전기 충격 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하기위한 광학적 분별 기 기술

광학 분획기를 사용한 이 입체학적 연구의 전반적인 목표는 편향되지 않은 원리에 기반한 방법을 사용하여 특정 뇌 영역의 총 세포 수와 같은 정량적 정보를 얻는 것입니다. 이 방법은 전체 관심 구조의 총 세포 수 추정과 같은 정량 분석 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점 중 하나는 고정되고 미리 결정된 정밀도로 정확한 추정치를 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 논문의 공동 저자인 Esther Kjaer Needham입니다. 고정되고 얼어붙은 쥐의 뇌로 시작하십시오. 메스를 사용하여 뇌의 정중선을 따라 오른쪽 반구와 왼쪽 반구를 분리한 다음 첫 번째 뇌에서 무작위로 하나 또는 다른 반구를 선택합니다.

그 후 우반구와 좌반구 사이를 체계적으로 이동합니다. 그런 다음 장착 매체를 사용하여 선택한 반구를 디스크에 수직인 장축이 있는 표본 디스크에 장착합니다. 반구가 디스크에 장착되면 반구 주위에 튜브를 놓고 Tissue-Tek으로 채워 반구를 완전히 덮습니다.

다음으로, 사전 냉각을 위해 번호가 매겨진 여러 접시 용기를 저온 유지 장치에 넣습니다. 그런 다음 표본 디스크를 저온 유지 장치에 장착하고 해마 전체를 관상동맥 평면에서 80미크론 두께의 절편으로 무작위로 절단합니다. 절단하는 동안 모든 s를 배치하십시오.amped 섹션을 차가운 다중 접시 용기에 연속적으로 넣어 섹션이 절단 순서로 유지되도록 합니다.

해마 전체가 절편화되면 동결 보호제로 절편을 완전히 덮고 더 사용할 때까지 용기를 섭씨 영하 20도로 유지하십시오. 면역염색을 시작할 준비가 되면 절편이 실온까지 올라오도록 합니다. 그런 다음 페인트 브러시를 사용하여 일련의 해마 섹션에서 5번째 섹션마다 PBS로 채워진 페트리 접시에 놓인 25웰 염색 그물로 옮깁니다.

염색을 위해 해마당 8-12개의 섹션이 있어야 합니다. 절편이 들어 있는 염색망을 PBS가 들어 있는 일치하는 유리 접시에 옮기고 PBS에서 10분 동안 절편을 두 번 세척합니다. 그런 다음 3% 과산화수소에서 20분 동안 배양합니다.

세척 후 단면을 3 개의 염산 용액으로 이동합니다. 그런 다음 0.1 sodium tetraborate를 실온에서 20분 동안 중화합니다. 10분 동안 3회 배양하고 세척 버퍼를 교체한 후 실온에서 1시간 동안 섹션을 차단 용액으로 옮깁니다.

그런 다음 블로킹 용액에서 1에서 100으로 희석된 마우스 항 BrdU의 절편을 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. 1차 항체 배양 후 세척 버퍼에서 각각 10분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 양고추냉이 과산화효소에서 48시간 동안 잠복하고 세척 완충액에서 1-10을 희석합니다.

48시간 후 10분 동안 절편을 PBS로 옮기고 총 5회 세척을 반복합니다. 세척 후 섹션을 7분 동안 DAB 솔루션으로 옮깁니다. 그런 다음 0.02% 과산화수소가 포함된 DAB 용액으로 10분 동안 옮깁니다.

일련의 세척 후 현미경 슬라이드에 번호 순서대로 섹션을 장착합니다. 약 30분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 샘플을 슬라이드 랙에 넣어 자연 건조합니다.

다음으로, 증류수가 들어있는 슬라이드 염색 접시에서 샘플을 10분 동안 재수화합니다. 그런 다음 슬라이드를 0.02% 크레실 바이올렛과 증류수로 15분 동안 옮깁니다. 크레실 바이올렛 염색을 반복한 후 에탄올 계열을 통해 섹션을 재수화합니다.

그런 다음 자일렌의 단면을 매번 15분 동안 두 번 청소합니다. 마지막으로 급속 건조 장착 매체를 추가하고 슬라이드를 덮습니다. 24시간 후에는 슬라이드를 현미경 검사에 사용할 수 있습니다.

먼저 현미경의 전동 스테이지에 슬라이드를 배치한 다음 stereology 소프트웨어를 열어 조직의 두께를 확인하는 것으로 시작합니다. 100x 오일 이멀젼 대물렌즈로 변경하기 전에 저배율 대물렌즈를 사용하여 관심 영역을 묘사합니다. 그런 다음 계수 프레임에서 특정 지점(예: 모서리에 인접한 영역)을 선택하고 섹션의 일부 기능에 초점이 맞춰질 때까지 초점면을 따라 이동하여 섹션의 맨 위를 찾습니다.

Z 위치를 0으로 등록합니다. 다음으로, 조직의 마지막 Z 레벨에 초점이 맞춰질 때까지 조직을 통해 초점면을 아래로 이동한 다음 이 위치를 표시합니다. 국소 조직 두께는 0에서 이 끝점까지 정의되며 Z축에서 읽을 수 있습니다.

조직 두께를 등록합니다. 조직 두께는 관심 영역 내의 여러 위치에서 측정됩니다. 해부기 및 보호 구역의 높이, 계수 프레임의 크기, 보폭 길이 및 최종 배율은 파일럿 연구에서 결정됩니다.

이제 60x 오일 또는 100x 오일 대물렌즈와 높은 개구수를 사용하여 일반적으로 2000-3000x의 최종 배율에서 Brd-U 양성 뉴런을 계산할 수 있습니다. 각 카운팅 프레임에서 BrdU 양성 뉴런을 식별하되, 빨간색 제외 선에 닿는 뉴런은 세지 않습니다. 녹색 포함 선에 닿는 BrdU 양성 뉴런과 계수 프레임의 경계 내에 있는 뉴런을 셉니다.

관심 기능이 해부 높이 내에서 명확하게 인식되는 경우에만 Brd-U 양성 뉴런을 계산합니다. 여기에 표시된 반쯤 보이는 뉴런은 계산되지 않습니다. 이 이미지는 쥐 해마의 해마 과립 세포층과 과립 영역(subgranular zone)에 있는 BrdU 양성 뉴런의 총 수를 보여줍니다.

가로 막대는 평균 값을 나타냅니다. 전기경련 자극 후 대조군을 치료했을 때와 비교하여 새로운 BrdU 양성 뉴런의 형성이 즉시 260% 증가합니다. 새로 생성된 이 뉴런 풀에서는 1일에서 3개월 사이에 40%의 감소가 있으며, 새로 형성된 뉴런의 거의 50%가 치료 후 12개월 동안 생존합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 입체학적 방법을 사용하여 뇌 영역의 총 세포 수를 추정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.