세포의 단일 층이 3 일 안에 부착 된 상피 기관 종에서 이동 및 성장한다는 것을 확인하십시오. </li></ol> 6. 일차 마우스 기초 / Luminal 유방 상피 세포의 분리 <ol><li> 3 일 배양 후, 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 활성을 갖는 천연 효소 혼합물을 마우스 기본 유방 세포에서 20 분 동안 분리한다. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오. </li><li> 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. 20 분 동안 5 MG / ML dispase에 세포 펠렛을 Resuspend. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오. </li><li> 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. </li><li> 희석과 10 7 세포 / ML의 농도 0.2 % FBS와 100 μL PBS에 세포를 다시 정지항 -CD49f 및 항 -EpCAM 항체를 얼음에서 1 시간 동안 어둠 속에서 처리 하였다. </li><li> PBS로 세포를 씻어 낸 다음 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에 형광 물질이 결합 된 2 차 항체로 세포를 부화시킵니다. </li><li> 0.2 % FBS로 PBS에서 세포를 세척하고 재현 탁한다. </li><li> EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포를 세포 분류기 4로 분류하십시오. </li></ol> 7. 세포 외 소포 / 엑소 좀 처리 <ol><li> 젤라틴 코팅 6 잘 요리 (2 X 10 5 세포 / 음)에 단계 6.7에서 정렬 EpCAM 안녕 / CD49f lo luminal mammary 상피 세포 씨앗 후 PBS 또는 2 μg / ML NAMEC 파생 EVs / exosomes로 그들을 치료 1.7 단계에서 얻은 </li><li> 장기간의 배양 처리에서 EV / 엑소 좀의 생물학적 효능을 보장하기 위해 PBS 또는 2 μg / mL NAMEC 파생 EVs / 엑소 좀을 함유하는 새로운 배지로 세포 배양 배지를 교체하십시오. 마우스 prima를 분할하지 마라.10 일간의 치료 중 luminal cell을 관찰 하였다. </li></ol> 유방 상피 세포의 지방 패드 주입 <ol><li> 3 주된 여성 C57BL / 6 마우스를 isofluorane 2-3 % 흡입제로 마취하십시오. </li><li> 마취 된 마우스를 뒤쪽에 놓습니다. 중년 복부 면도기 / 모발 크림을 사용하여 모피를 제거하고 70 % 알콜 및 포비돈 요오드 3 회 교대로 수술 부위를 닦으십시오. </li><li> 가위로 복부 흉부 - 사타구니 부위를 따라 피부를 통해 1.5 cm 수직 절개를하고 오른쪽 및 왼쪽 4 번째 유방 지방 패드를 교대로 노출시킵니다. </li><li> 유선 실질을 가위로 제거하여 지방 패드를 모두 지 웁니다. 지방 패드에서 림프절을 찾은 다음 림프절 아래의 전체 샘 실질을 제거하십시오. 참고 : 지방 패드의 3 분의 2는 그대로 두어야합니다. </li><li> 단계 7.2에서 얻은 세포를 천연 효소 혼합물 ( 물질 표 참조)로 단백질 분해성 a콜라겐 분해 효소 활성 10 분. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오. </li><li> 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. hemocytometer로 세포를 세고 15 μL에 원하는 세포 복용량 (10 4 -10 2 세포 / 패드)이 포함 된 농도의 PBS에 세포를 정지시킵니다. </li><li> 27G 바늘에 부착 된 100 μL 유리 주사기를 사용하여 지방 패드에 유방 상피 세포 현탁액의 15 μL를 주입. </li><li> 다른 쪽의 지방 패드에 대해 8.4-8.7 단계를 반복하십시오. </li><li> 상처 클립으로 피부를 닫으십시오. </li></ol> 9. 유선 전체 마운트 <ol><li> 세포 주입 후 8 주째에 이산화탄소와 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사하십시오 (단계 8.7). </li><li> 가위를 사용하여 흉부 영역에서 사타구니 영역으로 피부 레이어를 통해 수직 절개를 만들고 오른쪽과 왼쪽 모두를 노출 4 분ammary 지방 패드. 네 번째 유방 땀샘을 제거하십시오 ( 그림 2 ). </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 지방 패드를 퍼지하고 하룻밤 실온에서 Kahle의 고정액 (4 % 포름 알데히드, 30 % EtOH 및 2 % 빙초산)로 지방 패드를 고정합니다. 주의 : Kahle의 정착액은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오. </li><li> 지방 패드를 50 분간 70 % EtOH 250 mL에 넣고 15 분 동안 씻은 다음 5 분 동안 250 mL의 dH 2 O에서 씻으십시오. 살찐 명반을 실온에서 하룻밤 동안 밤새 카민의 명반 (카민 1g과 황산 칼륨 2.5g을 dH 2 O 500mL에 넣음)으로 염색합니다. </li><li> 지방 패드를 15 분 동안 250 mL의 70 % EtOH, 15 분 동안 95 % EtOH 250 mL 및 15 분 동안 100 % EtOH 250 mL로 씻으십시오. </li><li> 뚱뚱한 패드가 투명하게 될 때 일 동안 자일 렌에있는 뚱뚱한 패드를 청소하고 자일 렌 부화를 멈추십시오. 주의 : 크실렌은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오. </li><li> 슬라이드 마운트하기디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 지방 패드의 이미지 (2,400 dpi)를 촬영합니다. </li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

엑소 좀은 종종 그것들을 방출 한 세포의 특성을 가지고 있으며 방출 된 엑소 좀의 양은 자극 4 에 의해 유도 될 수있다. 세포의 배양 배지를 수집하여 EV / exosome 수집을위한 차동 초 원심 분리 (differential centrifuge)에 적용 할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 현재 EVs / exosomes를 분리하는 이상적인 방법에 대한 일반적인 합의는 없다. 여기에서 사용 된 최적의 방법은 다운 스트림 어플리케이션 (14) 에 의해 결정된다. 초 원심 분리는 EVs / exosomes의 생물학적 활성을 보존 할 수있는 EVs / exosomes의 분리를위한 상대적으로 빠른 방법입니다. 그러나, 초 원심 분리에 의해 분리 된 소포는 일반적으로 엔도 솜 구획을 통해 생성 된 엑소 좀 및 / 또는 세포막으로부터 새싹을 통해 생성 된 소포를 함유하는 EVs의 혼합물을 함유한다....

Exosomes는 막과 세포질 단백질, 지질 및 RNA를 세포간에 전달하여 세포 간 통신을 매개 할 수 있습니다 1 . Exosome-mediated communication은 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정 ( 즉, 항원 제시, 내성 2 의 발달 및 종양 진행 3 )에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 엑소 좀은 종종 그것들을 방출하는 원천 세포와 비슷한 내용을 가지고있다. 따라서, exosomes은 소스 세포에서 특정 세포 속성을 수행하고 4 그들을 섭취 세포 에이 특성을 전송할 수 있습니다. Exosomes는 50 ~ 150 nm의 이중층 멤브레인 베 시클이며 특정 마커 ( 예 : CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101)를 나타냅니다. 따라서, 엑소 좀은 다양한 측면에 대한 다양한 방법으로 특징 지어 져야한다. 투과 전자 현미경으로 막 소포를 시각화 할 수 있습니다.엑소 좀 4 , 5 와 같은 나노 입자 추적 분석 (NTA)과 동적 광산란 분석 (DLS)은 정제 된 엑소 좀의 크기와 수를 측정하는 데 사용됩니다 4 . 엑소 좀의 지질막 함량은 밀도 구배로 확인할 수 있습니다. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101 6 , 7 같은 엑소 좀 마커는 웨스턴 블 랏팅으로 측정 할 수 있습니다. 유방 기저 세포는 유방 패드에 이식 될 때 유선을 생성 할 수있는 능력이 있지만 luminal 세포는 8 , 9 , 10 일 수 없습니다. 따라서, 유방 기초 세포는 유방 재 분산 단위라고도합니다. 유방 기저 세포 및 내강 세포의 모델을 사용하여 EVs / 엑소 좀이 다른 세포 집단간에 세포 특성을 전달하는 능력을 검사 할 수 있습니다. 이 일유방 기초 상피 세포에서 유래 한 EVs / exosomes를 이용하여 유방 기초 상피 세포에서 유방 내피 세포로 유선 형성능을 전달하는 방법을 보여줍니다. 근위 유방 상피 세포는 기저 세포에서 분비 된 EV / 엑소 좀을 섭취 한 후 기저 세포 특성을 획득하고 유방 땀 샘을 형성 할 수 있습니다 4 .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K 초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti 로터</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 로터</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>나노사이트 LM10</td><td>나노 입자 추적 분석(NTA)</td></tr><tr><td>옵티프렙&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>물에 담긴 요오드딕산올 60%(w/v) 용액(멸균).</td></tr><tr><td>CD81 항체</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg; C, 하룻밤&nbsp;</td></tr><tr><td>CD9 항체</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg; C, 하룻밤&nbsp;</td></tr><tr><td>CD63 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg; C, 하룻밤&nbsp;</td></tr><tr><td>TSG101 항체</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg; C, 하룻밤&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6,000 in 5% w/v 무지방 분유, 1x TBS, 0.1% 트윈 20 at 4 &deg; C, 하룻밤&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (카르복시플루오레세인 숙시니미딜 디아세테이트 에스테르)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>형광 세포 분석기</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV형;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>은 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스퍼린, 그리고 나트륨 셀레나이트</td></tr><tr><td>아큐타제의</td> 혼합물입니다. <td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>은 프로테올릴리틱 및 콜라겐 분해 효소 활성이 분산된 천연 효소 혼합물</td></tr><tr><td>입니다.</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>anti-CD49f 항체</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti-EpCAM 항체</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>cell sorter</td></tr><tr><td>carmine alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)</td><td></td><td></td><td>로버트 와인버그 박사의 선물</td></tr><tr><td>permount</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (소 뇌하수체 추출물)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-뉴질랜드</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>케이맨</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15cm 문화 접시</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>원심분리기 3415R</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>10cm 배양 접시</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>6-웰 배양 접시</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>암컷 C57BL/6 마우스</td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>펜/스트렙</td><td>코닝</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>이소플루오란&nbsp;</td><td>할로카본</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>마크론</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (에탄올)</td><td>J.T. 베이커</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 칼륨 황산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&nbsp;</td><td>라이카</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 멤브레인</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP 상처 클립, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP 상처 클립 Applier</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; 딥 레드</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>C10046</td><td>원형질막 염색</td></tr></tbody></table>

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

세포는 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 ~ 100-nm 세포 외 소포 (EVs) 인 엑소 좀을 통해 전달할 수 있습니다. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) 유래 세포 외 소포는 차별적 인 초 원심 분리를 통해 NAMEC 배지에서 분리 할 수 ​​있습니다. 밀도에 따라 EV는 110,000 x g에서 초 원심 분리를 통해 정제 할 수 있습니다. 초 원심 분리로 얻은 EV 준비물은 가용성 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 연속 밀도 구배를 사용하여 더욱 분리 할 수 ​​있습니다. 그런 다음 정화 된 EVs는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 추가로 평가할 수 있으며, 이는 준비 과정에서 소포의 크기와 수를 측정합니다. 50 내지 150 nm 범위의 세포 외 소포가 엑소 좀이다. NAMEC에서 추출한 EVs / exosomes는 유선 상피 세포에서 섭취 할 수 있는데, 이는 유동 세포 계측법과 공 촛점 현미경으로 측정 할 수 있습니다. 일부 유방 줄기 세포 특성 ( 예 : 유선 형성 능력)은줄기 모양의 NAMEC에서 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀을 통해 유방 상피 세포로 전달 될 수있다. 격리 된 일차 성 EpCAM hi / CD49f lo 내시경 상피 ​​세포는 마우스 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 형성 할 수 없으며, EpCAM lo / CD49f hi 기저 유방 상피 세포는 이식 후 유방 땀샘을 형성합니다. EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포에 의한 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀의 섭취는 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 생성하게한다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은 유방 내 형성 능력을 EpCAM hi / CD49f lo 내강 유방 상피 세포로 전달한다.

PGE 2 / EP 4 신호 전달을 막음으로써 유방 기초 형 줄기 세포 4 에서 EV / 엑소 좀 방출을 유발한다는 것이 보여지기 때문에,이 연구는 유방 상피 기저 세포 (NAMEC) 배양으로부터 유도 된 EVs / 엑소 좀을 분리하는 방법을 제시한다. NAMEC은 혈청이없는 배지에서 배양되기 때문에 혈청에서 유래 된 EV / 엑소 좀은 존재하지 않는다. 혈청 함유 배지에서 배양 된 세포의 경우, 배지의 선재 exosomes는 EVs / exosomes 5 의 수집을위한 소스 세포를 배양하기 위해 배지가 사용되기 전에 110,000 xg에서 초 원심 분리에 의해 미리 세척되어야합니다. 4 일 유도 된 NAMEC 조건화 배지의 EVs / 엑소 좀은 그림 1 에서와 같이 차동 초 원심 분리에 의해...

이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

본 절차의 전반적인 목표는 줄기세포로부터 줄기세포능(stemness)을 전달하는 세포 외 소포체와 엑소좀을 분리하는 것입니다. 또한, 이러한 나노 입자들의 줄기세포능 전달 능력을 평가하는 것입니다. 이는 줄기세포 유래 물질이 세포 간 전달을 통해 이동하는지 아니면 소포체를 통해 이동하는지에 관한 줄기세포 분야의 핵심 질문에 답을 제공할 수 있습니다.또는 엑소좀이 줄기세포의 특성을 비줄기세포로 전달할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유도된 줄기세포가 세포 간 소포체에서 유래한다는 점입니다. 또한, 엑소좀은 비줄기세포를 줄기세포로 직접 리프로그래밍하는 데 사용될 수 있습니다.본 절차는 저의 실험실 소속인 postdoc 연구원 LeMonsier와 수술 보조원 Pei-Ling, Wen-Tin, Shih-Yin이 시연하겠습니다. 먼저 15 cm 디쉬당 12 mL의 배지에 1.2 × 10⁶개의 비부착성/중간엽 유선 상피세포(non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells, NAMECs)를 분주하고, 세포 배양 인큐베이터에서 4일 동안 배양합니다. 4일째 되는 날, 테이블탑 원심분리를 위해 배양액을 수확합니다.그런 다음 상층액을 원뿔형 튜브로 옮겨 2차 테이블탑 원심분리를 수행합니다. 다음으로, 상층액을 새로운 초원심분리 튜브로 옮기고 30분 동안 초원심분리를 실시합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 다시 새로운 초원심분리 튜브로 옮겨 다시 한번 초원심분리합니다.상층액을 제거하고 세포 외 소포체 엑소좀 펠릿을 PBS에 재부유하여 세 번째 초원심분리를 수행합니다. 그다음, 펠릿을 신선한 PBS에 재부유하고 세포 입자를 마지막으로 한 번 더 초원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 외 소포체 엑소좀 펠릿을 100 µL의 PBS에 재부유합니다.그런 다음, bicinchoninic acid 분석법을 사용하여 세포 외 소포 현탁액의 단백질 농도를 측정합니다. 농도는 100 µL당 약 20~40 µg이어야 합니다. 세포 외 소포 및 엑소좀의 농도와 크기를 측정하려면, 세포 입자를 PBS 100 mL당 단백질 2 µg이 되도록 희석하십시오.그리고 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis)을 통해 입자를 분석합니다. 밀도 구배법으로 엑소좀을 정제하려면, 세 번째 초원심분리 후 펠렛을 PBS에 희석된 40% iodixanol 2 mL에 다시 부유시킵니다. 그리고 세포 현탁액 위에 30%, 20%, 10% 및 5% iodixanol을 순서대로 2 mL씩 층을 쌓아 올립니다.원심분리가 끝난 후 피펫을 사용하여 10개의 밀도 구배 층을 각각 수집함으로써 밀도 구배 초원심분리를 통해 세포 분획을 분리하십시오. 그 후, 표준 프로토콜에 따라 SDS page 및 western blot을 이용하여 각 분획 내 엑소좀 마커의 존재 여부를 분석하십시오. 이때 관심 있는 적절한 엑소좀 마커에 대한 항체를 사용하십시오.유방 상피 세포를 세포 외 소포체 및 엑소좀으로 처리하기 위해, 먼저 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트에 2 x 10⁵개의 유세포 분석으로 선별된 epcam hi-CD 49F low 내강 유방 상피 세포를 플레이트당 분주합니다. 그다지 각 세포 배양물에 2 µg/mL의 NAMEC 유래 세포 외 소포체 및 엑소좀을 처리합니다. 10일 동안 2일마다 신선한 세포 외 소포체 및 엑소좀이 포함된 배양액으로 교체합니다.처치 기간이 끝나면, 마취된 3주령의 암컷 57 BL6 생쥐를 배측으로 눕히고 복부 중앙의 털을 제거합니다. 70% 알코올과 포비돈 요오드를 교대로 3회 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 복부 흉강 서혜부 영역을 따라 피부에 1.5 cm 길이의 수직 절개를 가합니다.우측과 좌측의 네 번째 유선 지방 패드를 교대로 노출시킵니다. 각 지방 패드에서 림프절의 위치를 확인하고, 림프절 아래의 유선 조직 전체를 제거합니다. 다음으로, 프로디알리틱(prodialitic) 및 콜로게날리틱(cologenalitic) 활성을 가진 천연 효소를 사용하여 세포 외 소포 및 엑소좀 처리된 루미날 유선 상피 세포를 분리합니다.10분 후 5% FBS가 포함된 PBS로 효소 활성을 중화합니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고 상층액은 제거합니다. 세포 수를 측정한 후, PBS 농도 15 µL당 1 × 10² ~ 1 × 10⁴ cells가 되도록 세포를 희석합니다.27게이지 바늘이 장착된 100 µL 유리 시린지를 사용하여 유선 상피세포 현탁액 15 µL를 각 지방 패드에 주입합니다. 그 후, 상처 봉합 클립으로 피부를 닫습니다. 주입 8주 후, 흉부에서 서혜부까지 피부를 따라 수직 절개를 하여 좌우 제4 유선 지방 패드를 모두 노출시킵니다.네 번째 유선 조직을 제거하고 지방 패드를 각각의 유리 현미경 슬라이드 위에 펼칩니다. 그런 다음 슬라이드를 화학 후드로 옮겨, 실온에서 하룻밤 동안 콜린스 고정액(collies fixatives)으로 고정합니다. 다음 날 아침, 샘플을 70% 에탄올 250 milliliters로 15분 동안 세척합니다.이어 250 mL의 증류수로 5분 동안 세척합니다. 증류수 세척 후, 지방 패드를 carmine alum으로 실온에서 하룻밤 동안 염색합니다. 그 후 농도가 증가하는 에탄올 용액에 15분씩 순차적으로 처리하여 탈수시킵니다.마지막 탈수 과정 후, 지방 패드가 투명해질 때까지 샘플을 화학 흄후드 내의 자일렌으로 옮깁니다. 그런 다음, 봉입제를 사용하여 슬라이드를 봉입하고, 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 지방 패드를 2,400 dpi로 이미지화합니다. 나노 입자 추적 분석으로 측정한 분리된 소포와 초원심분리 펠릿의 크기는 일반적으로 약 100 nm입니다.또한, NAMEC 조건배지의 초원심분리 분획물을 투과전자현미경으로 분석한 결과, 다량의 막 소포체가 존재함이 확인되었습니다. 앞서 시연한 밀도 구배 분리 후, 20% iodixonal 분획에서 엑소좀 마커가 검출될 수 있습니다. CFSE로 표지된 NAMEC 유래 세포외 소포체 및 엑소좀을 처리한 인간 루미날 유방 상피세포의 유세포 분석 결과, 엑소좀 처리 배양군에서 CFSE 신호가 10배 더 높게 나타났습니다.유선 상피세포에 의한 CFSE 표지 세포 외 소포체 및 엑소좀의 특이적 섭취를 나타냅니다. 또한, 음성 대조군인 PBS 처리 유선 상피세포는 CFSE 신호를 보이지 않는 반면, 엑소좀 처리 세포에서는 NAMEC 유래 세포 외 소포체 및 엑소좀의 섭취 증거를 공초점 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 특히, NAMEC 유래 세포 외 소포체 및 엑소좀을 10일 동안 처리한 flow sorted epCAMhi/CD49Flo 관강 유선 상피세포를 주입한 마우스의 지방 패드에서 유선을 형성하는 능력을 획득했음을 확인하였습니다.이 기술의 개발 이후, 본 연구진은 줄기세포 생물학 분야에서 줄기세포 유래 분화 세포, 소포체 및 엑소좀을 재생 의학 및 직접 세포 리프로그래밍에 활용하는 방안을 탐구할 수 있는 기틀을 마련하였습니다.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

HC11 lactogenic 차별화는 mammospheres이라고 돔 구조의 형성에 의해 특징 수 있습니다. 구조 lactogenic 차별 quantifying에 투입 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거 수 있습니다.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

이 문서 DeOme 킬로바이트 개발한 절차를...

내유 상피 이식 절차

이 보고서에서, 우리는 분리 시스템 및 마우스 유선에서 문화 기증자 세포를 증명하고, orthotopically stromal 분석받는 마우스에서 이러한 세포를 이식 : 내유 종양 개발하는 동안 상피 상호 작용합니다.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

본 프로토콜은 유방 상피 세포에 관심 유전자를 전달하기 위해 젖꼭지를 통한 바이러스 벡터의 관내 주입을 설명합니다.

생체 내 유방 관내 주입을 통한 마우스 유방 상피 세포로의 유전자 전달

배우세요 유방 기초 상피 세포에서 세포외 소포체와 엑소좀을 분리하여 유방 루미널 세포에 유선 형성 능력을 이전하는 방법을. 이 기법은 줄기세포 재프로그래밍 연구에 활용됩니다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

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