네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

인-겔 분석(in-gel assays), 면역블롯팅(immunoblotting) 및 네이티브 전기용출(native electroelution)과 결합된 네이티브 전기영동의 전반적인 목적은 미토콘드리아 초복합체(supercomplexes)의 조립 상태를 보존하고 분석하는 것입니다. 이 방법은 생체 에너지 요구도와 생리적 및 병리적 상태를 포함한 여러 요인에 따라 미토콘드리아 전자 전달계의 단백질 복합체들이 어떻게 초복합체로 조립되는지에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적절하게 수행될 경우, 장시간의 분리 과정 전반에 걸쳐 미토콘드리아 초복합체의 생리적 무결성과 기능성이 보존된다는 점입니다.

이 방법은 슈퍼복합체 조립의 역학을 연구하거나, 다른 세포 내 막뿐만 아니라 세포막의 단백질 복합체를 분석하는 데에도 적용할 수 있습니다. 인-겔 분석(in-gel assay)을 준비할 때, 네이티브 전기영동에 사용되는 모든 부품이 계면활성제에 오염되지 않도록 하는 것이 매우 중요하며, 그렇지 않으면 미토콘드리아 슈퍼복합체가 붕괴될 수 있습니다. 투명 네이티브 겔(clear native gel)에서 하나 이상의 레인을 절단하여 라벨이 부착된 용기에 옮기십시오.

complex-1 분석을 수행하려면, 분석 완충액 10 milliliters에 nitro blue tetrazolium 25 milligrams와 10 milligrams per milliliter NADH 100 microliters를 혼합합니다. 이를 절단된 clear native gel 레인 또는 분석 대상 영역에 첨가합니다. 로커(rocker) 위에서 최소 3분 동안 부드럽게 흔들어준 후 청색 밴드가 발색되는 과정을 관찰합니다.

그 후, 10~20 mL의 아세트산 용액으로 겔을 고정하거나 5 mM Tris pH 7.4로 세척하여 반응을 중지시킵니다. 기록을 위해 사진을 촬영합니다. complex-5 분석을 수행하려면, blue native 또는 clear native 겔에서 겔 전체, 레인 또는 관심 영역을 얻습니다.

시료를 10~20 mL의 분석 버퍼와 ±5 µg/mL의 oligomycin이 포함된 용액에 넣고, 상온에서 부드럽게 교반하며 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 버퍼를 14 mL의 신선한 분석 버퍼로 교체합니다. 그 다음 1 M magnesium sulfate 190 µL, lead nitrate 27.28 mg, ATP 60 mg, oligomycin 75 µL를 순서대로 첨가합니다.

가볍게 교반하며 배양하고, 올리고마이신(oligomycin) 처리된 젤의 밴드는 복합체-5(complex-5) 비의존적 밴드를 나타내므로 흰색 침전물이 형성되는지 확인합니다. 산성 용액은 납 침전물을 용해시키므로 메탄올 기반 고정액으로 젤을 고정합니다. 결과를 촬영한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 전이 및 면역블롯팅을 수행합니다.

전기 용출 당일에 사용할 각 유리 튜브 바닥에 프리트를 배치하십시오. 필요한 경우, 유리 튜브를 용출 버퍼에 넣고 내부에서 프리트를 밀어 튜브 바닥까지 밀착시키십시오. 프리트가 장착된 유리 튜브를 Electro-Eluter 모듈에 삽입하십시오.

그로밋을 용출 버퍼로 적신 후 유리관을 밀어 넣어 고정합니다. 유리관의 상단이 그로밋과 수평이 되는지 확인하십시오. 빈 그로밋은 스토퍼로 막습니다.

다음으로, 젖은 멤브레인 캡을 실리콘 어댑터 바닥에 배치하고 어댑터를 용출 버퍼로 채웁니다. 투석 멤브레인 주변의 기포를 제거하기 위해 버퍼와 어댑터를 천천히 위아래로 피펫팅합니다. 버퍼가 채워진 어댑터를 유리 튜브 바닥으로 밀어 넣습니다.

그 후, 유리 튜브 내부의 프릿(frit)에 생긴 모든 기포를 제거합니다. 각 유리 튜브에 용출 버퍼를 채웁니다. BN-PAGE에서 절단한 밴드들을 유리 튜브에 넣습니다.

큰 조각들을 작은 조각으로 자릅니다. 유리관 내의 충전 높이가 약 1cm가 되도록 합니다. 그런 다음, 전체 모듈을 탱크에 넣습니다.

냉각 용출 버퍼 약 600 milliliters를 탱크에 추가합니다. 실리콘 어댑터 캡이 버퍼에 잠겼는지 확인하십시오. 저어주기 바(stir bar)를 탱크 바닥에 배치한 후, 냉장실에서 350 volts로 4시간 동안 단백질을 용출합니다.

용출이 완료되면 Electro-Eluter 모듈을 버퍼 탱크에서 꺼내 싱크대나 그릇에 놓으십시오. 스토퍼를 사용한 경우, 이를 제거하여 상단 버퍼 챔버를 배수하십시오. 각 유리 튜브에서 버퍼를 제거하고 폐기하십시오.

실리콘 어댑터가 제자리에 고정되어 있는지 확인하고, 프리트(frit) 아래의 액체가 흐트러지거나 흔들리지 않도록 주의하십시오. 그다음, 유리관 바닥에서 멤브레인 캡과 함께 실리콘 어댑터를 조심스럽게 제거합니다. 실리콘 캡 내부의 내용물을 마이크로튜브에 피펫으로 옮깁니다.

200 µL의 용출 버퍼를 추가로 사용하여 실리콘 캡을 헹군 후 마이크로튜브에 넣습니다. 모든 유리 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다. 재사용 가능한 멤브레인 캡은 0.5 mg/mL의 sodium azide가 포함된 용출 버퍼에 넣어 냉장 보관하여 보존합니다.

심장 미토콘드리아의 슈퍼콤플렉스를 여기서는 인-겔 분석(in-gel assay)을 통해 시각화합니다. 투명 네이티브 겔(clear native gel)의 레인을 복합체-1과 복합체-5의 인-겔 분석에 사용합니다. 신호의 특이성은 ATP-합성효소에 대한 올리고마이신(oligomycin)과 같은 억제제를 사용하여 평가할 수 있습니다.

인겔(In-gel) 분석은 단백질 복합체의 크기와 complex-1 또는 complex-5 활성에 관한 정보를 제공하지만, 그 구성 성분에 대해서는 알려주지 않습니다. 블루 네이티브 젤(blue native gel)에는 전기용출(electroelution)을 위해 절단할 수 있는 단백질 복합체 밴드가 나타납니다. 전기용출 후, 용출액은 인겔 분석, 네이티브 또는 변성 전기영동을 통한 용출 단백질의 은 염색, 웨스턴 블로팅과 같은 추가 분석에 사용됩니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 3일에는 미토콘드리아 분리, 하룻밤 동안 진행되는 blue native maxi electrophoresis 및 immunoblotting 과정이 포함됩니다. 이 영상을 시청하고 나면 native electrophoresis, in-gel assay 및 electroelution을 이용하여 미토콘드리아 supercomplex를 분리하고 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 절차를 수행할 때, 미토콘드리아 슈퍼컴플렉스는 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 시료의 동결 및 해동은 최소한으로 제한해야 합니다. Native 전기영동 및 전기용출은 얼음 위 또는 저온실에서 수행해야 합니다.

이러한 기술의 함의는 각 슈퍼컴플렉스의 물리적 조성을 규명하는 것 이상으로 확장됩니다. 슈퍼컴플렉스가 본연의 형태로 포착되기 때문에 기능적 분석이 가능합니다. 이 기술이 개발된 이후, 미토콘드리아 생물학 분야의 연구자들은 미토콘드리아 전자 전달 활성과 그것이 미토콘드리아 질환 환자들에게 미치는 영향에 대한 이해를 재평가할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차 이후에 HPLC, 질량 분석법, 전자 현미경 또는 패치 클램핑과 같은 다른 방법들을 수행하여, 분리된 단백질 복합체의 분자 조성, 구조 또는 전기생리학적 특성과 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.