Name: 잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 골수 간엽 줄기 세포에서 혈장 막 소포를 제조하여 노화 관련 표현형을 개선하는 세포질 대체 요법을 구현하는 방법. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국의 자연 과학 재단 (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665)의 Li Ka Shing Foundation, 광동 고 수준 대학 프로젝트 &quot;해양 산업을위한 녹색 기술&quot; 81172894, 81370925) 및 광동 교육부 (http://www.gdhed.edu.cn/ 보조금 번호 cxzd1123).

8-12 주된 BALB / c 마우스는 Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China)에서 구입하여 특정 병원균이없고 공기가없는 동물 시설에서 자랐습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 산 터우 대학 (Shantou University)에 의해 설립 된 실험용 동물의 사용 및 관리에 대한 지침을 준수했습니다. 1. 장치의 조립 <ol><li> 무균 상태를 유지하려면 사용하기 전에 30 분 동안 조직 배양 후드의 자외선을 켭니다. </li><li> 일회용 25 mm 필터 유닛의 나사를 풀고 캡과 장치의 바닥을 75 % 에탄올이 채워진 200 mL 유리 컵에 30 분간 담근다. 의료용 폴리 프로필렌으로 만들어졌습니다. </li><li> 포셉을 사용하여 장치의 뚜껑과 바닥을 잡고 남은 에탄올을 손으로 털어 내고 부품을 후드에서 10 분 동안 공기 건조시킵니다. </li><li> PBS에 19mm 폴리 카보네이트 멤브레인을 적신 다음 조심스럽게 보토의지지 매트릭스 위에 올려 놓습니다m입니다. 고분자 필름은 매끄럽고 평평한 표면을 가지고 있으며 3 μm의 공극을 트랙 에칭했습니다. </li><li> 캡을 바닥에 단단히 조여서 장치를 다시 조립하십시오. 멤브레인이 중앙에서 빠지지 않았는지 확인하십시오. </li><li> 1 ML 인슐린 주사기의 바늘을 제거하고 PBS 1 ML을 그립니다. 주사기를 필터 장치에 연결 한 다음 PBS를 장치에 밀어 넣어 어셈블리를 적시고 누출이 있는지 테스트하십시오. </li></ol> 2. 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성 <ol><li> Nemeth et al. 에 의해보고 된대로 BMSC 문화를 확립 하십시오. 15 , 15 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배양 배지에서 배양 하였다. 37 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 humidified 인큐베이터에서 6 잘 접시에있는 세포를 육성. </li><li> 세포를 증식시키기 위해 배양 배지를 제거하고 칼슘이없는 PBS 0.5 mL로 잘 헹구십시오. </li><li> 0.25 % 트립신 - EDTA 0.5 ML을 추가하고 37에서 세포를 품어 ° C3 분 동안. 손바닥에 대해 접시를 몇 번 두드려 세포 분리를 촉진하십시오. 배양액 1 mL를 넣어 소화를 멈춘다. </li><li> 벤치 상단 원심 분리기에서 2 분 200 XG 15 ML 원뿔 튜브와 회전에서 세포를 수집합니다. 배지 4 ML에 세포를 Resuspend하고 6 - 웰 플레이트의 두 우물에 세포를 나누어지는. 참고 : 세포는 대개 24 시간 내에 합류합니다. </li><li> PMVs를 생성하기 위해 트립신 소화에 의해 6-well plate의 한 well (약 5 x 10 5 cell)에서 세포를 수확하고 0.5 mL의 배양 배지에서 monodisperse시킨다. </li><li> 인슐린 주사기에 세포를 넣고 필터 장치에 연결 한 다음 플런저를 빠르게 밀어 필터를 통과하는 세포를 쥐어 짜십시오. 내부에 몇 개의 PMV 만 있어야하기 때문에 압출 된 매체를 버립니다. </li><li> 주사기에 추가로 0.5 mL의 배지를 넣고 신속하게 필터를 통과시킵니다. 포함 된 두 번째 압출 매체 수집다양한 크기의 PMV. </li><li> 수집 된 매체 150 μL를 35 mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 고정시킵니다. 20X 대물 렌즈를 사용하여 CCD 카메라가 장착 된 역상 위상차 현미경으로 PMV를 검사합니다. </li></ol> 3. 공 촛점 현미경을 이용한 PMV 내의 내용물 검사 <ol><li> BMSC에서 트랜 스펙 션을 수행하려면 50 μL의 무 혈청 DMEM에 2 μg의 supercoiled plasmid DNA와 6 μL의 양이온 transfection reagent ( 예 : PolyJet)를 희석하십시오. 소용돌이가 잘 섞이고 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하기 위해 잠시 회전합니다. </li><li> 희석 된 DNA 용액에 희석 된 용액 (단계 3.1에서)을 적가하고, 1 분 동안 강하게 와동시키고, 짧게 회전시키고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한다. </li><li> 하룻밤 동안 약 30 %의 농도로 배양 된 BMSC의 새 배지를 2 mL의 새로운 배양 배지로 교체하고 DN형질 전환 혼합물을 적가합니다. </li><li> 형질 감염 12 시간 후 신선한 매체 2 ML로 바꿉니다. </li><li> 세포질로 현지화 된 단백질을 추적하려면 위에 설명한대로 EGFP 발현 카세트 (pEGFP-N1)를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시킵니다. 위에서 설명한대로 PMV 생성에 대한 transfection 48 시간 후 트립신 소화에 의해 세포를 수확. </li><li> 미토콘드리아를 추적하려면 37 ° C에서 30 분 동안 신선한 배지에서 미토콘드리아 염료 (1 μM, MitoTracker)로 세포를 염색하십시오. </li><li> 미토콘드리아의 막 전위를 검출하기 위해, 시아닌 염료 JC-1 (5,5 &#39;, 6,6&#39;- 테트라 클로로 -1,1&#39;, 3,3&#39;- 테트라 에틸 벤즈 미미 - 다 졸릴 카르 보시 아닌 요오드화물) (10 μg / ML) 37 ° C에서 30 분 신선한 배지에서. <ol><li> 위에서 설명한대로 PBS 0.5 ML의 세 번 세포를 씻어 후 PMV 생성에 대한 트립신 소화에 의해 세포를 수확. </li><li> 150 μL의 수집 된 med로드ium을 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 내려 놓습니다. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 PMVs를 검사하십시오. </li></ol></li><li> EGFP 또는 미토콘드리아 염료를 검출하려면 488 nm 레이저를 켜고 505-530 nm에서 신호를 수집하십시오. JC-1을 감지하려면 488nm 및 543nm 레이저를 켜고 505-530nm 및 560-615nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오. </li></ol> 4. 원심 분리에 의한 농축 된 PMV의 제조 <ol><li> 트립신 소화에 의해 세포를 수확하고 위에서 설명한대로 PMVs를 0.5 ML 문화 매체에 생성합니다. </li><li> 상온에서 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 1,200 xg로 PMV를 돌립니다. 조심스럽게 상등액을 기음과 부드러운 소용돌이와 문화 매체의 100 μL에 펠렛을 resuspend. </li><li> 35mm 유리 바닥 접시에 50 μL의 PMV를로드하고 약 10 분 동안 실온에서 안정되게하십시오. PMV 검사40X 오일 대물 렌즈를 사용하는 공 촛점 현미경 하에서. </li><li> 1 시간 동안 BMSC 배양 물에 일련의 희석 된 폴리에틸렌 이민 (PEI) 용액을 첨가하고 세포 독성의 징후를 확인하십시오. 참고 : BMSC에서 독성의 징후가 발견되지 않았으므로 여기서 2 μg / mL의 PEI를 선택했습니다. </li><li> 트립신 소화하여 세포를 수확하고 응집을 방지하는 수단으로 세포막을 충전 1 H 2 μg / ML에 PEI를 추가합니다. 위에서 설명한대로 0.5 ML 문화 매체에서 PMVs를 생성합니다. 위에서 설명한대로 PMV를 집중시키고 공 촛점 현미경으로 검사하십시오. </li></ol> 5. 비복근 근육에 PMV 주사 <ol><li> 막을 염색하기 위해 30 분 동안 BMSCs에 신선한 문화 매체 1 ML에 CM - DiI (chloromethyl dialkyl - indocarbocyanine) (10 μm의) 염료를 추가합니다. </li><li> 트립신 소화에 의해 세포 (약 5 x 10 5 )를 수확하고 배양 배지 0.5 mL에 그들을 재현 탁한다. PEI (2 μg / mL)를 1h. 위에 설명한대로 PMV를 생성하고 100 μL의 배지에 집중시킵니다. </li><li> 12 시간의 금식 후 sodium barbital (10 mg / kg)을 주사하여 BALB / c 마우스를 마취시킨다. </li><li> 75 % 에탄올로 위의 근육의 외부를 청소하십시오. 천천히 30 G 인슐린 주사기를 사용하여 비복근 근육에 PMV (100 μL)를 주입합니다. </li><li> 마취를 시행 한 후, 실험 기간 동안 눈 위에 젖은 거즈를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 백열등으로 따뜻하게합니다. 개별 환기 케이지에 마우스를 홀로 두십시오. </li><li> 수술 12 시간 후 gastrocnemius 근육을 수확하려면 경추 탈구로 마우스를 죽이십시오. </li><li> gastrocnemius 근육 위에 75 % 에탄올을 뿌리고, 가위로 피부를 열고 양끝에서 전체 gastrocnemius 근육을 잘라내십시오. </li><li> PBS로 근육을 헹구고 20X 객관적인 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 검사하십시오. </li><li> 근육을 손질해라.날카로운 면도날로 형광이없는 부분을 제거합니다. 약 9mm 3의 입방체로 강한 붉은 색 형광으로 부품을 자릅니다. </li><li> 최적의 절삭 온도 매체 (OCT)에 각 큐브를 삽입하고 5 분 동안 액체 질소에 담그고 -20 ° C의 냉동고에 보관하십시오. </li><li> 냉동 섹션을 저온 유지 장치를 사용하여 20 μm 두께로 자르고 각 섹션을 유리 슬라이드에 부착하십시오. PBS로 절편을 한 번 헹굽니다. </li><li> 얼룩 원형 펜으로 섹션 주위에 원을 그려 DAPI (1 μg / ML) 100 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 10 분 잠복 후 DAPI 솔루션을 대기음과 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 시험편 위에 오일을 떨어 뜨리고, 유리 슬립으로 덮고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 섹션을 검사하십시오. </li><li> CM-DiI를 검출하기 위해서는 543 nm 레이저를 켜고 560-615 nm에서 신호를 수집하십시오. DAPI를 감지하려면 405를 켭니다.420-480 nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오. </li></ol>

<ol><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li>
<li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems%3A+recent+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional%2C+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li>
<li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li>
<li>López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00645-4">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
<li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li>
<li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li>
<li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+amyloid-%CE%B2+harmful+to+the+brain%3F+Insights+from+human+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li>
<li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li>
<li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+keeping+that+old+broom+working%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li>
<li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23454757">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41(2016).</li>
<li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+heart+and+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li>
<li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).</li>
<li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+B%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li>
<li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine%3A+A+versatile%2C+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li>
</ol>

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이 원고에서 제안된 세포질 대체 요법은 유전자, 분자 및 세포 요법과 같은 다른 보고된 접근법에 비해 고유한 이점을 가지고 있습니다. BMSC에서 생성된 PMV는 줄기 유전자의 산물뿐만 아니라 노화와 관련된 노화 표현형을 치료하는 데 필수적인 온전한 세포 소기관도 캡슐화합니다. 젊은 세포질이 노화 세포에 전달되면 오작동 메커니즘이 잠시 완화될 수 있습니다. 동시에 후성유전체를 재프로그래밍하고 활성화하여 오래 지속되는 효과를 제공할 수 있습니다. 또한, 외인성 미토콘드리아는 이전 연구12에서 나타난 바와 같이 증식 속도가 더 빠를 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 노화 질환과 관련이 있기 때문에 손상된 미토콘드리아의 교체는 필수적입니다11. 또한, 줄기 세포와 달리 적출된 PMV는 증식할 수 없습니다. 따라서 암 발병에 대한 우려를 제기할 가능성은 거의 없습니다. 마지막으로, PMV에 핵 DNA가 부족하면 DNA 무작위 통합에 의한 게...

<html> 유전자, 효소 및 세포 대체 요법에 대한 접근법을 수립하는데 엄청난 노력이 기울여왔다. 이것은 획기적인 발전을 가져 왔고 심지어 임상 적용 1 , 2 , 3을 가져 왔습니다. 최근 핵 전달 기술에 기반을 둔 논란이되고있는 미토콘드리아 보충 요법이 ​​노년기 여성 또는 치명적인 mitochondrial DNA 돌연변이를 가지고있는 체외 수정에 적용되었습니다. 아테롬성 동맥 경화증, 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암을 포함한 연령 관련 질환에서 발견되는 결함은 대개 다각적입니다. 지질 방울의 축적이 문서화되어있다. 아밀로이드 단백질의 침전; 소포체에서 전개되지 않은 단백질의 유지; autophagosome, mitochondria가 이들 질병의 발달 또는 악화에 기여한다.&quot;xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 현재, 노화 및 노화 표현형을 일으키는 세포질 및 세포 기관에서의 오작동의 직접적인 개선을 목표로하는 이용 가능한 메커니즘이 없다. 우리는 이전에 포유 동물 세포의 기계적 압출을 통해 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했습니다 12 . 핵을 제외하고는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관뿐만 아니라 단백질과 RNA를 비롯한 막 또는 세포질의 구성 요소가 PMV에서 발견되었습니다. 본질적으로, PMV는 소형 핵 세포로 간주 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 문화 조건 하에서 mitotic 활동을 복원했다. 이것은 첫 번째 보고서입니다.세포질 대체 요법을위한 잠재적으로 효율적인 접근 방법을 제시하고있다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 골수에서 일상적으로 생성되는 다 분화 선조 세포 (multipotent progenitor cell)이며 배양 물에서 쉽게 확장됩니다. 배아 줄기 세포 마커 Oct4, Nanog 및 SOX2는 MSCs 13 에서 낮은 수준으로 검출되었다. 텔로 머라 아제 활성도 측정 가능합니다. 또한 MSC에서의 낮은 HLA Class I 발현뿐만 아니라 공동 자극 분자 및 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II 분자의 부재는 동종 이성체 또는 &quot;기성품 인&quot;사용에 이상적인 세포로 작용합니다. 재생 의학 및 면역 조절 응용 14 . 여기, 우리는 3 μm의 공극을 가진 폴리 카보 네이트 멤브레인을 통해 압출을 통해 마우스 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법, 미토콘드리아의 존재를 결정하는 방법 및 PMV에서 멤브레인 잠재력의 유지를 검사하는 방법을 설명합니다.현미경 검사법으로 원심 분리에 의해 응축 된 PMV가 아닌 농축 된 PMV를 준비하고 PMV를 생쥐의 비복근 내로 주입합니다.

<table><tbody><tr><td>IsoporeTM 막</td><td>Millipore</td><td>TSTP04700</td><td>3mm 포어</td></tr><tr><td>일회용 필터 유닛</td><td>Xinya, 상하이, 중국</td><td>25mm</td><td>의료용 폴리프로필렌</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td></td><td>328446 1 mL</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&nbsp; 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker</td><td>분자 프로브</td><td>M7514</td><td>Green FM, 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime, Haimen, China</td><td>C2006</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime, Haimen, China</td><td>C1036</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75,000</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td>, <td>CCD 카메라</td></tr><tr><td>포함 Confocol 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SigaGen</td><td>SL100688</td><td>세포 형질 주입용</td></tr></tbody></table>

잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

우리는 이전에 포유류 세포의 기계적 압출을 통한 원형질막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했다. 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 배양 조건 하에서 유사 분열 활성을 회복시켰다. 죽상 동맥 경화증, 제 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암은 다양한 세포 유형의 세포질 및 세포 소기관에서 여러 가지 기계적 및 기능적 결함과 관련이 있다고보고 된 연령 관련 질환입니다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 다 기능성을 유지하면서자가 재생 능력을 보유한 골수에서 유래 된 독특한 세포 집단을 대표합니다. PMVs의 융합을 통한자가 BMSCs로부터의 어린 세포질을 가진 노화 세포의 보충은 노화와 연관된 표현형을 개선하거나 심지어 역전시키는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 압출을 통해 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법을 설명합니다.1, 공극, 미토콘드리아의 존재를 결정하고 공 촛점 현미경을 사용하여 PMV 내의 막 전위의 유지를 검사하고, 원심 분리에 의해 PMV를 농축하고 생쥐의 비복근 내로 PMV의 생체 내 주입을 수행한다.

PMV의 성공적인 제조의 열쇠는 1 mL의 PBS를 멤브레인을 통과시켜 시험 할 수있는 필터 유닛 ( 그림 1 )의 정확한 조립에 크게 의존합니다. 누출이 발생하면 필터 장치를 다시 조립하고 다시 테스트하십시오. 그러나 누설은 세포가 멤브레인을 통과 할 때만 신뢰성있게 테스트 할 수 있습니다. 단지 10X 대물 렌즈를 사용하는 일반적인 현미경으로 PMV가 몇 개 발견되거나 PMV의 크기가 대부분 1μm 정도라면 부정확 한 조립으로 인해 대부분의 세포가 장치 내부에 갇히게됩니다. 직경 약 3 μm 범위의 PMV는 20X 대물 렌즈 ( 그림 2 )를 사용하여 위상차 현미경으로 검사했을 때 가장 두드러졌습니다. 나노 미터 크기의 PMV는 쉽게 시각화되지 않았기 때문에, 큰 PMV의 수에 대한 비율은 낮았다. 재빨리 주사기를 눌러서 다시 주사하는 것이 도움이되는 것으로 판명되었습니다.명백하게 구형 PMV를 형성하지 ...

연령 관련 질환은 세포질 구성 요소의 여러 결함과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 골수 간엽 줄기 세포에서 플라즈마 막 소포를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기법은 연령 관련 phenotypes을 개선하거나 심지어 심지어 세포질 대체 요법의 수단으로 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 골수 중간엽 줄기세포(BMSCs)에서 유래한 세포막 소포체(PMVs)를 이용하여 마우스의 비복근에 새로운 세포질 대체 요법을 전달하는 것입니다. 이 방법은 다른 BMSC의 젊은 세포질을 PMV 융합을 통해 보충함으로써 노화 관련 표현형을 완화하거나 심지어 역전시킬 수 있는지에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기계적 압출을 통해 BMSC 세포질의 PMV 캡슐화를 즉각적으로 유도할 수 있다는 점입니다.이 방법을 시연할 때는 압출 및 구조 형성 단계가 직접 경험해 보기 전에는 단순히 테스트만으로는 습득하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. PMV를 생성하려면, 먼저 습윤 배양기(37 °C, 5% CO2) 내의 6-웰 플레이트 한 웰에서 완전 DMEM 배양 배지를 사용하여 마우스 BMSC를 배양하십시오. 세포가 90% 합류도에 도달하면, 0.5 mL의 칼슘 제거 PBS로 웰을 헹구고 0.5 mL의 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 탈착하십시오.37°C에서 3분 후, 손바닥으로 플레이트를 몇 번 두드려 세포 해리를 촉진하고 1 mL의 배지로 소화를 중단시킵니다. 세포를 5 mL 원심분리 튜브로 옮겨 원심분리한 후, 펠렛을 4 mL의 신선한 배지로 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 새로운 6웰 플레이트의 두 웰에 나누어 담고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣어 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 방금 시연한 것과 같이 트립신 소화를 통해 웰 하나에서 세포를 수확하십시오. 원심분리로 수집한 후, 펠릿을 0.5 milliliters의 신선한 배양 배지에 다시 현탁합니다. 세포를 1 milliliter 인슐린 주입기에 넣고 주입기를 필터 유닛에 연결하십시오.플런저를 빠르게 눌러 세포를 필터를 통해 짜내고, 밀려 나온 배지는 버립니다. 그런 다음 앞서 시연한 것과 같이 추가 배양액 0.5 milliliters를 필터에 넣고 분주하며, 두 번째로 밀려 나오는 배지를 수집합니다. 수집한 배지 150 microliters를 35 milliliter 유리 바닥 디쉬에 접종하고 소포가 약 10분 동안 가라앉도록 둡니다.그 다음, CCD 카메라가 장착된 도립 위상차 현미경의 20배 대물렌즈를 사용하여 PMV의 존재를 확인합니다. PMV 내의 미토콘드리아 포괄 구조와 막 전위를 추적하려면, 90% 밀도로 증식한 BMSC 배양물에 신선한 배양액과 함께 적절한 미토콘드리아 염색약 또는 미토콘드리아 막 전위 프로브를 각각 처리하여 37 °C에서 30분 동안 염색합니다. 이후 세척당 0.5 mL의 PBS로 세포를 3회 헹구고, 공초점 현미경 시각화 과정에서 보여준 것과 동일하게 트립신 소화를 통해 세포를 수확하여 PMV를 생성합니다.PMV 단백질의 세포질 내 국소화를 추적하려면, 먼저 EGFP 발현 카세트를 위한 2 µg의 supercoiled plasmid DNA와 6 µL의 양이온성 transfection reagent를 각각 50 µL의 무혈청 DMEM이 들어 있는 0.5 mL 튜브에 희석합니다. 튜브를 볼텍싱한 후 짧게 원심분리합니다. 그다음, 희석된 DNA 용액이 들어 있는 튜브에 transfection reagent를 한 방울씩 첨가합니다.DNA 트랜스펙션 혼합물을 1분 동안 강하게 보텍싱한 후, 짧게 원심분리하고 상온에서 10분간 배양합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트에 30% 합류된 BMSC 배양액에 2mL의 신선한 배양 배지를 공급하고 DNA 혼합물을 세포에 한 방울씩 첨가합니다. 트랜스펙션 48시간 후에 트립신 소화를 통해 BMSC를 회수하고, 앞서 시연한 방식대로 PMV를 준비합니다.그 후 100배 오일 대물렌즈를 사용한 공초점 현미경으로 PMV를 분석할 수 있습니다. PMV를 주입하기 전, 37 °C의 신선한 배지 1 mL에서 막 염색 형광 세포 추적 염료로 BMSC 배양물을 30분 동안 염색하고, 트립신 소화를 통해 세포를 회수합니다. 염색된 세포를 1 µg의 polyethylene amine이 첨가된 신선한 배지 0.5 mL에 재현탁하고, 시연된 방식대로 PMV를 준비합니다.그런 다음 원심분리를 통해 PMV를 농축하고, 펠릿을 100 µL의 신선한 배양 배지에 넣고 가볍게 소용돌이치듯 섞어 재현탁합니다. 다음으로, 30 gauge 바늘이 장착된 1 mL 인슐린 주사기에 세포를 로딩하고, 마취된 BALB/c 마우스의 비복근 외부를 75% ethanol로 소독합니다. 그 후 PMV 전체 용량을 근육 내에 천천히 주입하고, 동물이 가열 램프 아래에서 회복되도록 합니다.12시간 후, 근육 위에 75% ethanol을 뿌리고 가위로 피부를 절개한 다음, 양 끝단을 포함한 비복근(gastrocnemius muscle) 전체를 채취합니다. 근육을 PBS로 헹구고 형광 현미경 아래에 놓습니다. 20배 대물렌즈를 사용하여 형광이 나타나지 않는 근육 조직 조각들을 날카로운 면도날로 제거하고, 강한 적색 형광이 나타나는 나머지 조각들을 약 9mm³ 크기의 정육면체 모양으로 잘게 다집니다.각 큐브를 최적 절단 온도 배지(OCT medium)에 매립합니다. 그런 다음 큐브를 액체 질소에 5분 동안 담급니다. 조직 샘플은 분석 전까지 -20°C에서 보관합니다.20배 대물렌즈를 사용한 위상차 현미경으로 관찰한 결과, BMSCs로부터 생성된 PMVs는 주로 직경 약 3 µm 범위의 크기를 나타냅니다. 형광 발현 카세트를 사용하여 BMSCs를 48시간 동안 형질전환시키면 PMVs에 의해 EGFP 단백질이 세포질 내에 캡슐화된 것을 확인할 수 있습니다. 또한, 형광 미토콘드리아 염색약을 처리하면 PMVs의 상당 부분에 미토콘드리아가 포함되어 있음이 드러납니다.이들 중 대부분은 미토콘드리아 막 전위 염색약에 양성으로 염색되어 미토콘드리아의 기능성을 나타냅니다. 생체 내 투여 전 폴리에틸렌아민 처리를 통해 세포 성분 제거를 위한 원심분리 농축 과정 중 PMV의 응집을 방지합니다. PMV 생성 전 BMSCs를 막 염료로 표지하면 형광 추적이 가능한 PMV를 생성하는 것이 용이해집니다.실제로, 표지된 PMV를 근육 내로 투여한 후 비복근의 동결 절편을 시각화하면 PMV가 아마도 내세포작용(endocytosis)을 통해 근육 세포 세포질로 전달되었음을 알 수 있습니다. PMV 생성 절차를 수행할 때, 필터를 통해 세포를 세척할 때 플런저를 빠르게 누를 수 있도록 주사기에 적절한 수의 세포를 충전하는 것이 중요합니다. 개발 이후, 이 기술은 줄기세포 치료 분야의 연구자들이 생쥐의 노화 관련 질환 치료를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 마우스의 비복근으로 세포질을 전달하기 위해 BMSC로부터 PMV를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의...

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

이 동영상은 골수 줄기세포를 멤브레인 필터에 빠르게 통과시켜 원형질막 소포를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 PMV는 세포질 대체 요법의 잠재력을 보여줍니다.

Bone Marrow Stem Cells에서 원형질막 소포 생성

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수에서 얻어지며 확장 배양이 필요합니다. 시료가 처리 전에 응고되면 (효소) 혈전용해제인 우로키나아제(urokinase)를 사용하는 프로토콜을 적용하여 혈전을 분해할 수 있습니다. 따라서 세포가 방출되어 확장 배양에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 리샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

여기에서는 인간 골수(hBM)에서 중배엽 전구 세포(MPC)를 분리하기 위한 최적화되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC는 유세포 분석과 nestin 발현을 특징으로 했습니다. 그들은 혈관 형성 잠재력을 유지하면서 기하급수적으로 증가하는 MSC와 같은 세포 배양을 일으킬 수 있는 능력을 보여주었습니다.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

이 프로토콜은 유전자 치료를 위한 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포 생체 모방제를 생산 및 정제하는 방법을 도입하는 것을 목표로 합니다. 나노소포는 MSC 유래 지질 이중층으로 제한되어 있으며, 관심 유전자를 가진 재조합 AAV를 내강에 캡슐화합니다. 이 나노소포는 생체 내 유전자 전달을 위한 향상된 벡터를 제공합니다.

유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

배우세요 골수 간엽 줄기 세포에서 혈장 막 소포를 제조하여 노화 관련 표현형을 개선하는 세포질 대체 요법을 구현하는 방법. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조

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