Name: 네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 네이티브 전기 영동, 인-겔 분석 및 전기 용출을 활용한 미토콘드리아 전자 수송 사슬 수퍼 콤플렉스 분석 방법. 이 기술은 생리적 무결성을 보존하며 질병 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 심장 학회 설립자 제휴사 (12GRNT12060233)와 로체스터 대학의 Strong Children &#39;s Research Center의 연구비 지원으로 이루어졌습니다.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
<li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li>
<li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li>
<li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
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기능적 ETC는 미토콘드리아 ATP 생성에 필요합니다. ETC의 복합체는 respirasomes (Cx-I, -III 및 -IV) 1 과 신타 소솜 (Cx-V) 2의 두 가지 유형의 수퍼 콤플렉스를 형성 할 수 있습니다. ETC를 supercomplexes로 편성하는 것은 전반적인 ETC 효율성을 증가시키는 것으로 생각되는 반면, 각 복합체의 조립은 손상되지 않은 ETC에 필요하다. 이러한 수퍼 콤플렉스가 어떻게 조립 및 분해되는지는 잘 알려져 있지 않지만 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 프로세스를 더 잘 이해할 수 있습니다. ETC 어셈블리 연구의 주요 과제는 이러한 단백질 복합체의 크기입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 호흡기는 Cx-I (약 880 kDa)와 하나 이상의 Cx-III 분자 (460 kDa) 및 Cx-IV (200 kDa, 이량 체로 활성)로 구성되어 분자와의 복합체를 형성...

ATP 형태의 미토콘드리아 에너지는 세포 생존에 필수적 일뿐만 아니라 세포 사멸의 조절에도 필수적이다. 산화 적 인산화에 의한 ATP의 생성에는 기능적 전자 전달 사슬 (ETC, Cx-1 내지 IV) 및 미토콘드리아 ATP 신타 제 (Cx-V)가 필요하다. 최근의 연구에 따르면 이러한 큰 단백질 복합체는 respirasomes 및 synthasomes 1 , 2 라고 불리는 수퍼 콤플렉스로 구성되어 있습니다. 이러한 대규모 단지와 수퍼 콤플렉스의 조립, 역학 및 활동 규제를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 분광 광도계를 사용하여 수행 한 산소 전극 및 효소 분석으로 얻은 산소 소비 측정은 ETC 복합체 활성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있지만이 분석법은 관련된 단백질 복합체 또는 수퍼 콤플렉스의 존재, 크기 및 하위 구성에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 그러나, 청색 및 투명한 천연 (BN 및 CN) PAGE 3 은 복잡한 구성 및 조립 / 해체에 대한 중요한 정보와 생리 및 병리학 적 조건 하에서 이들 중요한 호흡 복합체의 초분자 조직의 동적 조절에 대한 강력한 도구를 창출했습니다. 이러한 복합체를 고차 수퍼 콤플렉스로 조립하면 미토콘드리아 구조와 기능을 조절하는 것으로 보인다 5 . 예를 들어 respirasome assembly는 전자 이동의 효율과 미토콘드리아 내부 막을 가로 지른 양성자 원동력의 생성을 증가시킵니다 5 . 또한, synthasomes의 조립은 ATP 생산의 효율과 세포질 2 로의 에너지 등가물의 전달을 증가시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 내부 막을 관상의 cristae 6 로 몰드시킨다 &lt;/ sup&gt; 7 . 마우스 배아에서 심장 발달 중 supercomplex assembly에 대한 연구는 심장에서 Cx-I- 함유 supercomplexes의 생성이 대략 배아 일 13.5 8 에서 시작한다는 것을 보여준다. 다른 사람들은 노화 또는 허혈 / 재관류 손상으로 인해 Cx-I- 함유 수퍼 콤플렉스의 양이 심장에서 감소하거나 신경 퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다 11 . 이 프로토콜은 ETC 복합체 및 supercomplexes의 조립 및 활동을 조사하는 데 사용할 수있는 원시 젤 페이지에 대한 방법을 설명합니다. 미토콘드리아 supercomplexes의 대략 분자량은 CN 또는 BN polyacrylamide 젤에 단백질 복합체를 분리하여 평가할 수 있습니다. CN PAGE는 또한 겔에서 직접적으로 모든 미토콘드리아 복합체의 효소 활성을 시각화합니다 (in-gel assay;IGA) 12 . 이 연구는 IGA를 통해 NADH를 산화시키는 Cx-I의 능력과 IGA에 의한 Cx-V의 ATP 가수 분해 활성으로 인한 신타 소솜의 존재를 강조함으로써 호흡기 활동을 입증합니다. Cx-I 및 Cx-V를 함유 한 복합체 및 수퍼 콤플렉스는 또한 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 면역 블로 팅을 수행함으로써 입증 될 수있다. 이 방법의 장점은 일반적으로 BN 또는 CN PAGE가 생리 학적 크기 및 조성을 기반으로 단백질 복합체를 분리한다는 점입니다. 멤브레인으로의 전달은 이러한 밴드 패턴을 보존합니다. BN 또는 CN PAGE에서 단백질 복합체를 분석하는 것은 2D-PAGE (Fiala 등 13 참조) 또는 자당 밀도 원심 분리 14 , 15 를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 특정 밴드를 추가로 분석하기 위해 BN PAGE에서 추출 할 수 있으며이 단백질 복합체의 단백질을 정제 할 수 있습니다d. 네이티브 전기 분해는 몇 시간 내에 수행 될 수 있는데, 이것은 겔로부터 주변 완충액으로의 단백질의 수동 확산 (참조 문헌 16에서 사용 된 바와 같이)에 상당한 차이를 만들 수있다. 요약하면, 이들 방법은 미토콘드리아 막으로부터의 고 분자량 수퍼 콤플렉스의 추가 특성 결정을 가능하게하는 몇 가지 접근법을 기술한다.

<table><tbody><tr><td>Protean II 미니 젤 챔버</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>미니 젤 전기 영동을 붓고 실행하는 전체 세트</td></tr><tr><td>Protean XL 맥시 젤</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>맥시 젤 전기 영</td></tr>동 그라<tr><td>디언트 메이커, Hoefer SG15 VWR</td><td></td><td>95044-704</td><td>붓는 미니 젤 그라디언</td></tr>트 <tr><td>메이커, 맥시 젤</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>붓는 맥시 젤 그래디언트</td></tr><tr><td>전사 키트</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>멤브레인으로 단백질을 습식으로 이송하는 전체 세트</td></tr><tr><td>Electroeluter 모델 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>천연 또는 SDS PAGES에서 단백질의 전기 용출</td></tr><tr><td>유리판 Biorad</td><td></td><td>1653308</td><td>Short plates</td></tr><tr><td>유리판</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>스페이서 플레이트</td></tr><tr><td>유리판</td><td>Biorad</td><td>1651823</td><td>내부 플레이트</td></tr><tr><td>유리 플레이트</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>외부 플레이트</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>기본 전기영동에 적합한 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Chemolumniscense 기질</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Enhanced chemolumniscense 기질</td></tr><tr><td>필름/자가방사선 촬영 필름</td><td>GE 헬스케어</td><td>28906845</td><td>웨스턴 블롯 문서화</td></tr><tr><td>필름 프로세서 CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>젤, 멤브레인 및 블롯을 문서화하기 위해 사진을 찍습니다.</td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640 카메라 후드&nbsp;</td><td>가벼운 테이블에서 사진을 찍을 수 있는</td> <td>Canon</td><td></td> 차폐 카메라</tr><tr><td>아크릴아미드/비아크릴아미드</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>40% 사전 혼합 용액</td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS(도데실황산나트륨)</td><td>인비트로젠</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>트리신</td><td>시그마</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>소듐데옥시킬레이트</td><td>시그마</td><td>D66750</td><td>세제</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마</td><td>M1254</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마</td><td>I15513</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>라우릴 말토시드</td><td>시그마</td><td>D4641</td><td>세제</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>아미노헥산산</td><td>시그마</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>네이티브&nbsp; 분자량 키트</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>네이티브 전기영동을 위한 고분자량 교정 키트.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue 테트라졸륨</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td> 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>항체 ATP synthase subunit ATP5A</td></tr><tr><td>anti-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>Cx-1 subunit NDUFB6</td></tr><tr><td>anti-VDAC 항체</td><td>Calbiochem</td><td>529534</td><td>VDAC</td></tr><tr><td>ECL HRP 연계 항체</td><td>GE Health Care</td><td>NA931V</td><td>ATP5A, NDUFB6 및 VDAC 차단 시약에 대한 2차 항체</td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Silver staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

네이티브 전기 영동, in-gel assay 및 electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

미토콘드리아 전자 수송 사슬 (ETC)은 다양한 연료의 분해로 인해 생성 된 에너지를 세포의 ATP 인 생물 에너지로 변환시킵니다. ETC는 respirasomes (CI, C-III, C-IV) 및 전자 전달 및 ATP 생산의 효율성을 증가시키는 synthasomes (CV)라고 불리는 supercomplexes로 조립되는 5 개의 거대한 단백질 복합체로 구성됩니다. ETC 기능을 측정하기 위해 50 년 이상 다양한 방법이 사용되었지만 이러한 프로토콜은 개별 복합체와 수퍼 콤플렉스의 조립에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 ETC 복잡한 구조를 연구하기 위해 20 년 이상 전에 수정 된 방법 인 고유 겔 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE) 기술을 설명합니다. 네이티브 전기 영동으로 ETC 복합체를 활성 형태로 분리 할 수 ​​있으며,이 복합체는 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔화 분석 (IGA) 및 전기 분해로 정제 할 수 있습니다. 다시 조합하여네이티브 젤 PAGE와 다른 미토콘드리아 분석 결과를 비교해 보면 ETC 활동, 동적 인 조립 및 분해, 그리고 이것이 미토콘드리아 구조와 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 완성도를 얻을 수 있습니다. 이 작품은 또한 이러한 기술의 한계를 논의 할 것입니다. 요약하면, 네이티브 PAGE 기술은 면역 블로 팅, IGA, 전기 분해가 뒤 따르는 것으로 미토콘드리아 ETC 수퍼 콤플렉스의 기능과 구성을 조사하는 강력한 방법입니다.

미토콘드리아 supercomplexes를 시각화하기 위해 쥐에서 새로 격리 mitochondria가 사용되었다 17 , 18 . Mitochondrial supercomplexes는 일부 연구자들에게는 용인 될 수 있지만, 분해 및 해동의 반복주기에 민감합니다. 보관을 위해 동결이 필요한 경우 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 한 번 이상 동결 및 해동하지 않아야합니다. 미토콘드리아 ETC 복합체를 BN PAGE로 시각화하기 위해 분리 된 심장 미토콘드리아의 단백질 100 μg을 4-10 % 젤에 로딩했다 ( 그림 1A ). 로딩 및 음극 완충액의 쿠마시 스테인은 실행 중 단백질 복합체를 표지하기에 충분합니...

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

인-겔 분석(in-gel assays), 면역블롯팅(immunoblotting) 및 네이티브 전기용출(native electroelution)과 결합된 네이티브 전기영동의 전반적인 목적은 미토콘드리아 초복합체(supercomplexes)의 조립 상태를 보존하고 분석하는 것입니다. 이 방법은 생체 에너지 요구도와 생리적 및 병리적 상태를 포함한 여러 요인에 따라 미토콘드리아 전자 전달계의 단백질 복합체들이 어떻게 초복합체로 조립되는지에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적절하게 수행될 경우, 장시간의 분리 과정 전반에 걸쳐 미토콘드리아 초복합체의 생리적 무결성과 기능성이 보존된다는 점입니다.이 방법은 슈퍼복합체 조립의 역학을 연구하거나, 다른 세포 내 막뿐만 아니라 세포막의 단백질 복합체를 분석하는 데에도 적용할 수 있습니다. 인-겔 분석(in-gel assay)을 준비할 때, 네이티브 전기영동에 사용되는 모든 부품이 계면활성제에 오염되지 않도록 하는 것이 매우 중요하며, 그렇지 않으면 미토콘드리아 슈퍼복합체가 붕괴될 수 있습니다. 투명 네이티브 겔(clear native gel)에서 하나 이상의 레인을 절단하여 라벨이 부착된 용기에 옮기십시오.complex-1 분석을 수행하려면, 분석 완충액 10 milliliters에 nitro blue tetrazolium 25 milligrams와 10 milligrams per milliliter NADH 100 microliters를 혼합합니다. 이를 절단된 clear native gel 레인 또는 분석 대상 영역에 첨가합니다. 로커(rocker) 위에서 최소 3분 동안 부드럽게 흔들어준 후 청색 밴드가 발색되는 과정을 관찰합니다.그 후, 10~20 mL의 아세트산 용액으로 겔을 고정하거나 5 mM Tris pH 7.4로 세척하여 반응을 중지시킵니다. 기록을 위해 사진을 촬영합니다. complex-5 분석을 수행하려면, blue native 또는 clear native 겔에서 겔 전체, 레인 또는 관심 영역을 얻습니다.시료를 10~20 mL의 분석 버퍼와 ±5 µg/mL의 oligomycin이 포함된 용액에 넣고, 상온에서 부드럽게 교반하며 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 버퍼를 14 mL의 신선한 분석 버퍼로 교체합니다. 그 다음 1 M magnesium sulfate 190 µL, lead nitrate 27.28 mg, ATP 60 mg, oligomycin 75 µL를 순서대로 첨가합니다.가볍게 교반하며 배양하고, 올리고마이신(oligomycin) 처리된 젤의 밴드는 복합체-5(complex-5) 비의존적 밴드를 나타내므로 흰색 침전물이 형성되는지 확인합니다. 산성 용액은 납 침전물을 용해시키므로 메탄올 기반 고정액으로 젤을 고정합니다. 결과를 촬영한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 전이 및 면역블롯팅을 수행합니다.전기 용출 당일에 사용할 각 유리 튜브 바닥에 프리트를 배치하십시오. 필요한 경우, 유리 튜브를 용출 버퍼에 넣고 내부에서 프리트를 밀어 튜브 바닥까지 밀착시키십시오. 프리트가 장착된 유리 튜브를 Electro-Eluter 모듈에 삽입하십시오.그로밋을 용출 버퍼로 적신 후 유리관을 밀어 넣어 고정합니다. 유리관의 상단이 그로밋과 수평이 되는지 확인하십시오. 빈 그로밋은 스토퍼로 막습니다.다음으로, 젖은 멤브레인 캡을 실리콘 어댑터 바닥에 배치하고 어댑터를 용출 버퍼로 채웁니다. 투석 멤브레인 주변의 기포를 제거하기 위해 버퍼와 어댑터를 천천히 위아래로 피펫팅합니다. 버퍼가 채워진 어댑터를 유리 튜브 바닥으로 밀어 넣습니다.그 후, 유리 튜브 내부의 프릿(frit)에 생긴 모든 기포를 제거합니다. 각 유리 튜브에 용출 버퍼를 채웁니다. BN-PAGE에서 절단한 밴드들을 유리 튜브에 넣습니다.큰 조각들을 작은 조각으로 자릅니다. 유리관 내의 충전 높이가 약 1cm가 되도록 합니다. 그런 다음, 전체 모듈을 탱크에 넣습니다.냉각 용출 버퍼 약 600 milliliters를 탱크에 추가합니다. 실리콘 어댑터 캡이 버퍼에 잠겼는지 확인하십시오. 저어주기 바(stir bar)를 탱크 바닥에 배치한 후, 냉장실에서 350 volts로 4시간 동안 단백질을 용출합니다.용출이 완료되면 Electro-Eluter 모듈을 버퍼 탱크에서 꺼내 싱크대나 그릇에 놓으십시오. 스토퍼를 사용한 경우, 이를 제거하여 상단 버퍼 챔버를 배수하십시오. 각 유리 튜브에서 버퍼를 제거하고 폐기하십시오.실리콘 어댑터가 제자리에 고정되어 있는지 확인하고, 프리트(frit) 아래의 액체가 흐트러지거나 흔들리지 않도록 주의하십시오. 그다음, 유리관 바닥에서 멤브레인 캡과 함께 실리콘 어댑터를 조심스럽게 제거합니다. 실리콘 캡 내부의 내용물을 마이크로튜브에 피펫으로 옮깁니다.200 µL의 용출 버퍼를 추가로 사용하여 실리콘 캡을 헹군 후 마이크로튜브에 넣습니다. 모든 유리 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다. 재사용 가능한 멤브레인 캡은 0.5 mg/mL의 sodium azide가 포함된 용출 버퍼에 넣어 냉장 보관하여 보존합니다.심장 미토콘드리아의 슈퍼콤플렉스를 여기서는 인-겔 분석(in-gel assay)을 통해 시각화합니다. 투명 네이티브 겔(clear native gel)의 레인을 복합체-1과 복합체-5의 인-겔 분석에 사용합니다. 신호의 특이성은 ATP-합성효소에 대한 올리고마이신(oligomycin)과 같은 억제제를 사용하여 평가할 수 있습니다.인겔(In-gel) 분석은 단백질 복합체의 크기와 complex-1 또는 complex-5 활성에 관한 정보를 제공하지만, 그 구성 성분에 대해서는 알려주지 않습니다. 블루 네이티브 젤(blue native gel)에는 전기용출(electroelution)을 위해 절단할 수 있는 단백질 복합체 밴드가 나타납니다. 전기용출 후, 용출액은 인겔 분석, 네이티브 또는 변성 전기영동을 통한 용출 단백질의 은 염색, 웨스턴 블로팅과 같은 추가 분석에 사용됩니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 3일에는 미토콘드리아 분리, 하룻밤 동안 진행되는 blue native maxi electrophoresis 및 immunoblotting 과정이 포함됩니다. 이 영상을 시청하고 나면 native electrophoresis, in-gel assay 및 electroelution을 이용하여 미토콘드리아 supercomplex를 분리하고 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 절차를 수행할 때, 미토콘드리아 슈퍼컴플렉스는 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 시료의 동결 및 해동은 최소한으로 제한해야 합니다. Native 전기영동 및 전기용출은 얼음 위 또는 저온실에서 수행해야 합니다.이러한 기술의 함의는 각 슈퍼컴플렉스의 물리적 조성을 규명하는 것 이상으로 확장됩니다. 슈퍼컴플렉스가 본연의 형태로 포착되기 때문에 기능적 분석이 가능합니다. 이 기술이 개발된 이후, 미토콘드리아 생물학 분야의 연구자들은 미토콘드리아 전자 전달 활성과 그것이 미토콘드리아 질환 환자들에게 미치는 영향에 대한 이해를 재평가할 수 있는 길을 열었습니다.이 절차 이후에 HPLC, 질량 분석법, 전자 현미경 또는 패치 클램핑과 같은 다른 방법들을 수행하여, 분리된 단백질 복합체의 분자 조성, 구조 또는 전기생리학적 특성과 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

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파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

이 프로토콜에서는 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 보여 줍니다. 여기 경작된 한 인간 세포에 적용 하는 방법을 설명 합니다.

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미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

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