Name: N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 대사적 글리코엔지니어링을 사용하여 N-아실 변형 마노사민으로 세포 표면 사이알산을 수정하는 방법을. 이 기술은 Kelly 신경모세포에서 사이알산 발현을 조절하고 수용체-리간드 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 합니다 L. D. 구 엔 원고를 교정에 대 한 유익한 토론. 또한, 우리 감사 제이 Dernedde와 H. G. 구 엔 비디오 촬영을 준비 하는 데 도움. 비디오의 대부분 장면 R. 타우버의 실험실에서 촬영 했다. 우리는 또한 콜 로이드 및 인터페이스, 그리고 우리에 게 그들의 질량 분석 시설을 무료로 이용할에 대 한 최대 플랑크 연구소 감사 합니다. RH는 DFG (ProMoAge)에 의해 지원 되었다.

1입니다. 버퍼 및 시 약의 준비
<ol><li>
3mm 나트륨 methoxide 솔루션의 준비
	<ol>
<li>8.1 mg 나트륨 methoxide 메탄올 50 mL (3 m m)에 저 어 바 100 mL 유리 용기에 녹. 몇 주 동안 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tris HCl 버퍼의 준비
	<ol>
<li>저 어 바 8.766 g NaCl, 157 mg Tris HCl 및 146 mg 100 mL 유리병에 EDTA 결합 하 고 80 mL 물에 용 해.</li>
		<li>PH-미터, pH를 관찰 하는 동안 교 반 솔루션을 수산화 나트륨 (1 M, 물) 또는 HCl (20%, 물)를 추가 하 고 pH 8.0에 조정.</li>
		<li>물 100 mL의 최종 볼륨을 달성 하는 데 필요한 볼륨을 추가 합니다. 0.22 μ m 살 균 필터 시스템을 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 참고: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl 및 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL Tris HCl 버퍼 포함 됩니다. 솔루션 4 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aprotinin 솔루션의 준비
	<ol>
<li>1 mL 물 (1.54 m m)에 10 mg aprotinin 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (100 µ L 각) x 10에 aprotinin 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leupeptin 솔루션의 준비
	<ol>
<li>2 물 (10 m m)에 10 mg leupeptin 분해. 약 leupeptin 솔루션 수 10 mL-플라스틱 튜브 1.5 배. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 솔루션의 준비
	<ol>
<li>2 mL 에탄올 (100 mM)에 34.8 mg PMSF 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 x 10에서 PMSF 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) 솔루션의 준비
	<ol>
<li>15.62 mg DMB, 352 µ L β-mercaptoethanol, 및 48 µ L 나트륨 중 아 황산 염-솔루션 (39%), 결합 하 고 추가 9.6 mL 물 (6.9 m DMB m, 500 m m β-mercaptoethanol, 그리고 0.19% 나트륨 중 아 황산 염). 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (250 µ L 각) x 40에서 DMB 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 빛에서 보호 하는 상점.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M trifluoroacetic 산 (TFA) 솔루션의 준비
	<ol>
<li>100%의 770.3 µ L 추가 TFA 9.23 물 15 mL 플라스틱 튜브 (1 M)에. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
120mm TFA 솔루션의 준비
	<ol>
<li>9.91 물 (120mm) 15 mL에 플라스틱 튜브를 92.4 µ L TFA (100%)를 추가 합니다. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
400 m m 수산화 나트륨 (NaOH) 용액의 준비
	<ol>
<li>160 mg 10 mL 물 (400mm) 15 mL에 플라스틱 튜브에 NaOH를 분해. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼의 준비
	<ol>
<li>분해 5.84 g NaCl, 0.1 g 트리 (hydroxymethyl)-aminomethan (트리 스), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2, 100ml에 1 g 트리톤 X100 물 및 7.8에 pH를 조정. 4 ° c.에 게 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 전에 각 protease 억제제 (aprotinin, leupeptin, 및 PMSF)의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 버퍼의 준비
	<ol>
<li>0.3 g 트리 스, 1.5 g 글리신, 그리고 0.1 g SDS 물 100 mL에에서 녹이 고 pH 7.3 조정. 실시간에 저장소</li>
	</ol>
</li>
	<li>
서쪽 오 점 버퍼의 준비
	<ol>
<li>0.3 g 트리 스, 1.1 g 글리신 물 90 mL에에서 녹이 고 에탄올 10 mL을 추가. 실시간에 저장소</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차단 하는 솔루션의 준비
	<ol>
<li>1 g 25 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 지방 무료로 우유 힘의 분해. 항상 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 합성 ManNProp 및 관련된 N-acyl-Mannosamines를 수정
<ol><li>저 어 바 50 mL 유리 용기에 10 mL 3 m m 나트륨 methoxide 솔루션에서 431.2 mg mannosamine 염 산 염을 분해.</li>
	<li>차가운 얼음 0 ° c에 혼합물 감동적인 솔루션에 천천히 dropwise 210 µ L propionyl 염화 (2.4 mmol), 또는 합성 ManNProp 또는 ManNBut, 각각 248 µ L butanoyl 염화 (2.4 mmol)를 추가 합니다. 4 h 0 ° C에서 교 반 혼합 품 어.</li>
	<li>솔루션 50 mL 플라스틱 튜브로 전송 합니다. 얇은 바늘으로 플라스틱 튜브의 뚜껑으로 4-8 구멍을 찌른. 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 급속 동결 하 고 이후 (동결 건조) lyophilize 48 h 또는 그것은 완전히 건조 될 때까지 그것.</li>
	<li>750 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) (이 서 스 펜 션) 믹스 350 g 실리 카 젤 60. 실리 카 젤 60 서 스 펜 션 유리 열 (35 m m 직경 70 cm 길이)를 사용 하기 전에 추가 100 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물으로 (15:2:1) 준비 열을 씻어.</li>
	<li>2.3 단계에서 말린된 제품 분해 (5 g 건조 제품) 10ml 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) 및 부하에는 실리 카에 피 펫을 사용 하 여 열 젤. (ManNProp)에 대 한 후 500 mL 4 mL 분수를 수집 합니다. 참고: ManNBut 약 700 mL 후 열에서 elute 것입니다.</li>
	<li>15 mL 플라스틱 튜브에 eluted 분수를 전송 합니다. 3-6 구멍 플라스틱 튜브의 뚜껑에 얇은 바늘 찌른. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 동결 하 고 이후 그것은 완전히 건조 될 때까지 lyophilize. 참고: 동결 건조 된 제품 실시간에 몇 달 동안 저장 될 수 있다</li>
	<li>질량 분석 (섹션 9 참조) 하 여 제품의 순도 확인 합니다. 참고: 또는, 순도 확인할 수 있습니다 1H 핵 자기 공명 (NMR).</li>
</ol>3. 세포 배양
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U 페니실린, 100 mg 스, 37 ° C, 5% CO2에서 2 mM L-글루타민 포함 5 m ManNAc m, 5 m ManNProp, m 또는 5 mM ManNBut, 포함 된 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 문화 켈리 신경 세포. 참고: ManNAc 또는 그것의 아날로그 매체에 경작 하는 세포는 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>
전에 mannosamines의 응용 프로그램, 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 켈리 신경 세포를 분리 하 고 Neubauer 챔버 또는 셀 카운터를 사용 하 여 계산 합니다. 시드 플레이트/접시의 크기에 따라 정의 된 숫자에서 셀입니다.
	<ol>
<li>측정 sialic 산 단, 48-잘 조직 문화 접시에 500 µ L 매체에 1 x 105 셀을 씨. Polysialic 산의 분석에 대 한 1 x 106 셀 6 cm 직경 셀 문화 접시에 3 mL 매체에 씨. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 매체 마다 24 h를 교체 합니다. 참고: MGE의 효과 치료의 총 시간으로 증가합니다. 높은 신진 대사 효율을 위한 5-7 일에 대 한 셀을 취급 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
치료 후, 매체를 가만히 따르다. PBS 가진 접시/접시를 씻어. 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 세포를 분리 합니다. 분리 된 세포에 세포 배양 매체의 동일한 볼륨을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 15 mL 플라스틱 튜브로 분리 된 세포를 전송 합니다. 원심 500g x 3 분에 대 한 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
	<ol>
<li>5 mL PBS와 원심 분리기 세포 (단계 3.3 참조)을 추가 합니다. 두 번 더 세척 절차를 반복 합니다. 참고: 상쾌한 없이 씻어 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 몇 일 동안. Polysialic 산의 식 해명 될 것입니다 섹션 10 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HPLC 분석을 위한 세포 세포의 용 해
<ol><li>
HPLC 세포의 용 해 버퍼의 준비
	<ol>
<li>5 mL Tris HCl 버퍼, 5 µ L aprotinin 솔루션, 20 µ L leupeptin 솔루션 및 50 µ L PMSF 솔루션을 결합 합니다. 참고: 5 mL HPLC 세포의 용 해 버퍼 150 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 1.54 μ M aprotinin, 40 µ M 포함 됩니다 Leupeptin, 및 1 밀리미터 PMSF (pH 8.0). 이 버퍼 항상 신선한 세포 세포의 용 해 전에 대비해 야.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 500 µ L 얼음 HPLC 세포-버퍼에 수집 된 셀 펠 릿 (단계 3.3) 각을 일시 중단 하 고 울트라-sonicate 샘플 초음파 프로세서 바늘 3 시간 동안 30의 중간-높은 진폭에서 s. 주기 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 샘플 멋진.</li>
</ol>5입니다. 분리 막 분수의
<ol><li>2 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 lysed 세포 샘플을 원심 상쾌한 (약 480 µ L), 1.5 mL 플라스틱 튜브에 있는 cytosolic 단백질 대표를 구분 합니다. 이 분수를 사용 하 여, 예를 들어는 브래드 퍼 드 또는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다. 참고: cytosolic 분수의 단백질 농도 (약 1 mg/mL) 나중에 존경 받는 sialic acid 종의 양이 측정된 연관 될 수 있습니다. 펠 릿 단계 6.1에서에서 사용 되는 막 비율을 나타냅니다.</li>
</ol>6. 산 성 가수분해
참고: 올리고-및 다 당 류는 세포 막에 단을 분해. 또한, 가능한 O-는 단에서 수정, 또한 분해는. 이 양적 HPLC 분석에 필요한 막 분수에 sialic 산의 압도적 glycoconjugates에 자연스럽 게 통합 됩니다 이며 O부담 가능성이 있습니다 때문-틸 또는 O-lactolyl 수정.
<ol><li>150 µ 1 M L 추가 TFA-솔루션 분리 막 분수 (섹션 5에서에서 펠 릿). 200-600 rpm에서 떨고와 80 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>20000 x g와 상위 단계 볼륨은 20 µ L까지 3 kDa 제외 멤브레인과 0.5 mL 필터 튜브를 사용 하 여 21 ° C에서 약 30 분 동안 샘플 원심 참고:이 단계는 높은 분자 파편을 처분 하는 것이 중요.</li>
	<li>2 mL 플라스틱 튜브에 sialic acid 종을 포함 하 여 작은 분자를 포함 하는 낮은 단계를 전송 합니다. 얇은 바늘으로 구멍을 2-4 플라스틱 튜브의 뚜껑에 구멍. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 샘플을 동결 하 고 하룻밤 사이 그들을 lyophilize. 참고: 말린된 견본 저장을 위해 실시간 바꾸기 구멍 없이 모자에 며칠 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 형광 라벨
<ol><li>다시 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서 말린된 견본을 일시 중단 하 고 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다. 자외선 으로부터 보호 하기 위해 어두운 1.5 mL 튜브에 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>표준, 디졸브 1 µ L Neu5Ac (60 ng/mL, 물에서) 또는 1 µ L Neu5Gc (60 ng/mL, 물에) 어두운 1.5 mL 튜브에 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서. 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>세포 막 샘플을 품 어와 56 ° C에서 1.5 h에 대 한 표준 빛에서 보호. 부 화, 후 라벨 반응을 중지를 각 샘플을 4 µ L 400 m m NaOH 솔루션을 추가 합니다.</li>
</ol>8. HPLC 분석
참고: 레이블된 샘플 C18 RP 열을 갖춘 HPLC 시스템에 분석 (110 Å, 3 µ m 입자 크기, 4.6 x 150 m m), 형광 검출기, 그리고 분수 수집. 사용 하는 용 매는 메탄올, 이기, 그리고 물 있습니다. HPLC 시스템 내부 degasser를 결여 하는 경우는 측정 전에 모든 용 매를 드 되었는지 확인 합니다.
<ol><li>열 온도 40 ° C를 설정 하 고 373와 형광 검출기를 구성 구동 및 448 nm nm 방출에 대 한 각각. 10 µ L 샘플 볼륨을 주입 하 고 메탄올/이기/물 (6:8:86)는 eluent으로 0.5 mL/min 흐름 속도로 50 분에 대 한 프로브를 분리. 질량 분석 분석에 대 한 관심의 봉우리를 수집 합니다. 참고: Neu5Gc 6-8 분, 9-12 분, 17-23 분 후 Neu5Prop와 38-44 분 후 Neu5But 후 Neu5Ac 후 eluate을 예정 이다. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 여러 h에 대 한 분류 한 샘플을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플을 측정 한 후 1.0 mL/min 유량 (≈ 1.5 열 볼륨) 메탄올/이기/물 (6:25:69)에서 7.5 분에 대 한 열을 세척 하 고 다시 메탄올/이기/물 (6:8:86)로 1.0 mL/min 흐름 속도로 7.5 분에 대 한 시스템을 equilibrate.</li>
	<li>정량 분석을 위해22각각 HPLC 시스템 운영 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 sialic 산 봉우리의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다. 참고: cytosolic 분수 (섹션 5.1 참조)에 측정 된 단백질 농도 Neu5Ac 또는 Neu5Gc 표준을 얻은 데이터 관련 될 수 있습니다.</li>
</ol>9. 질량 분석 분석 Sialic 산 단
참고: 관심의 HPLC 보존 봉우리 분석할 수 있습니다 추가 액체 크로마토그래피 (LC) 분무 이온화 질량 분석 (MS ESI)에 의해 부자연 스러운 sialic acid 종 확인.
<ol><li>질량 분석 분석을 위해 수집 된 샘플의 20 µ L에 주입 LC/대량 선택적인 검출기 (MSD) 시스템 79.9% 메탄올, 20% 이소프로필 알콜, 및 0.1% 개미 산 성 eluent, 0.5 mL/min 유량, 4 kV 모 세관 전압, 및 모 세관 온도 350 ° C 22 , 23.</li>
	<li>해당 하는 LC/엠 시스템의 평가 소프트웨어에서 총 이온 크로마의 피크를 선택 합니다. 확인 된 피크의 질량 스펙트럼 보기 300과 700 사이의 긍정적인 질량/전 비를 표시 합니다. 참고: DMB sialic 산의 라벨 116.2 g/mol의 분자 질량에 있는 증가에 지도 한다. DMB 라는 sialic acid 종가지고 다음 분자 질량: DMB Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = mol. 공통 adducts/이기, 나트륨, 또는 소 프로필 알코올.</li>
</ol>10. 서쪽 오 점 분석 켈리 신경 세포에 Polysialic 산의
<ol><li>
세포 lysates의 준비
	<ol>
<li>3.3 단계 및 소용돌이에서 셀 펠 릿을 1 mL 서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 품 어. 5 분 마다 소용돌이입니다. 1.5 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 샘플을 원심 Lysed 세포에서 단백질을 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
		<li>단백질 분수, 예를 들어,는 브래드 퍼 드 또는 BCA 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다. 세포의 용 해 버퍼에서 µ 1.5 µ g/L의 단백질 농도에 샘플을 희석.</li>
		<li>90 µ L 단백질 분수 (1.5 µ g / µ L) 10 µ L Laemmli 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 하 고 5 분24에 대 한 샘플을 끓여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>20-30 µ L 주머니와 0.75 또는 1 m m 두께 8 %SDS-아크릴 아 미드 젤을 사용 합니다. 25에 젤을 실행 실시간에서 2 h mA</li>
		<li>젤에서 유리 덮개를 조심 스럽게 제거. 잘라 고 로드 주머니를 포함 하는 젤의 위쪽 부분을 삭제. 서쪽 오 점 버퍼에 배어 이전 니트로 멤브레인 (0.2 µ m)에 젤을 놓습니다. 단백질은 니트로 시스템 (4 ° C에서 1 시간예를 들어, 250 mA)의 권고에 따라 전송.</li>
		<li>더 럽 히 시스템에서 니트로 멤브레인을 제거 합니다. 단백질을 시각화 하기 위해 빨간색 Ponceau와 얼룩 얼룩. 니트로 막 플라스틱 챔버로 전송 하 고 차단 솔루션 10 mL를 추가 합니다. RT에 1 h incubate 또는 4 ° c.에서 하룻밤</li>
		<li>차단 솔루션을 가만히 따르다와 PBS에서 안티-polySia 735의 단일 클로 널 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. RT에 1 h 막 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.</li>
		<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 또는 PBS에 형광 라벨 결합 polyclonal 항 마우스 IgG 이차 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. 실시간에서 1 h 막 품 어 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.</li>
		<li>적절 한 영상 접시에 막 전송. 제조업체의 지침에 따라 신호를 감지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

화학적 합성된 ManNAc 파생 상품, ManNProp 및 ManNBut는 질량 분석을 통해 분석 하는 경우만 두 표본에 대 한 올바른 대량 피크 식별 되어야 합니다. 따라서, 제품 99% 이상의 순도가지고 추측 될 수 있다. 일반적으로 찾을 수 없는 인간의 셀29에, Neu5Gc의 적은 양은 lysed 세포의 막 분수에서 검색 됩니다. 이 대부분 미디어30에 소 태아 혈 청 sialoglycoconjugates에서 Neu5Gc 신병 회수 통로 통해 발생 합니다. Sialic 산 생 합성, ManNAc의 자연 스러운 전조와 치료는 크게 세포 표면에 Neu5Gc epitope의 식을 낮춘 다.
수정 된 mannosamines의 응용 프로그램은 지금까지 조사 하는 모든 셀에 사소 하 게 독성. 셀은 N-acylmannosamines에 대 한 특정 전송기 없는 때문에 필요한 매체 내의...

Sialic acid glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 비 감소 테르미니에서 일반적으로 찾을 수 있는 단 당 류 이다. 모든 단 중 sialic acid는 몇 가지 독특한 화학 특성이 있다. 9 C 원자 백본, deprotonated 이며 그로 인하여 부정 청구에서 생리 적 조건, C-1 위치에 carboxylic 그룹 및 아미노 기능 C-5 위치에 있다. 날짜1, 자연스럽 게 sialic acid의 변종 발생 50 이상 성격 되었습니다 sialic acid 인간에서 발견의 주된 형태는 N-acetylneuraminic 산 (Neu5Ac). 다른 포유동물은 또한 N-glycolylneuraminic 산 (Neu5Gc)2,3의 더 높은 금액을 표현 한다.
Glycoconjugates, 노출된 위치로 인해 sialic acid 수용 체 ligand 상호 작용의 과다 한 예를 들어, 호스트 셀4인플루엔자 바이러스의 조류 종속 바인딩 포함 된다. 중요 한 생물 학적 기능, 특히 embryogenesis 동안와 신 경계에 sialic acid epitope polysialic 산 이다. Polysialic 산 최대 200 알파 2, 8-연결 sialic 아미노산의 중합체 이다. Polysialic 산의 주요 단백질 캐리어는 신경 세포 접착 분자 (여). Polysialic 산 식 polysialic 산 식 접착을 감소 하 고 신 경계5가 소성을 증가 보안의 접착제 속성을 조절 한다.
변화 (폴 리) sialic acid의 식에서 궁극적으로 여러 다른 생물 학적 상호 작용을 영향을 줍니다. 이 알려진된 sialic acid 종속 프로세스 밝히기 소설 glycoconjugate 상호 작용, 또는 가능한 치료 방법 탐구를 분자 수준에서 연구를 사용할 수 있습니다. 다른 방법이 있다 사용할 수 있는 세포 표면에 sialic acid의 표현을 변조 수, sialic acid 특정 glycosidases (sialidases),6 sialic 산 생 합성에 관련 된 효소의 억제와 치료 예 ,7,8또는 노크 하거나 sialic 산 생 합성9의 주요 효소의 표현 변경.
또 다른 다재 다능 한 sialic acid 식 변조 하 방법은 MGE (일컬어 대사 처리한후 공학, 모에)입니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 동물 아닌 자연의 파생 상품 ManNAc는 c 2-아미노 수정 처리 됩니다. 세포질 통풍 관 후 sialic acid에 대 한 선구자 분자 이기 때문에, 이러한 ManNAc 아날로그 단방향 비 자연적인 대사 sialic 산 이며 sialylated glycoconjugates에 표현 될 수 있습니다. 와 같은 ManNProp 또는 ManNBut, N-propionylneuraminic 산 (Neu5Prop) 또는 그들의 glycoconjugates10 N-butanoylneuraminic 산 (Neu5But)를 통합 할 셀 들고 지방 족 C2-수정, ManNAc 유도체로 치료 , 11. ManNAc의 C2 위치에 도입 하는 기능적인 그룹을 사용 하 여 발생 비 자연적인 sialic 산 결합 될 수 있다, 예를 들어, Staudinger 결 찰 이나 아 지 드 alkine cycloaddition 형광 염료를 통해 따라서 12셀 표면 시각.
이러한 비 자연적인 sialic이 표현 병원 체 감염, 접착 및 종양 세포, 일반 세포 접착으로 vascularization와 차별화 (검토를 위해의 마이그레이션 등 많은 생물 학적 과정에 흥미로운 효과가 참조: Wratil 외. 13). 흥미롭게도, MGE n-acyl 수정 mannosamines polysialic 산의 표현에 방해가 사용할 수 있습니다. Polysialic 산 (ST8SiaII 및 ST8SiaIV) 두 개의 서로 다른 polysialyltransferases에 의해 생성 됩니다. 그것은 입증 되었습니다, 그 polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp 또는 ManNBut,1415등 부자연 스러운 sialic acid 선구자에 의해 저해. 또한, 그것은 증명 되었습니다 인간의 신경 세포에서 ManNProp 또는 ManNBut 응용 프로그램 또한 총15sialylation를 감소 시킨다.
MGE n-acyl 수정 mannosamines는 성공적으로, 뿐만 아니라 포유류와 꼬마 선 충16, 같은 다른 종족의 전체 동물에 뿐만 아니라 박테리아 세포 배양에 사용 된 메서드를 적용 하 게 쉬운 zebrafish17또는 쥐18,19,,2021. 특히 ManNAc 파생 상품 지방 족 수정, ManNProp 및 ManNBut, 포함 한 베어링은 사소, 셀 문화 매체 또는 혈액 플라스마 millimolar 농도 에서도 세포 독성. 또한, 그들은 비교적 쉽게 합성 하기입니다.
여기, 우리는 nMGE를 사용 하는 방법에 세부 정보를 제공-틸 수정 mannosamines. 첫째, ManNProp 및 ManNBut,이 분야에서 가장 널리 사용 되는 ManNAc 파생 상품의 2의 화학 합성은 설명 했다. 다음으로, 우리는 어떻게 MGE vivo에서 실험에 적용할 수 보여줍니다. 예를 들어, 신경 세포 선 켈리 선정 되었다 polysialic epitope의 감소 식 보여 서양 오 점 ManNAc 유도체 치료 후. 세포 표면에 비 자연 sialic 산 HPLC로 정량 이었고 더 질량 분석을 통해 분석.

<table><tbody><tr><td>세포</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr>, <tr><td>75ml 조직 배양 플라스크,</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td>, <td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr>, <tr><td>FCS,</td><td>PAA,</td><td>A15-102</td><td></td></tr>, <tr><td>Pen/Strep</td>, <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr>, <tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 장비 (탱크, 유리 제품 등, 기계</td><td>VWR</td><td>SDS Gel / Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>단백질 사다리</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau red</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>분유</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 원심 필터 장치(3 kDa 멤브레인 포함</td>) <td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>시그마-알드리치(코닝)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34965-1L</td><td>HPLC 구배 등급</td></tr><tr><td>4,5-메틸렌디옥시-1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로</td>라이드 <td>시그마-알드리치</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 웰, 평평한 바닥 조직 배양 플레이트</td><td>시그마-알드리치(코닝)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich(Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td> 소 폐의 <td>HPLC 구배 등급</td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>동결건조 분말, 3-8 TIU/mg 고체</td></tr><tr><td>염화 부티릴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 RP 란</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &Aring;, 3 & 마이크로; m 입자 크기, 4.6 x 150mm</td></tr><tr><td>D-만노사민 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 인산염 완충염 용액</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>시그마-알드리치</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>염산 용액</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0 %, 물 중</td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>칼 로스</td><td>T169.2</td><td>HPLC 그라디언트 등급</td></tr><tr><td>N- 아세틸 -D- 만노사민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N- 아세틸 뉴 라민 산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N- 글리콜 뉴 라민</td> 산<td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>프로피오닐 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, 무색</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium 중아황산염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, 물 중</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M, 물 중</td></tr><tr><td>메톡시드 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>트리스 하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25 %/EDTA 0.02 % PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC 구배 등급</td></tr><tr><td>실리카겔 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-시스템</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

n을 사용 하 여 sialic acid의 대사 glycoengineering-acyl-mannosamines를 수정

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 매우 중요 한 구성입니다. 올리고-및 다 당 류, 뿐만 아니라 독특한 화학 특성의 비 감소 테르미니에서 그것의 위치 때문 sialic acid는 다른 수용 체 ligand 상호 작용의 무리에 포함 된다. 세포 표면에 sialic acid의 식을 수정 하 여 sialic acid 종속 상호 작용 따라서 좌우 될. 이 sialic acid 종속 상호 작용을 조사 하는 데 도움이 될 수 있습니다 하 고 유익한 방식으로 특정 질병에 영향을 미칠 가능성이 있다. 신진 대사 glycoengineering (MGE)을 통해 세포 표면에 sialic acid의 식이 변조 수 있습니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 전체 동물 N-acetylmannosamine (ManNAc)의 파생 상품 c 2 수정 처리 됩니다. 이러한 아미노 설탕 sialic 산 성 선구자 분자 역할 따라서는 해당 sialic acid 종 대사와 glycoconjugates에 표현. 이 방법을 적용 다양 한 생물학 과정에 흥미로운 효과 생성 합니다. 예, 그것은 치료 신경 세포에 있는 polysialic 산 (polySia)의 식을 획기적으로 줄일 수 있다 고 따라서 신경 성장과 분화에 영향을 줍니다. 자, 우리 N-butanoylmannosamine (ManNBut), 뿐만 아니라 가장 일반적인 C2 수정 N-acylmannosamine 유도체, N-propionylmannosamine (ManNProp)의 2의 화학 합성을 보여 더 보여 어떻게이 아닌 자연 아미노 설탕은 세포 배양 실험에 적용할 수 있습니다. 수정된 sialic acid 종의 식 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계량 하 고 더욱더 질량 분석을 통해 분석. Polysialic 산 식에 대 한 효과 서쪽 오 점 상용 polysialic 산 성 항 체를 사용 하 여 통해 해명.

Neu5Ac 그리고 Neu5Gc 표준 형광의 HPLC chromatograms는 그림 2에 묘사 된다. 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여, DMB 라는 Neu5Gc 일반적으로 elutes 7-9 분 차입, 시간과 DMB-Neu5Ac 10-12 분 사이. 여러 작은 봉우리는 크로마는 일반적으로 2-6 분 사이 나타납니다. 이러한 봉우리 unreacted DMB 나타내고 반응 중개자25.
그림 3 는 세포 lysates의 대표적인 chromatograms를 보여준다. DMB 라는 기준 (그림 2)의 chromatograms에 비해이 chromatograms에서 여...

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

이 기술의 전반적인 목표는 시알산 발현이 변형된 세포 또는 세포 유래 생성물을 생성하는 것입니다. 이를 위해 세포를 N-acyl 변형 만노사민으로 처리하며, 이는 해당 시알산으로 대사되어 결과적으로 세포 표면에 발현됩니다. 이 방법은 수용체-리간드 상호작용에 미치는 당접합체의 영향과 같이 당생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 적용이 쉽고 순수하게 세포 독성을 나타낸다는 점입니다. 대사 당공학(metabolic Glycoengineering)을 입증하기 위해, 시중에서 구입 가능한 N-acetylmannosamine을 사용할 것입니다. 또한, N-propionyl 및 N-butanoylmannosamine의 합성 및 활용 방법을 보여드리겠습니다.대사성 당공학이 폴리시알산 발현에 미치는 생물학적 효과를 보여줍니다. 먼저, 마그네틱 바가 들어 있는 15 milliliter 유리병에 431.2 milligrams의 Mannosamine hydrochloride를 10 milliliters의 3 Millimolar Sodium methoxide 용액에 녹입니다. 혼합물을 얼음 위에서 0 °C로 냉각합니다.교반하면서 210 µm의 propionyl chloride를 용액에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 그 후, 교반 중인 혼합물을 0 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서, 용액을 50 mL 플라스틱 튜브로 옮기고 가는 바늘을 사용하여 튜브 캡에 4~8개의 구멍을 뚫습니다.액체 질소를 사용하여 용액을 급속 냉동합니다. 그런 다음, 샘플이 완전히 건조될 때까지 동결 건조합니다. 동결 건조 후, 건조된 생성물을 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물에 용해합니다.피펫을 사용하여 미리 준비한 실리카 겔 컬럼에 용액을 로딩합니다. 용매 500 milliliters를 용출시킨 후, 4 milliliter씩 분획하여 수집합니다. 용출된 분획들을 15 milliliter 플라스틱 튜브로 옮기고, 얇은 바늘로 튜브 캡에 3~6개의 구멍을 뚫습니다.액체 질소로 용액을 급속 냉동시킨 후, 샘플이 완전히 건조될 때까지 동결 건조합니다. Kelly 신경모세포종 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 RPMI 배지에서 배양합니다. mannosamine을 처리하기 전, Trypsin과 EDTA를 사용하여 10분간 배양함으로써 Kelly 신경모세포종 세포를 분리합니다.RPMI 배지로 트립신을 중화시킨 후, Neubauer chamber를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 시알산 단당류를 측정하려면, 500 µL의 배지와 함께 세포를 48-well 조직 배양 플레이트에 분주합니다. 폴리시알산 분석을 위해서는, 3 mL의 배지와 함께 세포를 지름 6 cm 세포 배양 디쉬에 분주합니다.RPMI에 용해한 각각의 mannosamine 유도체를 갓 분주한 세포에 최종 농도 5 mM이 되도록 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, N-acyl로 변형된 Mannosamine이 포함된 배지를 24시간마다 교체합니다. 처리 후, 배지를 따라내고 PBS로 세포를 세척합니다. Trypsin 및 EDTA와 함께 10분 동안 배양하여 세포를 탈착시킵니다.분리된 세포에 동일한 부피의 세포 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 그 다음, 분리된 세포를 15 milliliter 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 샘플을 500 ×g에서 3분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 5 milliliter의 PBS로 세포를 3회 세척합니다.원심분리 후, 수집된 세포 펠렛을 500 µL의 얼음처럼 차가운 HPLC 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁합니다. 초음파 처리기를 사용하여 샘플을 중고 진폭으로 30초씩 3회 초음파 처리하며, 각 주기 사이에 샘플을 얼음 위에서 최소 1분 동안 냉각합니다. 용해된 세포 샘플을 원심분리한 후, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 상층액을 막 분획(membrane fractions)과 분리합니다.산 가수분해를 위해, 분리된 막 분획물에 1 M TFA 용액 150 µL를 첨가합니다. 샘플을 80 °C에서 200~600 RPM으로 흔들어주며 4시간 동안 배양합니다. 그 다음, 샘플을 3 kDa 차단막이 있는 0.5 mL 필터 튜브로 옮깁니다.상층액의 부피가 20 µL 미만이 될 때까지, 샘플을 20,000 ×g, 21 °C에서 약 30분 동안 원심 분리합니다. 그 후, 인서트를 제거하고 초여과액이 담긴 튜브 캡에 얇은 바늘로 2~4개의 구멍을 뚫습니다. 액체 질소로 샘플을 급속 냉동시킨 후, 하룻밤 동안 동결 건조합니다.건조된 시료를 120 millimolar TFA 용액 10 microliters에 재부유시키고, DMB 용액 50 microliters를 첨가합니다. 자외선으로부터 보호하기 위해 시료를 차광 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세포막 시료와 표준 물질을 56 degrees Celsius에서 1.5시간 동안 배양합니다.배양 후, 각 시료에 400 millimolar 수산화나트륨 용액 4 µL를 첨가하여 라벨링 반응을 중단시킵니다. HPLC 분석을 위해 컬럼 온도를 40 °C로 설정하고, 형광 검출기의 들뜸 파장은 373 nm, 방출 파장은 448 nm로 각각 설정합니다. 시료 10 µL를 주입하고, 메탄올, Acetonitrile 및 물을 용리액으로 사용하여 0.5 mL/min의 유속으로 15분 동안 프로브를 분리합니다.질량 분석을 위해, 수집된 각 HPLC 샘플 20 microliters를 LC 질량 선택 검출기 시스템에 주입하십시오. LC 질량 선택 검출기 시스템의 평가 소프트웨어에서 전체 이온 크로마토그램 중 분석 대상 피크를 선택하십시오. 분리된 피크의 질량 스펙트럼을 확인하고, 300에서 700 사이의 양전하 질량 대 전하비를 표시하십시오.기존에 준비한 당공학 세포 펠렛에 western blot 용해 버퍼 1 mL를 첨가하고 볼텍싱합니다. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양하며, 5분마다 볼텍싱합니다. 그 후, 샘플을 20,000 ×g, 4 °C에서 1.5시간 동안 원심분리합니다.그 다음, 용해된 세포로부터 단백질이 포함된 상층액을 수집하여 1.5 milliliter 튜브에 담습니다. 각 단백질 분획 90 microliters에 Laemmli 샘플 버퍼 10 microliters를 첨가하여 SDS-page용 샘플을 준비합니다. 샘플을 5분 동안 가열합니다.샘플을 8% SDS-acrylamide 겔에 로딩한 후, 실온에서 25 mA로 2시간 동안 전기영동을 수행합니다. 완료되면 겔에서 유리 커버를 조심스럽게 제거하고 로딩 포켓이 포함된 겔의 상단 부분을 잘라냅니다. 그다음, western blot buffer에 미리 적셔둔 0.2 µm nitrocellulose membrane 위에 겔을 올립니다.시스템의 권장 사항에 따라 단백질을 니트로셀룰로오스로 전이시킵니다. 블로팅 시스템에서 니트로셀룰로오스 막을 제거한 후, 폰소 red(Ponceau red)로 블롯을 염색하여 단백질을 시각화함으로써 전이 품질을 확인합니다. 그런 다음, 니트로셀룰로오스 막을 플라스틱 챔버로 옮기고 블로킹 용액 10 milliliters를 첨가합니다.니트로셀룰로오스 막을 배양한 후, 블로킹 용액을 따라내고 PBS에 희석된 monoclonal anti-polysialic acid 735 항체를 첨가합니다. 배양 후, PBS로 막을 최소 3회, 각 5분 동안 세척합니다. 이제 horseradish peroxidase가 결합된 polyclonal anti-Mouse IgG 2차 항체를 니트로셀룰로오스 막에 첨가합니다.멤브레인을 배양하고 세척한 후, 적절한 이미저의 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 신호를 검출합니다. DMB 표지 N-glycolyl neuraminic acid는 7분에서 9분 사이에 용출됩니다.그리고 DMB로 표지된 N-acetyl neuraminic acid는 10분에서 12분 사이에 용리됩니다. 크로마토그램에서 관찰되는 몇 개의 작은 피크들은 반응하지 않은 DMB와 반응 중간체들을 나타냅니다. 세포 용해물의 HPLC 크로마토그램에는 정의되지 않은 여러 피크들이 나타나는데, 이는 내부 불순물과 세포 용해물 내에 존재하는 다른 alpha keto acid들과의 반응으로 인해 생성된 DMB 부산물들을 나타냅니다.N-acetyl Mannosamine 처리 시 흔히 세포 표면의 N-glycolylneuraminic acid가 고갈됩니다. N-propionyl neuraminic acid 또는 N-butanoyl neuraminic acid로 처리한 용해 세포의 크로마토그램에서는 해당 비천연 시알산의 출현을 나타내는 피크가 관찰됩니다. DMB와 시알산 종의 반응은 이 염료로 표지되지 않은 시알산 종과 비교했을 때 분자 질량이 116.2 dalton 증가하는 결과를 가져옵니다.강화된 이온 종 외에도 나트륨 부가물이 관찰됩니다. DMB-Neu5Gc는 반응하지 않았거나 부분적으로 반응한 DMB 종 직후에 용출되며, 이는 DMB-Neu5Gc의 질량 분석 스펙트럼에서 정의되지 않은 피크가 나타나는 이유를 설명합니다. Kelly 신경모세포종 세포를 N-propionylmannosamine 또는 N-butanoylmannosamine으로 처리하면 세포 표면의 폴리시아트산 발현이 감소합니다.반면, N-acetylmannosamine 처리는 polysiatic acid 발현을 증가시킵니다. 이 기술을 적용하면 수일 내에 완전히 sialylation된 세포를 생성할 수 있습니다. 이렇게 당공학적으로 설계된 세포는 후속 실험에 활용될 수 있습니다.예를 들어, 수용체-리간드 상호작용을 연구하거나 여기에서 보여준 것처럼 폴리시알산(polysiatic acid)의 발현을 억제하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기서 제시된 대사 공학 절차는 시알산 실험에 최적화되어 있습니다. 하지만 동일한 절차를 동물 실험에도 적용할 수 있습니다.우리가 제시한 프로토콜과 이 비디오 제작물이 연구자들이 대사 당공학(metabolic glycoengineering)을 연구실에 도입하여 생물학적 시스템 내 시알산(sialic acid)과 시알산 수용체의 기능 및 생물학적 역할을 분석하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 유기화학자들은 더 복잡한 구조를 가진 N-acyl 변형 mannosamine을 합성하여 본 프로토콜에서 제안한 방식으로 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에 따라, 모든 시료는 형광 표지 직후에 분석해야 합니다.따라서 HPLC와 ACMS 분석기 사이에 지연이 없어야 합니다.

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

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연구

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N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

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