학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출

본 실험 과정의 전체적인 목표는 효모 에스트로겐 스크리닝을 사용하여 퍼스널 케어 제품에서 추출한 인간 에스트로겐 수용체 작용제의 양을 측정하는 것입니다. 이 방법은 물, 식품 및 퍼스널 케어 제품 내의 환경 에스트로겐을 검출하고 정량화할 수 있으므로 독성학, 내분비계 교란 및 생태 생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 인 비트로(in vitro) 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 널리 사용되며, 기술적인 실험실 숙련도를 교육하기 위한 훌륭한 플랫폼을 제공한다는 점입니다.

환경 에스트로겐의 검출은 특히 태아 발달기나 사춘기와 같은 생리적 전환기에 호르몬 신호 전달을 변화시킬 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이 방법에서 가장 어려운 부분은 계산과 데이터 분석이며, 저희는 사용하기 쉬운 애플리케이션을 개발하여 이를 간소화했습니다. 또한, 정확한 피펫팅이 필수적입니다.

본 프로토콜은 시약 제조부터 시작합니다. 분석 첫째 날에 사용할 glucose 및 galactose 배지, 50% ethanol 용매 대조군, estradiol 표준물을 준비하고, 둘째 날에 사용할 LacZ 완충액, dithiothreitol 및 sodium carbonate를 준비하십시오. glucose 및 galactose 배지는 0.2 µm 필터로 여과하여 멸균합니다.

하나의 96-well 플레이트에서 최대 23가지의 서로 다른 퍼스널 케어 제품(PCP) 및 추출 대조군을 3반복으로 테스트할 수 있습니다. PCP에는 비누, 헤어 크림, 샴푸, 자외선 차단제, 메이크업 제품, 면도 크림 및 로션이 포함됩니다. 촬영을 위해 8가지의 PCP로만 시료를 준비합니다.

각 샘플 1g을 15mL 원추형 튜브에 넣고 무수 에탄올 10mL와 혼합합니다. 또한, 15mL 원추형 튜브에 무수 에탄올 11mL를 넣어 음성 추출 대조군을 준비합니다. 각 원추형 튜브의 내용물을 수동 흔들기와 볼텍싱을 병행하여 30분 동안 균질화합니다.

원심분리기용 버킷을 사용하여 원뿔형 튜브를 최대 허용 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 각 튜브의 상층액을 40-micrometer 세포 스트레이너를 통해 50-milliliter 원뿔형 튜브에 디캔트합니다. 그런 다음 각 50-milliliter 튜브의 내용물을 유리 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.

환기 후드 내에서 바이알의 뚜껑을 열어둔 채로 일주일 동안 두어 에탄올을 완전히 증발시킵니다. 빛에 민감한 성분의 분해를 방지하기 위해 건조 중인 시료를 빛으로부터 차단하십시오. 시료가 건조되면 각 시료를 1 mL의 50% ethanol로 재구성한 다음, 볼텍싱하여 균질화합니다.

효모 에스트로겐 스크리닝(yeast estrogen screen) 또는 YES 플레이트를 준비하기 약 이틀 전(약 42시간 전), 멸균 기술을 사용하여 각각의 활성 효모 배양액 0.1 milliliters를 멸균된 삼각 플라스크에 담긴 필터 멸균된 포도당 배지 10 milliliters에 첨가하여 효모를 계대 배양합니다. 30 degrees Celsius에서 배양하고, 기존 배양액은 스톡으로 계속 배양합니다. 이틀 후, YES 어세이 1일 차에 멸균 기술을 사용하여 부유 효모 배양액과 필터 멸균된 갈락토스 배지를 멸균된 비커에 희석합니다.

각 효모 샘플 120 µL와 갈락토오스 배지 공시료를 각각 3반복으로 투명 폴리스티렌 플레이트에 피펫팅하여 흡광도를 확인합니다. 플레이트 분광광도계를 사용하여 희석된 효모 배양액이 610 nm 파장에서 0.065 ± 0.005의 순 흡광도를 갖는지 검증합니다. 갈락토오스 배지 공시료의 OD610 값을 빼서 효모의 순 OD610을 결정합니다.

멸균 주사기 팁이 장착된 리피팅 피펫을 사용하여, 이 플레이트 레이아웃에 따라 희석된 효모 현탁액을 멸균 폴리프로필렌 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 분주합니다. 피펫팅 하는 동안 비커를 계속해서 돌리거나 피펫으로 혼합하여 효모가 가라앉지 않고 현탁 상태를 유지하도록 합니다. 마지막으로, 플레이트 레이아웃에 녹색으로 표시된 H10에서 H12 웰에 필터 멸균된 갈락토스 배지 120 µL를 추가하여, 배지 자체에 의한 흡광도를 보정하기 위한 배지 대조군으로 사용합니다.

테스트할 효모 균주와 비색 기질의 각 조합별로 별도의 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 플레이트 배치도에 따라 연속 희석을 수행하여 각 플레이트에 표준 곡선을 작성합니다. 멸균 팁이 장착된 단일 채널 피펫을 사용하여 웰 A1, A2, A3에 estradiol 표준물질 5 µL를 추가합니다. 다채널 피펫으로 웰의 내용물을 피펫팅하여 혼합한 다음, 웰 A1~A3에서 웰 B1~B3로 205 µL를 옮깁니다. G행까지 205 µL 전이 과정을 반복합니다. 연속 희석이 완료되면 웰 G1~G3에서 205 µL를 제거합니다. 이 단계가 끝나면 모든 표준 웰에는 120 µL가 포함되어 있어야 합니다.

이 플레이트 배치도에서 파란색으로 표시된 효모 현탁액이 포함된 각 vehicle control 웰인 H1, H2, H3에 50% ethanol 5 µL를 추가합니다. 다음 단계는 플레이트 배치도에서 보라색으로 표시된 효모 현탁액 포함 웰에 샘플 또는 음성 추출 대조군(negative extraction controls)을 5 µL씩 세 번 반복하여 추가하는 것입니다. 어떤 샘플이나 추출 대조군이 어느 웰에 배치되었는지 기록하십시오.

어느 웰에 샘플이 있고 어느 웰에 없는지 추적하려면, 새 팁 박스를 준비하여 박스 내 팁의 위치를 플레이트 내 해당 웰의 위치와 동일하게 사용하여 팁을 선택하십시오. 샘플, 추출 대조군 및 용매 대조군 웰의 내용물을 피펫팅하여 혼합합니다. 각 웰에서 205 µL를 제거하여 해당 웰의 부피를 120 µL로 조정하십시오.

각 플레이트를 멸균된 접착성 다공성 필름으로 밀봉하고 라벨을 부착한 뒤, 30 °C에서 17시간 동안 배양합니다. 17시간의 배양이 끝나면 플레이트를 배양기에서 꺼냅니다. 플레이트를 즉시 처리할 수 없는 경우, 랩으로 감싸 4 °C에서 6일 동안 냉장 보관합니다.

플레이트를 처리할 준비가 되면 포장을 풉니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 행의 웰 내용물을 혼합한 다음, 각 웰에서 50 µL의 효모 현탁액을 투명 폴리스티렌 96-웰 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 새 플레이트에 라벨을 부착합니다.

웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 웰마다 새로운 피펫 팁을 사용하되, 팁이 반드시 멸균 상태일 필요는 없습니다. 흄 후드 내에서, 해동하여 상온 상태인 LacZ 버퍼 20 milliliters에 1 molar DTT 20 microliters를 첨가하여 DTT의 최종 농도가 1 millimolar가 되도록 합니다. LacZ 버퍼를 잘 혼합합니다.

리피팅 피펫을 사용하여 DTT와 ONPG 또는 CPRG가 포함된 LacZ 버퍼 200 µL를 폴리스티렌 플레이트의 모든 웰에 분주하고, 플레이트 리더를 사용하여 즉시 모든 웰의 610 nm에서의 흡광도를 측정하고 기록합니다. 추가 플레이트가 있는 경우 필요한 만큼 반복합니다. 플레이트를 덮개로 덮고 지정된 시간 동안 30 °C에서 배양합니다.

배양이 완료되면 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 리피팅 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 µL의 탄산나트륨을 첨가하여 베타-갈락토시다아제 반응을 중단시킵니다. 플레이트 분광광도계를 사용하여 모든 웰의 흡광도를 ONPG의 경우 405 nm에서, CPRG의 경우 574 nm에서 측정하고 기록합니다.

Java가 설치되어 있어야 하는 자동화 애플리케이션을 사용하여 LacZ 값을 계산할 수 있습니다. 먼저, 부록 1에 설명된 LacZ 자동화 애플리케이션을 엽니다. 그림 1에 표시된 것과 동일한 플레이트 레이아웃을 사용하여, 모든 웰의 ONPG에 대한 405 nanometers 또는 CPRG에 대한 574 nanometers 광학 밀도 측정값을 붙여넣으십시오.

분석 시 발색이 나타나기까지의 배양 시간과 시간을 입력한 후 Next를 클릭하십시오. 모든 웰의 610 nanometers에서의 흡광도 측정값을 붙여넣으십시오. Submit을 클릭하여 LacZ 결과를 표시하십시오.

LacZ 결과는 키보드 명령어를 사용하여 복사한 뒤, 필요에 따라 스프레드시트나 다른 파일에 붙여넣을 수 있습니다. 온라인 YES 분석 데이터 분석 애플리케이션을 열어 분석을 시작하십시오. 첫 번째 탭에 설명된 형식으로 작성된 CSV 데이터 파일을 업로드하십시오.

두 번째 탭에서 estradiol 표준 곡선을 디지털화하고 회귀 매개변수를 추정하십시오. 세 번째 탭에서 회귀 모델 출력 결과를 확인한 다음, 네 번째 탭에서 샘플의 LacZ 값에 해당하는 보간된 x축 값을 찾으십시오. 다섯 번째 탭을 클릭하여 샘플의 에스트로겐 당량 또는 EEQ 값을 확인하십시오.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 EEQ 값을 원래 샘플 질량에 맞게 표준화하십시오. 효모를 17 beta-estradiol과 함께 17시간 동안 배양한 후의 표준 곡선 예시가 제시되어 있습니다. 원고에서 논의된 이유로 인해, 일반적으로 CPRG가 ONPG보다 더 나은 기질 선택지입니다.

이전 관찰 결과와 일치하게, ER Beta를 발현하는 효모를 이용한 분석법은 ER Alpha를 발현하는 효모를 이용한 분석법보다 민감도가 한 자릿수 이상 더 높았습니다. 따라서 ER Beta 발현 효모에서 에스트로겐 활성이 더 빈번하게 검출되었습니다. 본 연구의 추가적인 목적은 학부 실험 과정 일정에 적합한 배양 시간을 테스트하는 것이었습니다.

17시간 배양 후 6일간의 냉장 보관 기간을 도입했을 때, 냉장 보관한 플레이트의 표준 곡선은 냉장 보관하지 않은 플레이트의 곡선과 유사했습니다. 4-매개변수 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 추정한 매개변수의 표준 오차는 냉장 보관한 플레이트가 냉장 보관하지 않은 플레이트보다 모두 작았습니다. 따라서 플레이트를 6일 동안 냉장 보관하면 오차가 줄어들고 EEQ 추정치의 정확도가 향상됩니다.

이 기술을 숙달하면 3~4시간 분량의 세션을 두 번 진행하여 완료할 수 있습니다. 실험 절차를 수행할 때, 17시간의 배양 기간 이전에 수행되는 모든 단계에서 무균 조작법을 적용하고, 정확하고 세심하게 피펫팅하며, 그림 1에 제시된 플레이트 배치를 따르는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 에스트로겐 작용의 추가적인 메커니즘과 개체 전체에 미치는 영향을 조사하기 위해 생체 내(in-vivo) 동물 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 이후, 효모 에스트로겐 스크리닝은 식품, 식물 조직 및 개인용 세정 제품과 같은 환경 시료 내의 에스트로겐성 리간드를 측정하는 저비용 측정법으로 인정받았습니다. 이 영상을 시청하고 나면 개인용 세정 제품의 간단한 추출 방법, 효모 배양, 표준 희석 곡선 작성, 96-웰 플레이트를 이용한 YES 분석 수행 및 관련 계산 완료 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 estradiol을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑 및 기타 개인 보호 장구를 착용하고 적절한 폐기 방법을 준수하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.