Name: 장기의 라이브 영상 초파리 아이 디스크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 Drosophila 초파리 눈 디스크의 장시간 라이브 이미징 방법을 통해 광수용체 분화와 소막 회전을 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 10시간 동안 조직 완전성을 유지하며 세포 형태와 이동을 연구할 수 있습니다.

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우리는 플라이 주식을 플라이 음식을 준비하고 유지하기위한 천-란 수와 유 치 양에게 감사하며, 스와 핑 리와 공 초점 현미경과의 도움을 IMB 이미징 코어에. 본 연구는 101-2321-B-001 -004, NSC-100-2321 -012 B-001, B-102-2321 NSC-001 -002, MOST 103-2311-B-001 YHS (NSC에 보조금 지원 국립 과학위원회와 중국의 공화국 과학 기술부에서 -035 -MY3).

1. 사전 실험 설정 <ol><li> 5 일간 25 ° C에서 비행 mδ0.5-GAL4에서 핵 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현 계란과 문화를 수집합니다. </li><li> 마이크로파 아가 1X 인산 완충 생리 식염수 10 mL를 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 (PBS)에 저 융점의 0.7 g. 37 ° C의 배양기에서 사용할 때까지 0.7 % 저 융점 겔 유지. </li><li> 12 시간 이상 동안 70 % 에탄올 핀셋, 가위 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립, 9 웰 유리 스폿 판 및 자기 배양 챔버를 포함한 모든 장비, 소독. </li><li> 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 1.25 ㎎ / ㎖의 인슐린 보충 슈나이더의 초파리 배지 : 배양액 (3)을 준비한다. 오염을 방지하기 위해, 세포 배양 후드 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 준비된 배지를 저장하고 한 달 내에 사용. </li><li> 해부 플랫폼과 실험을 &#39;청소해부를 시작하기 전에의 70 % 에탄올 손을. </li></ol> 2. 디스크 해부 <ol><li> 공기는 70 % 에탄올에서 모든 장비를 건조. </li><li> 비행 병에서 세 번째 령 유충을 선택합니다. 플라이 병의 오염을 방지하기 위해, 폐기물을 제거하는 1X PBS 배의 유충을 씻는다. </li><li> 해부 현미경 9 웰 유리 스폿 접시 (RT시) 배지 1 ㎖에서 세정 유충 해부. </li><li> 약 후방 단부로부터 제 3 방법 입 후크 또 다른 겸자 집게에 한 쌍의 유충을 잡고. 내부 조직을 분리 반대 방향으로 두 개의 집게를 당긴다. <ol><li> 입 후크에 부착 된 눈 - 뇌 단지에서 침샘, 지방 본문 및 표피를 제거합니다. 복부 신경 코드가 여전히 연결되어있는 경우, 가위를 버려야. </li></ol></li><li> 공동 조직의 조각을 제거하기 위해 입 후크와 포셉 한 쌍을 파악 포셉 한 쌍을 사용하여지느러미 부분의 머리와 눈 디스크 nnects. 참고 :이 조직이 제거되지 않으면, 두 눈 더듬이 디스크는 서로 뇌에 가까운 것입니다. 이 조직, 뇌 및 눈 더듬이 디스크가 삼각형을 형성하기 때문에 눈 디스크는 다음의 coverslip에 평평하게 거짓말을하지 않습니다. </li><li> 복부 - 상승 위치로 완전히 착물을 돌린다. 뇌에 후크 또는 디스크를 연결하는 필라멘트를 제거합니다. 참고 : 필라멘트가 제거되지 않으면 입 후크가 제거 될 때, 눈-더듬이 디스크가 두 조각으로 분할됩니다. <ol><li> 입 후크를 제거합니다. 과정에서 눈 디스크를 손상되지 않도록주의하십시오. 참고 : 아이 디스크가 현재 매체에서 무료 만 광학 줄기에 의해 뇌에 연결되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 장착 <ol><li> 공기 건조와 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립으로 챔버의 부품을 조립한다. 제를 유지하는 커버 슬립의 중심 O 링의 이중층을 연결전자 아가로 오스. </li><li> coverslip에와 챔버를 조립합니다. 무대 수용체에 42 mm X 0.17 mm coverslip에 넣습니다. 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. 베이스를 놓습니다. 밀봉 잠금 로커 커버 (도 1)를 배치했다. </li><li> 조심스럽게 10-200 μL 팁에 20 μL의 마이크로 피펫을 이용하여 O 링의 중심에 눈 해부 뇌 복잡한 옮긴다. </li><li> 매체의 대부분을 제거하고, 샘플 (37 ° C에서) 0.7 % 저 융점 아가로 오스 12 μL를 추가한다. 참고 : 눈 디스크의 위치는 아가로 오스의 응고되기 전에 집게로 변경 될 수 있습니다. 아가는 5 분 내에 응고된다. <ol><li> O 링의 중심을 실온에서 1 ㎖의 배지에 추가; 각 O 링 (4 개)의 샘플까지 넣을 수있다. 아가로 오스는 샘플의 표류를 방지하기 위해 O 링에 접착되어 있는지 확인합니다. 주 : 매체의 어떠한 포기 또는 순환이 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol>4. 공 초점 현미경 <ol><li> 온도 평형을 30 분 동안 반전 공 초점 현미경의 스테이지에 배치 챔버. 이 이미징 동안 Z 축 드리프트를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 장기 라이브 영상 전에 조직 미분 간섭 대비 현미경에 의한 손상 여부를 확인. </li><li> 광독성을 방지하기 위해, 2 mW의 아래에 레이저 파워를 사용합니다. 영상에 대한 40X 목표를 사용합니다. </li><li> 1 ㎛의 광학 간격으로 12 분에서 62 μm의 Z 스택 이미지를 획득. 10 시간 동안 총 40 회 스캔 획득. 각 사이클은 12 분의 영상 및 3 분의 휴식을 포함하는지 확인. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 연구에서는 Drosophila imaginal disc에 대한 장기 생체 영상 실험을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 디스크 손상을 피하고 커버 슬립에 디스크를 부착 할 수 있도록 많은 시간을 보냈습니다. 조직을 유지하기 위해 Poly-L-Lysine (PLL)과 저 융점 아가로 오스를 시도했습니다. 결국, 저 융점 아가로 오스는 조직을 유지하는 능력이 더 좋았다. 이 방법은 10 시간의 생체 영상주기 동안 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전이 정상적으로 발생 함을 보여주기 위해 눈 디스크 만 사용되었지만이 방법은 다른 하나의 디스크 인 날개 디스크에도 적용 할 수 있습니다. 이전 연구 3 . 또한, 배양 배지 준비 및 라이브 이미징 설정은 간단하며 폭기 또는 매질 순환을 필요로하지 않습니다. 지속적인 라이브 이미징은 생물학적 전날의 명확한 시간 순서를 제공 할 수 있습니다국세청. 눈 디스크에 아교 세포의 분화 및 마이그레이션의 우리의 이전 보고서에서, 우리는 포장 아교이 눈 디스크 3의 전방으로 마이그레이션 한 후 기존의 아교 세포에서 분화 것을 직접 증거를 제공했다. 장기 생체 문화는 자신의 행동을 삼을 따르지 같은 카에데 형광 단백질의 광 변환과 같은 세포의 특정 레이저 활성화 라벨 수 있습니다. 또한, 배양 배지에 직접 첨가되는 화학 물질의 테스트를 수용 할 수있다; 따라서,이 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수있다. 일부 동적 프로세스 분 또는 초에서 발생하기 때문에, 높은 시간 분해능이 요구된다. 시간적 해상도 광 시트 현미경 (15, 16) 또는 회전 디스크 현미경 (17)을 강화하기 좋은 선택 일 수있다. 현재 문화 상태가 완벽하지 않습니다. 그것은 디스크 성장을 지원하지 않습니다. 셀 Proliferation은 최대 12 시간 3 지원됩니다. 생체 외 배양 12 시간 후, 감광체의 분화의 비율을 3 감소하기 시작한다. 이것은 특정 영양소 나 호르몬의 부족으로 인해 수 있습니다. 이 배지에서 큰 차이가 인슐린의 높은 농도 때문에, 포유 동물 인슐린 내인성 인슐린 유사 펩타이드의 기능을 모방 한 부분 일 수있다. 플라이 추출물, 곤충 혈당 트레할로스 및 탈피 호르몬 20 hydroxyecdysone 다양한 농도의 첨가, 3 유용하지 않았다. 그러나, 12 ~ 18 시간 배양 기간은 많은 발달 과정을 연구하기에 충분하다. 애벌레 성충 디스크를 배양 대체 배양 방법 3을 비교되었고, 우리의 배양 및 이미징 조건은 라이브 영상에 대한 가장 긴 시간 창 및 대부분의 선명도를 제공합니다. 라이브 유충 및 번데기에서 디스크를 직접 영상화 할 수 있지만18, 19, 20, 21, 22, 관측 분해능과 시간 창 제한된다. 늦은 애벌레와 번데기 디스크는 오랜 시간이 23, 24에 대한 배양 있지만 디스크는 중요한 형태 형성을받을 수 있습니다. 평면, 2D 애벌레 디스크를 활용하기 위해, 우리의 배양 및 이미징 방법은 지금까지 최고의 솔루션입니다.

초파리 애벌레 성충 디스크는 생물학적 메커니즘의 다양한 연구에 대한 선호 실험 시스템이었다. 이러한 디스크는 두 상피 층에 의해 구축 SAC 형상 구조 배아 상피에서와 invaginate되고, Peripodial 상피 (PE)과 적절한 디스크 (DP) (1, 2). 성충 디스크 세포가 증식하고 점진적으로 애벌레와 번데기 단계에서 차별화하고 결국 성인 신체 구조로 개발한다. 성충 인해 디스크의 평탄 단순한 2 층 구조로, 그들은 유충 해부시 관찰하기 쉽다. 그러나, 많은 단체의 여러 노력에도 불구하고, 성충 디스크의 장기적인 문화에 대한 현재의 방법은 만족되지 않았습니다. 우리는 최근에 최대 18 시간 동안 여러 성충 디스크의 정상적인 발전을 지속 할 수있는 배양 방법을 개발하고 라이브 영상 3 수 </s&gt;까지. 배양 방법은 세포 분화 및 이동을 지원할 수 있지만, 단지 7-12 시간 동안 세포 증식을 지원할 수 있고, 디스크의 성장을 지원할 수 없다. 배지의 주요 차이점은 인슐린 (3)의 높은 농도이다. 방법은 간단하고, 특별한 포기 또는 매체 순환이 필요하지 않습니다. 가장 잘 연구 된 성충 디스크 중 하나는 눈 더듬이 디스크입니다. 초파리의 눈은 약 800 ommatidia, 개안을 구축한다. 각 개안 8 개의 시각 세포 (R1-R8)로 구성된다. 애벌레 눈 디스크에서, 광 수용체 세포 (4, 5)을 전방에서 후방에 눈 디스크를 가로 질러 밭고랑 형태 발생 (MF)의 통과에 따라 차별화. 개안의 감광체 R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 및 R8 (6) 다음에, 시작하여 순차적으로 구별. 등쪽의 ommatidia, 개안 및했습니다눈 디스크 ntral 반쪽 반대 키랄성 7, 8의 결과로, 반대 방향으로 90 ° 회전을 겪는다. 회전 공정은 두 단계로 발생한다 : 먼저, 45 ° 회전에서 시작하고 MF 뒤에 여섯째 ommatidia, 개안 행에서 완성된다; 제 45 ° 회전을 행 16 9, 10에 대해 완료된다. R3 리 / 4 특정 mδ0.5 GA4-11로 표시 ommatidial 회전 사용이 연구는, 배양이 방법을 통해 관찰 될 수있는 정상 세포 분화 및 역학을 설명하며 눈 디스크 이미지를 살.

<table><tbody><tr><td>저녹는 아가로스</td><td>AMRESCO&nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm 커버 슬립&nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>슈나이더 s Drosophila 중간&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>배양실&nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 세포 배양 시스템</td></tr><tr><td>40X 목적</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr 목표&nbsp;</td></tr><tr><td>플라이 스트레인 : nls. GFP</td><td>블루밍그턴</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

라이브 영상은 지속적으로 실시간으로 동적 인 세포 및 발달 과정을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 초파리 애벌레 성충 디스크는 같은 세포 증식, 분화, 성장, 이동, 세포 사멸, 경쟁, 세포 - 세포 신호 및 구획되지 경계 형성에 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 장기적으로 체외 문화와 성충 디스크의 라이브 이미징을위한 방법은 많은 노력에도 불구하고, 만족되지 않았습니다. 최근에, 우리는 장기 체외 문화와 최대 18 시간 동안 성충 디스크의 라이브 영상을위한 방법을 개발했다. 배지에서 높은 인슐린 농도를 사용하는 것 외에도, 저 융점 아가로 오스는 촬상 기간 표류 것을 방지하기 위해 디스크를 삽입 하였다. 이 보고서는 예제로 눈 더듬이 디스크를 사용합니다. 감광체 R3 / 4 특정 mδ0.5-GA4 발현 differen 그 감광체를 입증 하였다tiation 및 ommatidial 회전은 10 시간 라이브 영상 기간 동안 관찰 할 수있다. 이것은 간단한 방법을 기술하는 상세한 프로토콜이다.

<html> 이 예에서, R3 / R4의 감광체는 감광체의 분화를 모니터링 mδ0.5-GA4로 표지 하였다. mδ0.5-GA4뿐만 아니라 ommatidial 회전 처리를 들면, R3 및 R4에 대한 우수한 마커하게 R3 R4 11에서 강한 발현 약한 발현을 구동한다. 영화 1에서, R3 및 R4는 GFP로 표지 하였다. 10 시간 실시간 이미징 세션이 시작될 때, ommatidial 클러스터 (도 2a 및 영화 1)와 단부 (도 2B)에서 ommatidial 클러스터의 14 행 8 열의 있었다. ommatidial 분화의 비율은, 생체 디스크 7, 8, 9, 10, 11 1.5 H / 행의 비율에 가까운 행당 1.67 시간이었다s = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 , 14 . R3과 R4의 상대적 위치에 기초하여 생체 영상화 ( 그림 2A &#39;, A&#39; &#39;, B&#39;및 B &#39;&#39; ) 동안 생체 외 배양 된 원판에서 육체 회전이 일어났다. 단일 R3 / R4 클러스터는 영화 2 의 첫 번째 프레임에 흰색 구형으로 표시되었습니다. 처음에는 R3 / R4 축이 적도에 직각 인 것처럼 보입니다 ( 그림 2C 및 동영상 2 ). 그런 다음 3 ( 그림 2C &#39; ), 6 ( 그림 2C&#39; &#39; ) 및 9 ( 그림 2C&#39; &#39;&#39; ) h에서 각각 15 °, 30 ° 및 45 ° 회전합니다. 이 데이터는이 방법이 10 시간 생체 영상 도중 광 수용체 분화를 유지할 수 있음을 시사합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> 피구1 재 : 상공 회의소 총회의 회로도. 실 조립체의 개략도이다 : (1) 단계에서 수용체 이중층 O 링 부착 된 커버 슬립을 넣어. (2) 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. (3) 상기베이스를 놓는다. (4) 밀봉 로커 잠금. (5)가 O 링의 중심에 시료를 넣고 덮개를 배치했다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> 그림 2 : R3 / R4 차별화 및 회전의 라이브 영상. R3 / R4 라이브 영상의 10 시간 동안의 핵 형태의 GFP를 표현 mδ0.5-GAL4으로 표시. 모든 수치는 영화 1에서 붙 잡았다. 처음에 촬영 (A) 이미지. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A &quot;)를 왼쪽으로 (A &#39;) 및 오른쪽 (A의 박스 영역에서 확대 된 이미지&quot;). (B) 화상은 10 시간주기의 끝에서 찍은. &quot;((B&#39;-B) 왼쪽 (B &#39;) 및 우측 B)의 박스형 영역에서 확대 된 이미지&quot;. (CC &#39;&#39; &#39;) (A에서 화살표로 표시된 단일 R3 / R4 쌍&#39;)에 R3 / R4 쌍의 회전을 표시하는 시간으로 이어진다. 스케일 바 = 15㎛가 각각 ~ 10㎛, 그리고 A, B 및 C의 5 μm의. 모든 수치는 최대 강도 Z-돌기이다. 시간 스케일은 H에 도시된다 : 분. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> 영화 1 :rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> 영화 1 : <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

이 방법의 전반적인 목표는 세포 증식, 분화, 세포 사멸 및 경쟁을 포함한 다양한 생물학적 현상 연구에 널리 쓰이는 실험 대상인 성충판(imaginal discs)의 라이브 이미징을 보여주는 것입니다. 이 방법은 특정 조직에서의 세포 형태 및 이동과 같이 발생 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지속적인 이미징을 통해 세포 이동과 같이 고정된 조직보다 더 많은 정보를 보여줄 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 초보자는 해부와 마운팅 과정이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 부적절한 해부는 해상도 저하로 이어지므로, 회전 및 이동 단계를 익히는 것이 매우 까다롭기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 프로토콜을 시작하기 전, 장비를 70% ethanol로 소독하고 공기 중에서 건조시키십시오.다음으로, 초파리 배양병에서 3령 유충을 선택하고, 배양병으로 인한 오염을 방지하기 위해 1X 인산 완충 식염수(PBS)로 유충을 세척합니다. 세척된 유충을 해부 현미경 하에서 9웰 유리 스팟 플레이트에 담긴 실온의 배양액 1 mL에 넣습니다. 핀셋을 사용하여 유충의 후단에서 1/3 지점을 잡고, 다른 핀셋으로 구강 갈고리를 잡습니다.두 핀셋을 서로 반대 방향으로 당겨 내부 조직을 분리합니다. 그런 다음, 입 갈고리(mouth hook)에 부착된 안구-뇌 복합체에서 침샘, 지방체 및 큐티클을 제거합니다. 복측 신경삭이 여전히 부착되어 있다면 가위로 잘라내어 제거합니다.한 쌍의 핀셋으로 마우스 훅(mouth hook)을 잡습니다. 다른 한 쌍의 핀셋을 사용하여 등 쪽 영역에서 뇌와 안구 디스크를 연결하는 조직을 제거합니다. 그다음, 전체 복합체를 회전시켜 배 쪽이 위를 향하게 합니다.갈고리나 디스크를 뇌에 연결하는 필라멘트를 제거하십시오. 그 다음, 과정 중에 안구 디스크(eye disc)가 손상되지 않도록 주의하면서 입 갈고리를 제거하십시오. 이제 안구 디스크는 배지 내에서 자유로운 상태이며 시신경 경(optical stalk)을 통해서만 뇌와 연결되어 있습니다.아가로스를 고정하기 위해 42mm x 0.17mm 커버슬립 중앙에 O-링을 이중층으로 부착합니다. 그다음, 커버슬립을 이용해 챔버를 조립합니다. 커버슬립을 스테이지 억셉터 위에 놓습니다.그 다음, 실리콘 O-링을 커버슬립 위에 놓습니다. 이어서 베이스를 설정하고 실링 잠금 장치를 잠근 뒤 커버를 덮습니다. 10~200 µL 팁이 장착된 20 µL 마이크로피펫을 사용하여, 절제된 안구-뇌 복합체를 O-링 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다.배지를 대부분 제거하고, 0.7% 저융점 37 °C 아가로스 12 µL를 시료에 추가합니다. 아가로스를 시료에 수직으로 추가하면 조직을 커버슬립에 밀착시켜 시료가 밀려 나가는 것을 방지할 수 있습니다. O-링 중앙에 실온의 배양 배지 1 mL를 추가합니다.시료가 밀려나가는 것을 방지하기 위해 아가로스가 O-링에 잘 밀착되었는지 확인하십시오. 준비된 챔버를 도립 공초점 현미경의 스테이지 위에 30분 동안 두어 온도를 평형화합니다. 장기 라이브 이미징을 시작하기 전, 미분 간섭 대비 현미경(DIC)으로 조직이 손상되지 않고 온전한지 확인하십시오.이미지 촬영을 위해 대물렌즈를 40x로 전환하십시오. 마지막으로, 1µm의 광학적 간격으로 12분 동안 62µm Z-stack 이미지를 획득하십시오. 총 10시간에 걸쳐 40회의 스캔 사이클을 수행하며, 각 사이클은 12분의 이미지 촬영과 3분의 휴식 시간을 포함해야 합니다.R3와 R4는 GFP로 표지되었습니다. 10시간의 라이브 이미징 세션 시작 시점에는 8행의 낱눈 군집이 있었으며, 종료 시점에는 14행의 낱눈 군집이 관찰되었습니다. R3와 R4의 상대적 위치를 바탕으로 볼 때, 라이브 이미징 도중 ex vivo 배양된 디스크에서 낱눈 회전이 일어났음을 알 수 있습니다.처음에 R3/R4 축은 적도와 수직인 것으로 보입니다. 그 후 3시간에 15도, 6시간에 30도, 9시간에 45도 회전하는 것으로 나타나며, 이는 본 방법이 10시간의 라이브 이미징 동안 광수용기 분화를 유지할 수 있음을 시사합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 Drosophila 안구 디스크를 적절하게 해부하고 라이브 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를...

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

배우세요 Drosophila 초파리 눈 디스크의 장시간 라이브 이미징 방법을 통해 광수용체 분화와 소막 회전을 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 10시간 동안 조직 완전성을 유지하며 세포 형태와 이동을 연구할 수 있습니다.

장기의 라이브 영상

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