혈관 시각화를위한 DiI 관류 암 브리 스 토마 멕 시카 눔

이 절차의 전반적인 목표는 아홀로틀의 혈관 구조를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 아홀로틀에서 재생 조직의 혈관재생의 복잡성에 대한 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 혈관 시각화 기술의 주요 장점은 동물의 모든 혈관을 표준 형광 현미경에서 쉽게 이미지화할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 아홀로틀 사지 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 꼬리, 심장, 눈, 아가미 또는 기타 장기와 같은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다. 아홀로틀 가슴을 열기 전에 먼저 발가락 꼬집기로 적절한 수준의 진정제를 확인하십시오. 그런 다음 수술용 겸자를 사용하여 어깨 선 바로 아래 가슴의 중심축을 따라 피부를 꼬집습니다.

메스를 사용하여 피부를 당겨 절개하고 가슴 위의 사각형 피부를 제거하면 두 개의 연골 플레이트가 드러납니다. 다음으로, 흉강 위의 창을 열고 큰 혈관을 절단하지 않고 결합 조직을 조심스럽게 찢습니다. 집게를 사용하여 각 연골 플레이트를 개별적으로 들어 올리고 수술 용 가위로 각 플레이트를 절제합니다.

노출된 심낭을 집게로 조심스럽게 꼬집습니다. 조직을 위로 당겨 수술용 가위로 구멍을 뚫어 심장을 손상시키지 않고 심낭을 제거할 수 있을 만큼만 깊게 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 심낭을 부드럽게 제거하여 심장과 대동맥을 노출시켜 심장에서 갈라진 대동맥에서 약 5mm 떨어진 곳에서 심장을 명확하게 볼 수 있습니다.

아홀로틀을 관류하려면 폴리스티렌 폼 프레임 옆에 장전된 버터플라이 바늘이 있는 클램프 스탠드를 놓아 클램프 암을 바늘 삽입을 위해 쉽게 조작할 수 있도록 합니다. 연동 펌프를 켜서 펌프 튜브를 통해 0.7x PBS를 플러시하고 바늘 끝이 관절 쪽을 향하도록 합니다. 집게를 대동맥궁 아래로 밀어 넣고 약간 위로 당깁니다.

그런 다음 바늘 클램프 조합을 움직여 바늘이 대동맥의 길이를 따라 동물의 머리 쪽으로 흐르도록 하고 바늘을 대동맥에 약 5mm 삽입하여 집게를 대동맥 뒤에 유지하여 지지합니다. 성공적인 삽입은 심장 심방의 눈에 띄는 비대에 의해 확인될 수 있습니다. 한쪽 심방을 빠르게 찢고 혈액이 빠져나가도록 합니다.

그런 다음 아홀로틀에 약 20-30밀리리터의 PBS를 관류합니다. 성공적인 관류 후 동물의 색이 밝은 분홍색에서 흰색으로 변해야 합니다. 모든 PBS가 관류되면 연동 펌프를 일시 중지하고 튜브의 다른 쪽 끝을 15ml Dil 용액 튜브로 이동합니다.

펌프를 다시 시작하고 튜브에 기포가 생성되지 않도록 주의하고 작동하는 전체 Dil 스톡으로 동물을 관류합니다. 성공적인 관류에서 axolotl은 아가미에서 가장 눈에 띄는 밝은 분홍색으로 바뀝니다. 모든 Dil이 관류되면 펌프를 일시 중지하고 튜브의 자유 끝을 4% 파라포름알데히드 용액에 넣습니다.

그런 다음 펌프를 다시 시작하고 고정액을 10ml 이상 관류합니다. 파라포름알데히드가 모두 투여되면 펌프를 멈추고 바늘을 제거합니다. 아홀로틀을 플라스틱 접시에 옮기고 접시를 형광 현미경 스테이지에 놓습니다.

그런 다음 조명을 끈 상태에서 빨간색 주황색 빛을 방출하는 Dil의 여기를 허용하는 필터를 선택합니다. 성공적인 관류 후, 딜 염색은 꼬리, 팔다리, 아가미 및 눈을 포함한 모든 아홀로틀 조직에서 적색 입원 신호로 볼 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 흉강을 여는 동안 주요 혈관이나 심장이 찢어지지 않도록 주의하고 구멍을 뚫는 것을 방지하기 위해 대동맥과 일직선으로 바늘을 삽입하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 골격 준비와 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물 의학 분야의 연구자들이 다양한 종의 혈관 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 카르보시아닌 염료인 Dil을 사용하여 아홀로틀의 심장 관류를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.바늘과 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.