N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

이 기술의 전반적인 목표는 변형된 시알산 발현을 가진 세포 또는 세포 유래 산물을 생성하는 것입니다. 그러므로, 세포는 N-아실 변형 만노사민으로 처리되며, 이 만노사민은 해당 시알산으로 대사되어 세포 표면에서 발현됩니다. 이 방법은 수용체-리간드 상호 작용에 대한 당접합체에 미치는 영향과 같은 당생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 적용하기 쉽고 순전히 세포 독성이 있다는 것입니다. 대사 글리코엔지니어링을 입증하기 위해 상업적으로 이용 가능한 N-아세틸만노사민을 사용할 것입니다. 또한 N-프로피오닐 및 N-부타노일만노사민의 합성 및 사용을 시연합니다.

polysialic acid의 발현에 대한 대사 당공학의 생물학적 효과가 나타납니다. 먼저, 교반 막대가 들어있는 15 밀리리터 유리병에 3 밀리몰라 나트륨 메톡사이드 용액 10 밀리리터에 만노사민 염산염 431.2 밀리그램을 용해시킵니다. 얼음에 혼합물을 섭씨 0도로 식히십시오.

저어주는 동안 210 마이크로 미터의 프로피오닐 클로라이드를 용액에 천천히 적가하십시오. 그런 다음 교반 혼합물을 섭씨 0도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 50ml 플라스틱 튜브에 옮기고 얇은 바늘로 튜브 캡에 4-8개의 구멍을 뚫습니다.

액체 질소를 사용하여 용액을 빠르게 동결합니다. 그런 다음 샘플이 완전히 건조될 때까지 동결 건조합니다. 동결건조 후 건조된 제품을 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물에 용해시킵니다.

피펫을 사용하여 미리 준비된 실리카겔 컬럼에 용액을 로드합니다. 500ml의 용매를 용출한 후 4mL 분획을 수집합니다. 용출된 분획을 15ml 플라스틱 튜브에 옮기고 얇은 바늘로 튜브 캡에 3-6개의 구멍을 뚫습니다.

용액을 액체 질소로 동결한 후 완전히 건조될 때까지 샘플을 동결 건조합니다. 켈리 신경모세포종 세포를 RPMI 배지에서 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 만노사민을 투여하기 전에 켈리 신경모세포종 세포를 트립신과 EDTA로 10분 동안 배양하여 분리하십시오.

RPMI 배지로 트립신을 중화한 후 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 시알산 단당류를 측정하려면 500마이크로리터의 배지에 있는 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 안착시킵니다. 폴리시알산을 분석하기 위해 3밀리리터의 배지에 담긴 세포를 직경 6cm의 세포 배양 접시에 앉힙니다.

RPMI에 용해된 각각의 만노사민 유도체를 최종 농도 5밀리몰로 갓 도금한 세포에 첨가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양하여 24시간마다 N-아실 변형 만노사민을 함유한 배지를 교체합니다. 처리 후 배지를 디캔팅하고 PBS로 세포를 세척합니다. 세포를 트립신(Trypsin)과 EDTA로 10분 동안 배양하여 분리합니다.

분리된 세포에 동일한 부피의 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 그런 다음 분리된 셀을 15ml 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 상등액을 버리고 500회 G.After disbur Pys.에 3 분 동안 표본을 분리기, PBS의 5 밀리리터로 세포를 3 번 세척하십시오.

원심분리 후, 수집된 세포 펠릿을 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 HPLC 용해 완충액에 재현탁합니다. 초음파 처리기 바늘로 샘플을 중간 높은 진폭에서 30초 동안 세 번 초음파로 처리하고, 사이클 사이에 최소 1분 동안 얼음 위에서 샘플을 냉각합니다. 용해된 세포 샘플을 원심분리한 후 1.5ml 플라스틱 튜브의 멤브레인 분획에서 상등액을 분리합니다.

산 가수분해의 경우, 분리된 멤브레인 분획에 150마이크로리터의 1몰 TFA 용액을 첨가합니다. 섭씨 80도에서 200-600RPM으로 흔들면서 4시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 샘플을 3개의 킬로달톤 배제 멤브레인이 있는 0.5ml 필터 튜브로 운반합니다.

20, 000 시간 G 및 섭씨 21도에서 약 30 분 동안 상부 위상 부피가 20 마이크로 리터 미만이 될 때까지 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 삽입물을 버리고 얇은 바늘로 초여과액이 들어있는 튜브의 캡에 2-4 개의 구멍을 찔러 넣습니다. 액체 질소로 샘플을 동결 한 후 밤새 동결 건조하십시오.

건조된 샘플을 10마이크로리터의 120밀리몰 TFA 용액에 재현탁하고 50마이크로리터의 DMB 용액을 추가합니다. 샘플을 어두운 1.5ml 튜브에 넣어 자외선으로부터 보호합니다. 세포막 샘플과 표준물질을 섭씨 56도에서 1.5시간 동안 배양합니다.

배양 후 각 샘플에 400 밀리몰 수산화나트륨 용액 4 마이크로 리터를 첨가하여 라벨링 반응을 중단합니다. HPLC 분석의 경우 컬럼의 온도를 섭씨 40도로 설정하고 형광 검출기를 여기의 경우 각각 373나노미터, 누락의 경우 448나노미터로 구성합니다. 10마이크로리터의 시료를 주입하고 메탄올, 아세토니트릴 및 물을 용리액으로 사용하여 분당 0.5ml의 유속으로 15분 동안 프로브를 분리합니다.

질량 분석 분석을 위해 수집된 각 HPLC 시료를 20마이크로리터씩 LC 질량 선택 검출기 시스템에 주입합니다. LC 질량 선택 검출기 시스템의 평가 소프트웨어에서 총 이온 크로마토그램에서 관심 피크를 선택합니다. 분해된 피크의 질량 스펙트럼을 보고 300과 700 사이의 양의 질량 대 전하 비율을 표시합니다.

1 밀리리터의 웨스턴 블롯 용해 완충액을 이전에 준비된 글리코 엔지니어링 세포 펠릿에 추가하고 와류를 일으킵니다. 얼음 위에서 5분마다 소용돌이치며 30분 동안 샘플을 배양합니다. 그 다음, 20, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 1.5 시간 동안 표본을 분리기

그런 다음 용해된 세포의 단백질을 포함하는 상등액을 1.5ml 튜브에 수집합니다. 각 단백질 분획의 90마이크로리터에 10마이크로리터의 Laemmli 샘플 버퍼를 추가하여 SDS 페이지용 샘플을 준비합니다. 샘플을 5분 동안 끓입니다.

8%SDS-아크릴아미드 젤에 표본을 적재한 후에, 실내 온도에 2 시간 동안 25 milliamps에 젤을 달리십시오. 완료되면 젤에서 유리 덮개를 조심스럽게 제거하고 로딩 포켓이 들어 있는 젤의 윗부분을 잘라냅니다. 다음으로, 이전에 웨스턴 블롯 버퍼에 담근 0.2 마이크로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 젤을 놓습니다.

시스템의 권장 사항에 따라 단백질을 니트로 셀룰로오스로 옮깁니다. 블로팅 시스템에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 제거한 후 블롯을 Ponceau 빨간색으로 염색하여 단백질을 시각화하고 전달 품질을 제어합니다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플라스틱 챔버로 옮기고 10ml의 차단 용액을 추가합니다.

니트로셀룰로오스 멤브레인을 배양한 후 차단 용액을 디캔팅하고 PBS에 단클론 항폴리시알산 735 항체를 첨가합니다. 배양 후 PBS로 5분 동안 멤브레인을 최소 3회 세척합니다. 이제 양고추냉이 과산화효소에 결합된 다클론 항 마우스 IgG 2차 항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 추가합니다.

멤브레인을 배양하고 세척한 후 적절한 이미저의 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 신호를 감지합니다. DMB로 표지된 N-글리콜릴 뉴라민산은 7분에서 9분 사이에 용리됩니다.

그리고 DMB로 표시된 N-아세틸 뉴라민산은 10분에서 12분 사이에 용리됩니다. 크로마토그램에서 관찰된 여러 개의 작은 피크는 미반응 DMB 및 반응 중간체를 나타냅니다. 세포 용해물의 HPLC 크로마토그램은 정의되지 않은 여러 피크를 보여주며, 이는 세포 용해물에 존재하는 다른 알파 케토산과의 반응으로 인한 내부 불순물 및 DMB 부산물을 나타냅니다.

N-아세틸 만노사민으로 처리하면 세포 표면에서 N-글리콜릴뉴라민산이 고갈되는 경우가 많습니다. N-프로피오닐 뉴라민산 또는 N-부타노일 뉴라민산으로 처리된 용해된 세포의 크로마토그램에서 해당 비천연 시알산의 출현을 나타내는 피크가 관찰됩니다. DMB와 시알산 종의 반응은 이 염료로 표지되지 않은 시알산 종에 비해 116.2 달톤의 분자 질량 증가로 이어집니다.

potentated ion species 외에, sodium adducts도 관찰됩니다. DMB-Neu5Gc는 미반응 또는 부분적으로 반응한 DMB 종 직후에 용리되며, 이는 DMB-Neu5Gc의 질량 스펙트럼에서 정의되지 않은 피크의 출현을 설명합니다. 켈리 신경모세포종 세포를 N-프로피오닐만노사민 또는 N-부타노일만노사민으로 치료하면 세포 표면의 다발산 발현이 감소합니다.

반면에 N-아세틸만노사민으로 치료하면 다중산의 발현이 증가합니다. 이 기술을 적용하면 완전한 시알릴화를 가진 세포가 며칠 내에 생성될 수 있습니다. 이러한 글리코엔지니어링 세포는 추가 실험에 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 수용체-리간드 상호 작용을 연구하거나 여기에 표시된 바와 같이 다중산의 발현을 억제합니다. 여기에 제시된 대사 공학 절차는 시알산 실험에 최적화되어 있습니다. 그러나 동물 실험에서도 동일한 절차를 사용할 수 있습니다.

우리는 우리가 제시한 프로토콜과 이 비디오 제작이 저자가 대사 당공학을 실험실로 가져와 생물학적 시스템에서 시알산 및 시알산 수용체의 기능과 생물학적 역할을 분석하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 유기 화학자들은 더 복잡한 구조를 가진 N-아실 변형 만노사민을 합성하고 프로토콜에서 제안한 대로 이를 사용할 수 있습니다. 당사의 프로토콜에 따라 모든 샘플은 형광 표지 직후 분석해야 합니다.

따라서 HPLC와 ACMS 분석기 사이에 지연이 없어야 합니다.