잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 골수 중간엽 줄기세포 또는 BMSC에서 유래한 원형질막 소포 또는 PMV를 사용하여 생쥐의 비복근에 새로운 세포질 대체 요법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 PMV 융합을 통해 다른 BMSC의 젊은 세포질을 가진 세포를 보충하여 연령 연관 표현형을 개선하거나 역전시킬 수 있는 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 BMSC 사이토졸의 PMV 캡슐화와 기계적 압출에 의해 즉시 유도될 수 있다는 것입니다.

이 방법을 시연할 때는 돌출 및 구성 단계가 실제로 소유하는 것까지 테스트하여 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. PMV를 생성하기 위해 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 6웰 플레이트의 1웰 중 1웰에 있는 완전한 DMEM 배양 배지에서 1차 배양 마우스 BMSC를 5%의 이산화탄소로 만듭니다. 세포가 90% 포화도에 도달하면 0.5ml의 칼슘이 없는 PBS로 웰을 헹구고 0.5ml의 0.25%트립신-EDTA로 세포를 분리합니다.

섭씨 37도에서 3분 후 손바닥으로 플레이트를 몇 번 두드려 세포 해리를 촉진하고 1ml의 배양 배지로 소화를 중지합니다. 원심분리를 위해 세포를 5ml 원뿔형 튜브로 옮기고 펠릿을 4ml의 신선한 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 새로운 6웰 플레이트의 2웰 사이에서 세포를 나누고 플레이트를 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

다음날, 방금 설명한 것처럼 트립신 소화를 통해 한 우물에서 세포를 수확합니다. 원심분리에 의해 채취한 후 0.5 밀리리터의 신선한 배양 배지에 펠릿을 재현탁. 1밀리리터 인슐린 주사기에 세포를 넣고 주사기를 필터 장치에 부착합니다.

플런저를 빠르게 눌러 필터를 통해 세포를 짜내고 압출된 매체를 버립니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 필터를 통해 0.5ml의 추가 배양 배지를 로드하고 분주하여 두 번째 압출에서 배지를 수집합니다. 수집된 배지 150마이크로리터를 35ml 유리 바닥 접시에 파종하고 소포가 약 10분 동안 가라앉도록 합니다.

그런 다음 20배 대물 렌즈를 사용하여 CCD 카메라가 장착된 도립위상차 현미경에서 PMV의 존재를 확인합니다. PMV의 미토콘드리아 인클로저 및 막 전위를 추적하려면 신선한 배양 배지에서 각각 섭씨 37도에서 30분 동안 적절한 미토콘드리아 염료 또는 미토콘드리아 막 전위 프로브로 90% 합류 BMSC 배양물을 염색합니다. 그런 다음 세척당 0.5ml의 PBS로 세포를 세 번 헹구고 컨포칼 현미경으로 시각화하기 위해 입증된 바와 같이 PMV 생성을 위한 트립신 소화로 세포를 수확합니다.

PMV 단백질의 세포질 국소화를 추적하기 위해 먼저 EGFP 발현 카세트용 초코일 플라스미드 DNA 2마이크로그램을 희석하고 50마이크로리터의 무혈청 DMEM을 함유한 개별 0.5밀리리터 튜브에 6마이크로리터의 양이온 형질주입 시약을 희석합니다. 튜브를 소용돌이친 다음 간단한 원심분리를 합니다. 그런 다음 희석된 DNA 용액이 들어 있는 튜브에 transfection 시약을 적하하여 추가합니다.

DNA transfection 혼합물을 1분 동안 강력하게 소용돌이친 다음 실온에서 10분 동안 배양하여 잠시 회전시킵니다. 다음으로, 2ml의 신선한 배양 배지가 있는 6웰 플레이트에 30%confluent BMSC 배양액을 공급하고 DNA 혼합물을 세포에 적하합니다. transfection 후 48시간 후에 트립신 분해를 통해 BMSC를 수확하고 방금 설명한 대로 PMV를 준비합니다.

그런 다음 100배 오일 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경으로 PMV를 분석할 수 있습니다. PMV를 주입하기 전에 섭씨 37도에서 30분 동안 1ml의 신선한 배양 배지에 멤브레인 염색 형광 세포 추적기 염료로 BMSC 배양액을 라벨링하고 트립신 분해로 세포를 수확합니다. 폴리에틸렌 아민 1마이크로그램이 보충된 0.5ml의 신선한 배양 배지에 라벨링된 세포를 재현탁시키고 시연된 바와 같이 PMV를 준비합니다.

그런 다음 원심분리로 PMV를 농축하고 펠릿을 부드러운 소용돌이로 100마이크로리터의 신선한 배양 배지에 재현탁시킵니다. 다음으로, 30 게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 인슐린 주사기에 세포를 넣고 마취된 BALB/c 마우스의 비복근 외부를 75% 에탄올로 소독합니다. 그런 다음 PMV의 전체 부피를 근육에 천천히 주입하고 동물이 열 램프 아래에서 회복할 수 있도록 합니다.

12시간 후 근육에 에탄올 75%를 뿌리고 가위로 피부를 열고 양쪽 끝의 비복근 전체를 채취합니다. PBS로 근육을 헹구고 형광 현미경 아래에 놓습니다. 20배 대물렌즈를 사용하여 날카로운 면도날로 형광이 발하지 않는 근육 조직 조각을 제거하고 남아 있는 강한 빨간색 형광 조각을 약 9입방 밀리미터 입방체로 다집니다.

각 큐브를 최적의 절단 온도 매체에 끼워 넣습니다. 그런 다음 큐브를 액체 질소에 5분 동안 담그십시오. 그리고 조직 샘플은 분석될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

시연된 바와 같이 BMSC에서 생성된 PMV는 주로 20배 대물렌즈를 사용하여 위상차 현미경 검사에서 검사한 바와 같이 직경이 약 3마이크로미터 범위의 크기를 나타냅니다. 48시간 동안 형광 발현 카세트를 사용한 BMSC transfection은 PMV에 의한 EGFP 단백질의 세포질 캡슐화를 보여줍니다. 또한, 형광 미토콘드리아 염료를 가지고 서 있으면 PMV의 상당 부분이 미토콘드리아를 포함하고 있음을 알 수 있습니다.

그 중 대다수는 미토콘드리아 막 전위 염료에 대해 양성으로 염색되어 미토콘드리아의 기능을 나타냅니다. 체내 투여 전에 폴리에틸렌 아민을 처리하면 세포 성분 제거를 위한 원심 농축 중 PMV 응집을 방지할 수 있습니다. PMV 생성 전 BMSC의 멤브레인 염료 라벨링은 형광 추적 가능한 PMV의 생성을 용이하게 합니다.

실제로, 표지된 PMV의 근육 내 전달 후 비복근의 동결 부분을 시각화하는 것은 아마도 세포내이입(endocytosis)을 통해 근육 세포 세포질로의 PMV 전달을 나타냅니다. PMV 생성 절차를 시도할 때 필터를 통해 세포를 플러시할 때 플런저를 빠르게 누를 수 있도록 적절한 수의 셀을 주사기에 로드하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 줄기세포 치료 분야의 연구자들이 쥐의 노화 관련 질병 치료를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 BMSC에서 PMV를 준비하여 세포질이 마우스의 비복근으로 전달되도록 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.