Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제 Rhipicephalus microplus 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus 상피 장 세포에서 biotinylated 세포 표면 단백질의 정제. 이 연구에서는 Rhipicephalus microplus 장 조직에서 개별 상피 세포를 분리하기 위해 수정된 Percoll 구배 기반 방법론을 사용했습니다. 표면 결합 단백질은 다운스트림 응용 분야에서 활용하기 위해 streptavidin 자기 비드를 통해 비오틴화되고 정제되었습니다.

반충혈된 Rhipicephalus microplus에서 장 상피를 해부합니다. 다음 자료가 필요합니다. 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프 스트립을 부착합니다.

테이프에 Super Glue 한 방울을 추가합니다. 진드기 복부 쪽을 아래로 향하게 하여 Super Glue에 놓고 건조시킵니다. PBS 100mL에 진드기를 완전히 담그십시오.

11 사이즈 메스를 사용하여 진드기의 양쪽 눈 위에서 아래쪽 꽃줄까지 자릅니다. 멸균 겸자를 사용하여 표백과 이소를 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다. 미세한 흰색 실 같은 기관과 다른 막을 제거하십시오.

집게를 사용하여 장을 제거합니다. 내장은 얼음처럼 차가운 HBSS와 PIC에 보관하십시오. 상피 세포 분리.

다음 자료가 필요합니다. 절개된 장을 50mL Falcon 튜브 내부의 70미크론 세포 여과기에 붓습니다. Falcon 튜브 내부에 진공이 형성될 수 있으므로 공기 순환을 위해 필터를 들어 올리십시오.

PIC를 사용하여 50mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 장 조직을 세척합니다. PIC를 사용하여 30mL 얼음처럼 차가운 HBSS에 내장을 재현탁합니다. 필요한 경우 멸균 스크레이퍼를 사용하여 장 재현탁액을 돕습니다.

500g의 원심분리기. 상층액을 제거하고 세척 과정을 3회 반복합니다. 10mL의 DMEM, 2%FCS, 5밀리몰 EDTA, 1밀리몰 TCEP 및 PIC에 장 세포를 재현탁합니다.

부드럽게 섞는다. 섭씨 37도에서 롤러를 사용하여 천천히 회전하면서 60분 동안 배양합니다. 250미크론 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 필터링합니다.

흐름을 통해 소용돌이. 그리고 70미크론 셀 스트레이너를 통해 필터링하여 나머지 흐름을 수집합니다. 서스펜션을 원심분리기합니다.

Percoll gradient를 사용한 단일 상피 세포의 분리. 다음 자료가 필요합니다. AP15 프리 필터 페이퍼를 통해 여과하여 Milli-Q 물에 40% 및 20%Percoll을 준비합니다.

멸균 주사기에 Percoll 용액을 로드합니다. 필터 리그에 적용하고 Percoll을 천천히 배출합니다. 그라디언트를 겹겹이 쌓기 전에 한 시간 동안 섭씨 4도에서 식히십시오.

그림과 같이 연동 펌프를 설정합니다. 가장 낮은 속도로 설정된 연동 펌프를 사용하여 3mL의 40%Percoll을 16mL 초원심분리 튜브에 넣습니다. 15분 동안 얼음 위에 가라

펌프의 속도는 분당 1mL 미만이어야 합니다. 튜브를 45도 각도로 기울이고 연동 펌프를 사용하여 20% Percoll을 40% 레이어 위에 레이어링합니다. 방울이 낮은 층과 혼합되는 것을 방지하기 위해 출력 튜브가 원심분리기 튜브에 닿아 있는지 확인하십시오.

펌프의 속도는 분당 1mL 미만의 유속으로 이어져야 합니다. 층이 얼음 위에 15분 동안 가라앉도록 합니다. 분당 1mL 미만의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 분리된 상피 세포를 포함하는 DMEM 용액 3mL를 20-40% Percoll 구배에 걸쳐 층을 이룹니다.

출력 튜브가 원심분리기 튜브에 닿아 있는지 확인하여 물방울이 아래쪽 층과 혼합되어 기울기를 방해하는 것을 방지합니다. 600g에서 10분 동안 원심분리기. DMEM, 20%Percoll gradient 및 20%40%Percoll gradient 사이의 계면을 수집하여 상피 단일 세포를 분리합니다.

세포 표면 단백질 비오틴화(biotinylation) 및 비오틴화된 표면 단백질의 분리. 다음 자료가 필요합니다. 제조업체의 지침에 따라 Biotin Type A Conjugation Kit를 사용하여 100마이크로리터의 단일 세포 상피 세포를 비오티닐화합니다.

100마이크로리터의 PBS, 1%Triton X-100, 10%글리세롤, 100마이크로몰 산화 글루타티온 및 PIC를 비오틴화된 세포에 추가합니다. 얼음 위에서 10분마다 부드럽게 섞어 한 시간 동안 배양합니다. 세포 추출물을 20, 000g에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하고 따로 보관합니다.

, 000 마이크로 리터의 TBS 1% Tween-20으로 세척하여 50 마이크로리터의 streptavidin 마그네틱 비드를 준비합니다. 손가락으로 가볍게 튕겨 부드럽게 섞습니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 튜브 측면에 구슬을 모읍니다.

상층액을 제거하고 폐기합니다. 300마이크로리터의 비오틴화된 세포 표면 단백질을 세척된 마그네틱 비드와 결합합니다. 교반하면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

마그네틱 스탠드로 비드를 모아 상층액을 제거하고 버립니다. TBS 300%Tween-20 300마이크로리터를 튜브에 넣고 부드럽게 혼합하여 비드를 다시 현탁시킵니다. 비드를 모으고, 상층액을 제거하고, 버립니다.

이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 100 마이크로리터의 1 몰 글리신 pH 2를 마그네틱 비드에 추가합니다. 그리고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

비드를 수집하고 용리된 비오틴화 표면 단백질을 포함하는 상등액을 제거합니다. 그림 1은 전체 진드기로부터 상피 세포와 그 표면 단백질을 분리하는 데 사용되는 프로토콜을 나타냅니다. 이 프로토콜을 활용하면 75 - 80%의 생존율을 가진 mL당 약 1.2 x 10 개의 세포와 20 - 24 마이크로그램의 정제된 비오틴화 표면 단백질을 50 틱의 초기 해부에서 정제할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 검사 이미지는 그림 2A 및 2B에 나와 있습니다. 세포는 단일하고 구형이며 매끄러운 표면 형태와 샘플 전체에 걸쳐 일정한 크기로 나타납니다. 불량한 분리는 다양한 세포 크기와 형태를 통해 식별된 다양한 세포 집단과 함께 개별 상피 세포의 불완전한 해리를 포함하도록 시각화됩니다.

숙주 단백질(그림 3A)의 교차 오염은 진드기 내장을 적절하게 헹구어 흰색 또는 투명한 Percoll 구배를 생성함으로써 최소화할 수 있습니다(그림 3B).SDS-PAGE(그림 4A), 실버 염색(그림 4B), 점 블롯(그림 5) 및 ELISA(그림 6)에 의한 단백질 비교는 설명된 방법론이 Rhipicephalus microplus 진드기 내장에서 분리된 개별 상피 세포에서 비오틴화된 표면 단백질을 성공적으로 정제했음을 나타냅니다. 결론적으로, 이 연구에 사용된 방법은 Rhipicephalus microplus의 전체 장에서 개별 상피 세포를 성공적으로 분리했습니다.

추가 분석 및 연구를 위해 Rhipicephalus microplus 상피 세포 표면의 단백질을 얻었습니다. 마지막으로, 개발된 프로토콜은 진드기 장에서 개별 상피 세포의 잠재적 수율과 세포의 비오틴화 표면 단백질의 효율성을 입증했습니다. 개발된 프로토콜은 장의 막 단백질 구성을 연구하여 진드기-숙주 상호 작용을 조사하기 위한 노력의 일환으로 경제적으로 중요한 모든 진드기 종에 활용될 수 있습니다.