Name: 학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: 배우세요 효모 에스트로겐 스크린을 사용하여 퍼스널 케어 제품에서 환경 에스트로겐을 정량하는 방법을. 이 저렴한 기술은 내분비 교란 물질 연구와 학부 실험실 교육에 탁월한 플랫폼을 제공합니다.

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이 프로젝트는 시작 자금 TME 및 AMR 루이지애나 기술 대학, Furman 대학에서 각각에 의해 투자 되었다. AMR 및 국립 과학 재단 그리고 루이지애나 Regents 보드에서 TME 여행 수상에서 TME 루이지애나 EPSCoR Pfund 그랜트, 남쪽의에 관련 된 대학에서 TME 2015 교수 발전 보조금에 의해 제공 된 추가적인 자금에 남쪽의 대학입니다. 우리 감사 박사 데이비드 Eubanks (Furman) 통계 분석 및 씨 크리스토퍼 무어에 대 한 "우리에 게 주는 손을" 촬영 하는 동안.

1. 시 약
<ol>
	<li>6.7 g 효 모 질소 기본, 20 g 포도 당 또는 갈 락 토스, 20mg 아데닌 황산 (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL), 20 mg uracil (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL) 혼합 하 여 포도 당 그리고 갈 락 토스 미디어 준비 60 mg 신 (1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 6 mL 추가), 그리고 이온 물 여과 (0.2 µ m 필터)에 의해 1 L. Sterilize의 마지막 볼륨에 20mg 히스티딘 (추가 1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 2 개 mL). 몇 주 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>Estradiol (e 2) 표준 녹이는 가루 E2 무수 에탄올에 적절 한 작동 농도를 희석 하 여 준비 (227.5 nM &#38; 9.75 nM) 50% 에탄올에. 참고: estradiol 1mg의 유리병으로 구입한 경우 해산 estradiol 분말 유리병에 직접 1 mL 에탄올을 추가 합니다. 이 3.67 m m 재고 # 1을 생성합니다.  주식의 36.71 μ M #2 1 mL을 990 μ 에탄올에 #1 주식의 10 μ 희석.  그런 다음 희석 367.13 nM 주식 # 3의 1 mL을 990 μ 50% 에탄올에 #2 주식의 10 μ.  작업 주식을 하려면 619.7 μ 주식 #3 227.5 nM 일 주식 ERα을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 만드는 데 사용의 1 mL를 만들려고 380.3 μ 50% 에탄올을 희석.  26.56 μ 주식 #3 1 mL의 9.75 nM 작업 ERβ을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 작성 하는 데 사용 하도록 973.44 μ 50% 에탄올을 희석. 표준 parafilm와-20에 게 인감 또는-70 ° C 주의: e 2는 발암 의심된 물질 및 생식 toxicant. 그것은 흡입, 삼 켜, 또는 피부를 통해 흡수 하는 경우에 유해한입니다. E2 모유 어린이 태아에 해를 일으킬 수 있습니다. E2 수생 생활에 매우 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)을 사용 하 고 임신과 수 유 동안 노출을 피하십시오. 유해 폐기물으로 e 2를 처분 하 고 환경에 공개 하지 마십시오.</li>
	<li>마지막에 이온된 수에 8.52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2포4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 세대 N-lauroylsarcosine 나트륨 소금, ONPG (400 mg) 및 CPRG (77.7 m g)를 혼합 하 여 LacZ 버퍼를 준비 -20 ° c.에 20 mL aliquots에 1 나 저장소 LacZ 버퍼의 볼륨 참고: 20 mL aliquot는 충분 한 96 잘 접시입니다.</li>
	<li>105.9 g 1 나 게 실시간의 최종 볼륨을 이온된 수에 탄산 나트륨을 혼합 하 여 탄산 나트륨을 준비</li>
	<li>준비 물에서 1 M dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 DTT의 25 µ L aliquots 고정 주의: DTT는 급성 피부 및 눈 자극. 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)를 사용 하 여 피부와 눈 접촉, 흡입 및 섭취를 피하기 위해. 참고: 각 약 수 한 96 잘 접시 충분 하다.</li>
</ol>
2. 샘플 및 추출 컨트롤 준비
<ol>
	<li>샘플 테스트를 선택 합니다. 참고:이 문서 15 Pcp, 비누, 헤어 크림, 샴푸, 선스크린, 립밤, 재단, 면도 크림, 매니큐어, 그리고 로션을 포함 하 여에 대 한 데이터를 제공 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 무수 에탄올 10 mL에 1 g 샘플의 결합. 15 mL 원뿔 튜브에서 에탄올의 11 mL의 구성 된 부정적인 추출 제어를 준비 합니다. 필요에 따라 복제를 준비 합니다. 참고: 제시 실험 설계에 대 한 모든 15 Pcp 및 triplicate 추출 제어 솔루션의 3 aliquots 준비 되었다, 저조한 총 48 샘플, 각각의 섹션 4에에서는 프로토콜을 사용 하 여 3 중에서 분석 했다. 단일 플레이트 triplicates에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다. 무수 에탄올은 쉽게 증발 하기 때문에이 단계에서 사용 됩니다. 부정적인 추출 제어를 사용 하 여 에스트로겐 원뿔 튜브에서 샘플에 leaching 하지는 확인.</li>
	<li>수동 진동 및 vortexing의 조합에 의해 또는 다중 튜브 vortexer에 튜브를 떨고 하 여 30 분 동안 튜브 내용을 균질.</li>
	<li>원심 10 분 Decant 대 양동이 분리기에 최대 허용 속도에 원뿔 튜브 각 튜브에서 상쾌한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 원뿔 관으로. 유리 섬광 유리병으로 각 50 mL 튜브의 빈 내용입니다.</li>
	<li>두고 튜브 에탄올을 완전히 증발 수 있도록 1 주일에 대 한 환기 후드에서 엽니다. 또는, 통풍된 후드 또는 회전 증발 기 질소 아래에 샘플을 건조. 빛 민감한 성분의 저하를 방지 하려면 (예를 들어, 통풍된 후드 문에 장소 불투명 원단) 빛에서 건조 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>50% 에탄올과 균질에 소용돌이의 1.0 ml 샘플 reconstitute</li>
</ol>
3. 배양 및 효 모14 Subculturing
<ol>
	<li>30 ° c.에 필터 살 균 포도 당 미디어에서 효 모 배양에 의해 활성 효 모 문화 ( S. cerevisiae14의 재조합 W303a 변형)을 유지 신선한 필터 살 균 포도 당 미디어에서 매주 효 subculture</li>
	<li>2 박 (약 42 시간) 예 판 준비 전에 subculture 무 균 기술을 사용 하 여 필터 살 균 포도 당 미디어의 10 mL를 활성 효 모 문화의 0.1 mL를 추가 하 여 효 모.  이틀 동안 30 ° C에서 품 어.  만약 효 모는 성장 얕은 문화로 살 균 250 ml 삼각 플라스 크를 흔들어 필요 하지 않습니다. 참고: 효 모도 저장할 수 있습니다 냉장된 한 판에 몇 달 동안. 장기 저장을 위해 (년), O/N 문화 15-50% 메 마른 글리세롤, 소용돌이, 및 결합-70 ° c.에 동결 살 균 글리세롤을 준비 하려면 주사기를 사용 하 여 느슨하게 모자 cryovial 고 압력솥에 300 µ L 글리세롤을 전송. 그럼 1200 µ L O/N 효 모 문화 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다.</li>
</ol>
4. 준비 예 판 (분석 결과 1 일)
<ol>
	<li>살 균 비 커, 무 균 기술을 사용 하 여 희석 610에서 0.065 0.005의 광학 밀도 단계 3.2에서에서 효 모 살 균 하는 필터 갈 락 토스 미디어에 nm (OD610).<ol>
		<li>명확한 폴리스 티 렌 격판덮개로 각 효 모 샘플 triplicate 갈 락 토스 공백 함께 3 중에 pipetting 120 μ에 의해 광학 밀도 확인 (접시 필요가 없습니다 살 균 수).  플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 희석된 효 모 문화 누 룩의 net OD610 를 결정 하기 위해 효 모 OD610 독서에서 갈 락 토스의 0.065 0.005 빼기 OD610 판독의 net OD610 있는지 확인 합니다. 각 96 잘 접시 적어도 30 mL 희석 효의 최종 볼륨을 준비 합니다. 참고: 595 610 nm 사이의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 필터는이 측정을 위해 사용할 수 있습니다.</li></ol></li></ol>대략 1:6 v: 비 효 모: 미디어의 일반적으로 수익률 0.065 가까이 OD610 , 그래서 30 mL 미디어 4.5 mL 누 룩을 추가 하 여 시작 하 고 netOD610 0.060 0.070 사이 달성 하기 위해 적절 한으로 더 많은 효 모 또는 미디어를 추가.
	
	
	<li>무 균 기술을 사용 하 여, 웰 스는 살 균의 폴 리 프로필 렌, 96-잘 microplate 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 희석된 효 모 현 탁 액이 추가 합니다. Pipetting, 동안 유지 소스 지속적으로 컨테이너 소용돌이 또는 피펫으로 혼합에 의해 중단 하는 효 모. 이 단계에 대 한 멸 균 주사기 팁 반복 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다. 참고: 폴 리 프로필 렌 플레이트 압력가 마로 소독 두 누적된 판 호 일에 포장 하 여 멸 균.  상단 플레이트 샘플 접시 뚜껑 역할 수 세척, 다시 압력가 하는, 그리고 다시.</li>
	<li>3 추가 웰 스 (h 10-12) 플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 120 µ L 필터 소독 갈 락 토스 미디어를 추가 합니다. 이러한 우물 혼자 미디어에 의해 공헌 하는 흡 광도을 미디어 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>직렬로 e 2 작업 표준의 triplicates를 diluting 하 여 각 접시에 표준 곡선을 생성 (227.5 nM ERα, 9.75에 대 한 ERβ에 대 한 nM) 효 모 현 탁 액 (A1-g 3은) 격판덮개 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 하는 우물에.  웰 스 A1 a 3 통해 E2 표준의 5 µ L을 추가 하 여 먼저. Pipetting, microwell 내용을 혼합 하 고 순차적으로 우물 A1-B1-3 웰 스에 3에서에서 205 µ L를 이동 하 여이 현 탁이 액을 희석. 혼합 및 행 G. 통해 205 µ L의 이전 반복 참고: 직렬 희석 완료 되 면 우물 g 1-3에서에서 205 μ를 삭제 합니다. 이 단계의 끝에, 모든 표준 웰 스 120 μ를 포함 해야 합니다. 직렬 희석 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 얻을 것입니다. 직렬 희석 단계에 대 한 멸 균 팁 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다.</li>
	<li>차량 제어 웰 스 효 모 현 탁 액 (h 1-3) 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 된 차량 (50% 에탄올)의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 차량 제어 웰 스는 효 모 세포 및 미디어와 관련 된 배경 흡 광도 측정 하는 데 사용 됩니다. 또한, 테스트 샘플의 OD610 값을 비교 하 여 검출 될 수 있다 세포 독성 또는 성장 촉진 효과와 차량 제어 우물의 우물을 테스트 합니다.</li>
	<li>플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 효 모 현 탁 액을 포함 하는 웰 스에 샘플 및 부정적인 추출 컨트롤의 5 µ L triplicates를 추가 합니다. 참고: 기록해 샘플 또는 부정적인 추출 컨트롤이 추가 되는 각 음에.  추적 하는 웰 스 샘플 하 고는 하지 않는, 팁의 신선한 상자와 함께 시작 하 고 접시에 해당 우물의 위치와 상자에 동일한 위치에서 도움말을 사용 하 여 있다. 한 96 잘 접시는 3 중에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다.</li>
	<li>Pipetting으로 샘플, 추출 제어, 그리고 차량 제어 웰 스의 내용을 혼합. 그림 1에 대 한 범례에 설명 된 대로 각 205 µ L을 제거 하 여 120 µ L에이 우물의 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>살 균, 접착제, 다공성 필름으로 plate(s) 인감. 접시를 레이블 및 17 h 30 ° c.에 대 한 품 어 접시 외피 동안 흔들릴 필요는 없습니다.</li>

5. 처리 예 판 (분석 결과의 주 2)
<ol>
	<li>30 ° C에서 17 h 부 화 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 접시는 즉시에서 처리 될 것입니다, 5.1.1 단계로 진행 합니다. 접시는 나중에 처리 됩니다, 5.1.2 단계로 진행 합니다.<ol>
		<li>멀티 채널 pipettor 우물, 각 행의 내용을 믹스를 사용 하 여 그리고 명확 하 고, 폴리스 티 렌, 96-잘 microplate의 해당 각 우물에서 효 모 현 탁 액의 50 µ L을 전송. 참고: 폴리스 티 렌 접시 살 균 될 필요가 없습니다 하지만 뚜껑이 있어야 한다. 사용 하 여 새로운 피펫으로 팁 웰 스의 각 행에 대 한 교차 오염 우물을 피하기 위해 팁만 triplicate 세트 사이 변경 해야 8 팁 멀티 채널 피 펫과 triplicates에 걸쳐 pipetting, 경우.<ol>
			<li>새로운 플레이트를 레이블을 지정 합니다. 5.2 단계로 진행 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>저장 처리 하기 전에 격판덮개, 플라스틱 랩에 포장. 6 4 ° C에서 래핑된 플레이트를 냉장 디 그 후, 냉장고에서 플레이트를 제거, 그들 풀 다 그리고 단계 5.1.1 에서처럼 pipetting에 의해 모든 우물의 내용을 전송. 5.2 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1mm DTT의 최종 농도 대 한 해 동된, 실내 온도 LacZ 버퍼의 20 mL를 1 M DTT의 20 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스 LacZ 버퍼입니다. 다중 채널 피 펫을 사용 하는 경우 시 약 저수지로 분배. 주의: 장갑을 착용 하 고 가능한 경우 후드, DTT와 함께 작동</li>
	<li>어느 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 또는 pipettor 반복, 폴리스 티 렌 판 모든 우물에 DTT ONPG 및 CPRG를 포함 하는 LacZ 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 측정 한 즉시 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물의 OD610 기록. 추가 번호판에 대 한 필요에 따라 반복 합니다. 참고: OD610 판독 LacZ 계산 (단계 6.1)의 분모에 사용 됩니다. 이러한 이유로, 읽기 pipetting 직후와 셀 정착 하기 전에 얻거나 LacZ 버퍼에 의해 lysed. OD610 값 샘플 웰 스에 대 한 눈에 띄게 높거나 차량 제어 웰 스에 대 한 OD610 값 보다 낮은 경우, 샘플 추출은 성장 촉진 또는 효 모 세포 독성 각각. 계산 셀 밀도 작은 차이 웰 스, 하지만 차이가 어느 방향으로 30%를 초과할 경우 전체 수정 것 이다 LacZ 추가 50% 에탄올에 (단계 2.6)에서 재구성된 샘플 희석 그리고 3.2 단계로 반환 하 여이 샘플을 다시 테스트 12.</li>
	<li>커버 뚜껑 접시. 그 표현 ERα14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 3 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 그 표현 ERβ14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 4 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 참고: CPRG를 사용할 경우 보육 시간 있습니다 유연; 잠복기 2-4 h에 대 한 분석 결과 감도 증가 하는 더 이상 외피와 두 수용 체와 적당 한 결과 생성 합니다.</li>
	<li>플레이트 잠복기 후 각 우물에 탄산 나트륨의 100 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫 또는 반복 pipettor을 사용 합니다. 탄산 나트륨 pH를 제기 하 고 β-galactosidase 반응 중지.</li>
	<li>측정 하 고 OD405 (ONPG)에 대 한 또는 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물 (CPRG)에 대 한 OD574 기록.</li>
</ol>
6입니다.LacZ 값 계산
참고: LacZ 값 각 샘플에 대 한 색상 변경의 정도 계량 하 고 제공 하는 몇 가지 변수를 고려 하 여 별도 분석 실험 간의 값을 비교 하는 정규화 된 방법 (예, 효 모 광 밀도, 미디어 광 밀도, 그리고 보육 시간 이 같은 접시에 우물 마다 다릅니다)12.
<ol>
	<li>미디어 (갈 락 토스) 제어 웰 스 (h 10-12), triplicate OD610 값의 의미를 계산 하 고 계산 triplicate OD405 또는 차량 (50% 에탄올) 컨트롤 (h 1-3)에 대 한 OD574 값의 의미. 사용 하 여 이러한 의미와 부 화 시간 (t) 접시에 대 한 시간에 색상 (단계 5.5) LacZ 값 (각 잘에서 색상 변경의 정도 해당) 계산을 변경 모든 표준에 대 한 및 샘플 우물 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>또는 LacZ 표준 및 샘플에 대 한 값을 계산할 부록 1 에서 자동된 응용 프로그램을 사용 합니다. 참고: 응용 프로그램 함께 사용 하는 접시 레이아웃 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 부록 1 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다.  이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다.  또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>각 샘플에 대 한 각 E2 표준 triplicate LacZ 값의 의미를 계산 합니다. LacZ 평균값 µ L-1으로 보고 h-1. 로그 변환 표준, 각 E2의 농도 그리고 template.csv 파일 (부록 2)에서 같이 형식의 스프레드시트 문서를 생성.</li>
</ol>
7. 샘플 Estradiol 등가물 (EEQs) 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 보간
참고: EEQs e 2를 사용 하 여 만든 표준 곡선의 LacZ 값 샘플 LacZ 값 (색상 변경) 관계. EEQs는 따라서 얼마나 많은 샘플은 e 2의 알려진 농도 같은 색상 변경 응답을 유도 하는 데 필요한 결정 합니다.
<ol>
	<li>EEQs 테스트 샘플을 계산 하려면 먼저 표준 곡선을 플롯. E2 표준 (y 축) 및 해당 로그 변환 E2 농도 (x 축) 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델에 대 한 평균 LacZ 값에 맞게.</li>
	<li>테스트 샘플 LacZ 값 EEQs을 보간 하는 모델을 사용 합니다. 부록 2에 설명 된 대로 통계 소프트웨어를 사용 하 여 EEQs의 로지스틱 회귀 계산을 수행 합니다.</li>
</ol>
8. 표준화 주치의 샘플 질량에 EEQs (ng/mL)
<ol>
	<li>EEQs 주치의 샘플에 추가 금액에 관련 된 각 단계 4.5에서에서 잘, 증식 EEQ (ng/mL) 샘플 웰 스 (325 µ L)으로 도금 총 볼륨 그리고 다음 추출된 샘플 추가 볼륨을 나누어 각 음 (5 µ L)에. 참고:이 값은 추출 된 샘플의 mL 당 EEQ를 나타냅니다. 주치의의 1 g를 사용 하 여 샘플 준비, 이러한 값 그램 주치의 (ng/g) 당 EEQ를 또한 나타냅니다. 이 방식으로 표현, EEQ 값 (ng/g) 비교 될 수 있다 다른 Pcp. EEQ (ng/g) 값이 연구에서 테스트 하는 퍼스널 케어 제품 표 2에 표시 됩니다 및 전체 프로토콜에 걸쳐 수집 된 샘플 데이터는 에 포함 되어 있습니다. 부록 3.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

예 물, 음식, 식물 조직, 개인 케어 제품 등 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하는 저렴 한 비용 방법입니다. 데이터 되 게 여기 비교 2 에스트로겐 수용 체 (ERα 및 ERβ), 2 기질 (ONPG 및 CPRG), 그리고 2 타임 라인 (냉장 없이 2 d 프로토콜)과 7 일 프로토콜 냉장 예 분석 결과 통해 퍼스널 케어 제품에 estrogenicity를 측정. 한 번만 만족 하는 학부 실험실 과정에 의해 부과 된 또한 시간 제약와 호환 되는 동안 7 d 냉장된 프로토콜 사용 하 여 CPRG 및 ERα 및 ERβ를 가장 잘 표현 하는 효 모 EEQs 단정 / 여러 h 주. 사실, 냉장 없이 2 d 분석 결과에 비해, 7 일간 냉장된 분석 결과와 연관 되었다 감소 분산 판 복제에 걸쳐. 또한, 표준 곡선의 선형 부분 약간 냉장된 분석 결과 사용 하 여 수집 된 데이터에 대 한 확장 되었다. 표준 곡선의 선형 부분 분석 결과 검색 범위를 정의 하 고 샘플 EEQs 보간 하는 데 사용할 수 있는 표준 곡선의 유일한 부분입니다.
테스트 샘플 중 하나를 제외한 모든, CPRG를 사용 하 여 측정 하는 EEQs ONPG와 정량 보다 낮은 했다. 와 높은 멸종 계수 및 낮은 Km V최대, CPRG ONPG17보다 10 배 더 과민 하다. 따라서, CPRG 더 낮은 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 β-galactosidase의 낮은 금액을 감지 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 CPRG ONPG,1819통해 일반적으로 기본 설정입니다. 그러나, 큰 기판 감도 낮은 EEQ 값 CPRG을 검색 설명 하지 않는다. 다른 저자2,18에 의해 설명 했 듯이 ONPG 발견 높은 EEQ 값 분석 결과, 매트릭스 방해가 때문일 수 있었다. 퍼스널 케어 제품 추출 물에서 노란 안료 ONPG 감지 하는 EEQ 값을 부 풀 려 수 있습니다. 다른 그들의 실험 디자인2, 실험에 있는 격판덮개의 수를 두 배로 하는 방법에에서 안료 컨트롤을 포함 하 여이 문제를 피할 수 있다. 매트릭스 간섭 문제가 있을 수 있습니다, 비록 더 비싼 ONPG 보다 긴 부 화 시간을 요구 한다 CPRG 예 분석 결과 대 한 바람직 기판 될 수 있습니다. 또한, β-galactosidase에 의해 기판의 분열에 의해 유도 된 색상 변경 쉽게 결과 시각화 하기 위해 학생 들을 위한 CPRG와 함께 더 극적 이다.
밀러 외. (2010), 누가이 프로토콜에 사용 되는 누 룩을 설계, 표현 ERβ 30 x 17β estradiol ERα, 우리의 데이터14에 의해 입증 발견을 표현 하는 효 모 보다 더 민감한 했다 그 누 룩을 지적 했다. 플라스 미드 건설, 밀러 그 외 여러분 에서 잠재적인 뉘앙스를 제외 하 고 (2010 년) 감도14에이 차이 설명할 수. 한 차이 두 플라스 미드 구조 ERβ 식 포도 당 또는 갈 락 토스에 의해 규제 됩니다 반면 ERα 식 갈 락 토스에 의해 통제 된다 이다. 예 시험에 사용 된 효 모 포도 당 미디어에서 교양 있으며 그들이 분석 결과의 시작에서 희석 하 때만 갈 락 토스를 주어진. 따라서, ERβ을 표현 하는 효 모 복사본 수가 수용 체 단백질 estrogenic ligands에 높은 감도 부여 함으로써 분석 결과의 시작 이전에 축적 수 있습니다.
ERα 표현 효 낮은 감도 감지 ERα ERβ와 비교 측정 샘플에서 estrogenicity의 더 높은 속도 설명할 수 있다. 가능성을 증가 하는 샘플 EEQs 검색 됩니다, 사용자 수 다른 추출 용 매 및 방법 또는 높은 볼륨 샘플의 누 룩을 추가. 높은 샘플 볼륨을 사용 하는 경우는 같은 양의 표준 및 샘플 분석 결과에 사용할 수 있습니다 표준 E2의 농도 조정 되어야 한다. 더 많은 샘플을 추가 한 한계 효 모 30 대 35 ° C20의 외피 온도에 더 나은 공차와만 6-10%의 에탄올을 참을 수입니다. 효 모에 에타 놀의 효과 제어 하려면 조사 triplicate "효 모 만" 웰 스 플레이트 레이아웃을 고이 "효 모 만" 웰 스의 OD610 즉시 비교 차량 제어 우물의 OD610 은 확인 후에 LacZ 버퍼의 추가. 또는, 에탄올에 용 해 하는 샘플 건조 microwell 접시와 효 모 추가 되기 전에 떨어져 증발 하는 에탄올에 추가할 수 있습니다. Dimethylsulfoxide (DMSO)는 또한 사용 예에 예제 용 매 분석 실험, 하지만 효 모와 DMSO의 최종 작업 농도 112에 국한 되어야 합니다.
예 시험 환경 샘플에서 estrogenicity을 탐지 하기 위한 강력한 검사 도구입니다. 특히, 예 진 식14를 에스트로겐 응답 요소와 상호 작용 하는 핵 스 트로 겐 수용 체를 바인딩하는 ligands를 감지 합니다. 그러나, 예는 또한 중요 한 제한이 있습니다. 예에 스 막 에스트로겐 수용 체 등 비 핵 메커니즘 또는 활성 제 단백질 1 (AP-1) 녹음 방송 요인에와 같은 추가 요소를 포함 하는 메커니즘을 통해 작동 하는 검색 하지 않습니다. 또한, 효 모 하지 않아도 동일한 대사 용량 포유류 세포로, 때문에 예 estrogenic 되도록 신진 대사 활성화를 필요로 하는 ligands를 검색할 수 없습니다.
또한, 예 분석 결과 구별할 수 없습니다 쉽게 복잡 한 샘플에서 estrogenic 및 안티 estrogenic ligands. 대신, net estrogenicity estrogenic 안티 estrogenic ligands의 합계 효과 측정 합니다. ER 길 항 근의 농도 정량 또는 혼합물의 금지 활동을 평가, 분석 결과 표준 길 항 제 (17β-estradiol)와 다양 한 테스트 샘플 농도12효 모 배양 하 여 수정할 수 있습니다. 이 프로세스 샘플에 길 항 근 주 작동 근 유도 기자 활동을 점감 할 수 있다 하는 경우를 결정 하 고 샘플에서 응급실 길 항 근의 존재를 식별 하는 데 유용한 화면을 제공 합니다.
일부 샘플 추출 및 샘플 준비 단계를 수정 해야 할 수도 있습니다 있지만 여기에 제시 된 프로토콜 샘플 형식의 다양 한을 수용할 수 있습니다. 예를 들어 EEQs 중 널리 다양 한 몇 가지 개인 케어 제품의 복제. 더 가변 샘플 기름 작은 물방울을 포함 하는 경향이 나 그렇지 않으면 하지 완전히 균질, 나타내는 diethyl 에테르 같은 더 질 성 용 매 도움이 될 것 이다. 또는 오일과 왁 스 퍼스널 케어 제품에 샘플 100% 에탄올 대신 50% 에탄올으로 추출 하 여 제외 될 수 있습니다.50% 에탄올 추출 더 많은 수용 estrogenic ligands (예를 들어, 일부 안료) 캡처할 것입니다. 그러나, 50% 에탄올 100% 에탄올 보다 더 느리게 증발 하 고 따라서 추출 시간을 확장할 수 있습니다. 또한, (비누) 등 일부 샘플 했다 감소 셀 밀도 측정 (OD610)에서 발생 하는 효 모 세포 독성. 여우 외. (2008) 같은 샘플 희석 하 고 셀 밀도 차이 차량 제어 웰 스12에 비해 30%를 초과 하는 경우 다시 테스트 해야 좋습니다.
예 시험 분석 연구 목적으로 사용 하는 경우 샘플 풀의 희석 곡선 선제 추출 단계 4.5에서에서 누 룩을 추가할 수의 적절 한 볼륨을 결정 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 또는, 추출 물 시험 될 수 있다 동시에 여러 볼륨 (예:5 µ L, 20 µ L 추출 단계 4.5에서에서 효 모에 추가) 또는 주문 크기 (예를 들어, 0.2 µ L, 2 µ L, 및 20 µ L)에 걸쳐 있는 희석. "적절 한" 볼륨 추출의 표준 곡선의 선형 부분을 따라 LacZ 값을 일치 하 여 estrogenicity를 식별 하는 있습니다. 최적화는 효 모 세포 독성, false 네거티브, 또는 표준 곡선을 초과 하는 estrogenicity 등을 너무 많이 또는 너무 작은 샘플을 추가 하 여 발생 하는 문제를 방지할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, ligand의 다른 양의 효 모는 접시에 걸쳐 일관 된 볼륨 및 농도의 에탄올 또는 다른 차량에 노출 되도록 사용 하는 경우 샘플 및 E2 표준의 볼륨을 조정 합니다.
False 네거티브를 위한 잠재력에도 불구 하 고 예 분석 결과 확인 되었습니다 계층 3 테스트 도구로 내 분 비 분리기에 대 한 Schug 그 외 여러분 에 의해 (2013), 누가 내 분 비 장애 (TiPED)21에 대 한 포괄적인 계층 프로토콜을 개발. 학부 교육에 대 한 분석 결과 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 관련 된 개념을 교육에 대 한 유용 합니다. 분석 결과 사용 하 여 학생 또한 직렬 표준; diluting 등 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 연습 추출 샘플; 만드는 솔루션; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 배양 세포; 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여.

효 모 에스트로겐 화면 (예)는 estradiol (e 2 또는 17β-estradiol) 행렬, 물, 식물 조직, 소비자 제품 및 식품1,2,3,를 포함 하 여 다양 한 모방 ligands를 계량에 널리 사용 됩니다. 4. 샨 다, 이러한 ligands "환경 에스트로겐 (EEs)." 라고 예는 낮은 비용, 대안 생체 외에서 vivo에서 테스트 같은 설치류 uterotrophic5,6 분석 결과 및 분석 결과7먹이 무지개 송어로 원래 개발 되었다. 이 테스트의 목표는 제품 포함 자극 또는 에스트로겐-종속 메커니즘을 차단 하는 화학 물질 결정 하는. EEs의 탐지는 중요 한, 그들은 신호, 태아의 개발 중 특히 정상적인 내 인 성 에스트로겐을 방해할 수 있습니다 때문입니다. 이 방해는 비만, 불 임, 암, 그리고 인지 손실8의 위험을 증가 시켜 건강을 타협.
EEs 및 다른 EDCs 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 부족은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있는 동안 참여 원칙을 설명 하는 활동의 부족 때문에 부분적으로 이다. 또한, 예 프로토콜의 여러 변형이 존재9,10,11,,1213, 그리고이 다양성은 분석 결과 최적화에 대 한 시간이 실험실 코디네이터는 명확 하 게 관련 기술에서 훈련. 마지막으로, 네 분석 실험은 일반적으로 이상의 1 긴 하루 또는 완료 O/N 외피와 함께 2 일 연속. 이 타이밍은 일반적으로 한 번만 나 학부 실험실 과정의 형식으로 호환 되지 않습니다 / 몇 시간 주.
이러한 요구에 대응,이 원고는 개인 배려 제품 (Pcp)3 , 매주 실험실 회의 수용 하기 위해 6 일 냉장 단계에 대 한 ethanolic 추출 방법을 포함 하는 최적화 된 96 잘 예 프로토콜을 보고 합니다. 절대 에탄올은 다양 한 극 지와 비 극성 용액을 해산 할 수 있는 다양 한 유기 용 매 이다. 또한, 그것은 학부 과정에 적합 하기 때문에 그것은 쉽게 사용할 수, 상대적으로 비 독성, 저렴 한, 혼합할 수 있는 물; 그것은 또한 특별 한 장비 없이 쉽게 증발. 그러나, 에탄올 강하게 소수 성 내 분 비 분리기 또는 많은 오일과 왁 스를 추출 하기 위한 이상적인, Pcp. 가난한 추출 효율에 일반적인 재료 되 고 후자의 두 틀린 부정적인 결과의 모험을 증가 한다. 마음에이 제약 조사 그 주소 샘플 특성 추출 절차 (예를 들어, ethanolic 추출 또는 고체 상 추출)를 선택 하 고 연구 목적 (연구 학부 교육 대)을 충족 해야 합니다.
예는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 원래 Tulane 대학에서 박사 찰스 밀러에 의해 만들어진에 의존 합니다. 밀러 그 외 여러분 보십시오 (2010 년) 엔지니어링된 플라스 미드14의 완전 한 지도 위해. 익스프레스 인간의 핵 ERα 또는 ERβ (또한 부르는 ESR1 그리고 ESR2, 각각) 효 모 constitutively이 플라스 미드와 변형 (ERα)에 대 한 갈 락 토스 또는 포도 당 또는 갈 락 토스 (ERβ)에 대 한 포함 된 미디어에 성장 될 때. Estrogenic 화학 미디어에 있다면, 그들은 β-galactosidase (lacZ) 식 estrogenic 화학 물질의 농도에 비례 하는 수준을 활성화 하는 리간드-수용 체 복합물을 만드는 수용 체에 바인딩합니다. 효 모 세포는 다음 출시 축적 된 β-galactosidase lysed. 세포의 용 해 버퍼는 ONPG 또는 CPRG, β-galactosidase 노란색 또는 빨간색 제품을 각각 산출 하 여 죽 습 포함 되어 있습니다. 색도계 제품 microwell 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 색상 변경의 정도 누 룩 노출 되었다 estrogenic ligands의 농도에 비례.
테스트 중인 샘플에서 발생 하는 배경 흡 광도 대 한 잠재력에 따라 기판 (CPRG 또는 ONPG) 선택 합니다. 예를 들어 식물 추출 됩니다 추가 하기도 노란색 색조 미디어 경우 인위적으로 estrogenicity 측정을 웃 기는 ONPG (405에서 계량 nm) β-galactosidase는 기판으로 사용 됩니다. 와 식물 추출 물, CPRG (574에 계량 nm) 더 적절 한 색도계 기판 있을 수 있습니다. CPRG는 ONPG 보다 더 비싼 하지만 10 분의 1 몰에 사용 됩니다. 이 문서는 주치의의 estrogenicities ONPG와 CPRG를 사용 하 여 정량 추출 물을 선물 한다.
ERα 및 ERβ를 사용 하 여 환경 샘플의 estrogenicity를 측정 이러한 수용 체 중 하나만 사용 하 여 보다 더 포괄적인 접근 이다. 동물,이 수용 체 차동 조직 배포, 규제 활동, 및 바인딩 선호도 estrogenic 안티 estrogenic ligands15전시. 예를 들어 식물 기반 에스트로겐 일반적으로 바인딩할 ERβ 더 강력 하 게2, 합성 화학 물질 중 ERα 또는 ERβ에 대 한 선호를 표시할 수 있습니다 또는 두 수용 체 똑같이 잘15를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 한 에스트로겐 수용 체에 바인딩은 반드시 다른 바인딩을 예언 하지 않습니다.
EEs는 식물 뿐만 아니라 많은 소비자 제품 (예, 농약, 세제, 접착제, 윤활제, 플라스틱, 식품 및 의약품)에서 발견, 제시 데이터 Pcp. 선택을 사용 하 여 가져온 Pcp는 경쟁력, 쉽게 사용할 수 있는, 예산 친화적인, 그리고 학부생을 위한 환경 관련. 학생 가정 실험실에서 테스트에서 그들의 좋아하는 Pcp를가지고 초대 될 수 있습니다. 그들은 또한 높은 Pcp의 가설 기반 비교를 생성 하 여 독성 점수 낮은 환경 실무 그룹16 에 의해 개발 된 피부 깊은 데이터베이스를 검색할 수 있습니다. 이 방법에서는, 학생 들은 동시에 고급 실험실 능력; 개발할 수 있습니다. 자율, 기반 학습;에 관여 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐구 하 고.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer (단일 또는 다중 튜브용)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-215-365</td><td>모든 믹서로 충분합니다.</td></tr><tr><td>버킷 원심분리기</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>75-063-839</td><td>4000rpm에서 원추형 튜브를 원심분리할 수 있는 경우 모든 버킷 원심분리기로 충분합니다.</td></tr><tr><td>분젠 버너</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>17-012-823</td><td>모든 분젠 버너로 충분하거나 알코올 버너(Fisher Scientific 04-245-1)를 대신 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>50125590H</td><td>30°C를 유지할 수 있는 경우 모든 인큐베이터로 충분합니다.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>EPOCH2</td><td>405, 574 및 610 nm의 파장에서 흡광도를 측정할 수 있는 경우 다른 브랜드의 플레이트 리더로 충분합니다.</td></tr><tr><td>Gen5 마이크로플레이트 리더 및 이미저 소프트웨어</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>GEN5</td><td>필요한 소프트웨어는 플레이트 리더의 제조업체 및 모델에 따라 다릅니다. GEN5 소프트웨어는 BioTek 플레이트 리더와 함께 사용하도록 고안되었습니다.</td></tr><tr><td>냉장고</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05LREEFSA</td><td>4°C를 유지할 수 있는 경우 모든 냉장고로 충분합니다.</td></tr><tr><td>1 - 10 mL 혈청학 피펫과 호환되는 피펫터 또는 PipetAid</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-681-15E</td><td>1 및 10 mL 혈청학 피펫과 호환되는 경우 모든 피펫터로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P10 마이크로피펫터</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144562G</td><td>5 마이크로를 분주할 수 있는 경우 모든 마이크로피펫터로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P200 마이크로파이펫터</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144565G</td><td>최대 200μm까지 분주할 수 있는 경우 모든 마이크로파이펫으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P300 멀티채널 피펫</td>터 <td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FBE1200300</td><td>50 - 205 &m.l.l를 분주할 수 있는 경우 모든 멀티채널 피펫터로 충분합니다.</td></tr><tr><td>리피터</td><td>피펫 Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164001G</td><td>100 - 320 &마이크로를 전달할 수 있어야 합니다. l; 이 피펫터는 멀티채널 피펫터를 대신 사용할 수 있기 때문에 선택 사항입니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 mL conical tubes with caps</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05-539-801</td><td></td></tr><tr><td>유리 섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 96-well, 뚜껑이 있는 평평한 바닥 마이크로플레이트(비멸균)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 96웰, 뚜껑 없는 평평한 바닥 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td><td>EW-01728-81</td><td></td></tr><tr><td>100mL 유리 비커</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-539H</td><td>고압멸균이 가능한 경우 모든 유리 비커로 충분합니다.</td></tr><tr><td>250 mL 유리 삼각 플라스크</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB500250</td><td>모든 유리 삼각 플라스크는 오토클레이브가 가능한 경우 충분합니다.</td></tr><tr><td>멸균, 접착성, 다공성 필름&nbsp;</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>금속 집게</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12-000-157</td><td>모든 금속 집게로 충분합니다.</td></tr><tr><td>시약 저장 탱크</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>07-200-127</td><td></td></tr><tr><td>여과 장치 (0.2 &micro; m)</td><td>피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com)</td><td>09-761-52</td><td></td></tr><tr><td>분출 병 (에탄올 용)</td><td>피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com)</td><td>02-897-10</td><td>모든 실험실 분출 병으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>오토클레이브 저장 병</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>06-414-1D</td><td>모든 오토클레이브 유리 저장 병으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>10 mL 유리 혈청학적 피펫 (멸균)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27F</td><td>모든 유리 혈청학적 피펫으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>1 mL 유리 혈청학 피펫 (멸균)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27C</td><td>모든 유리 혈청학 피펫으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P10 마이크로피펫터 팁</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-3810</td><td>위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P200 마이크로피펫터 팁</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-8810</td><td>위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>P300 마이크로피펫 팁</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-9810</td><td>위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>반복 피펫터를 위한 주사기 팁</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164150G</td><td>연발 피펫터를 사용하는 경우에만 필요합니다.</td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB0875712</td><td>모든 멸균 페트리 접시로 충분합니다.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Yeast&nbsp; </td> TRP1 유전자 산물(<예: <>em>, W303a)American Type Culture Company(ATCC) (www.ATCC.org)MYA-151 재조합 효모가 없는 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 균주(예: /em, W303a)</td><td>American Type Culture Company(ATCC) ()</td><td>MYA-151</td><td>재조합 효모도 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ER&알파에 대한 수용체/리포터 플라스미드;</td><td>애드진 (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERalpha-5Z (플라스미드 #23061)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta에 대한 수용체/리포터 플라스미드;</td><td>애드진 (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERbeta-5Z (플라스미드 #23062)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco 한천</td><td>BD (www.bd.com)</td><td>214530</td> 디티오트레이톨 시그마 (www.sigmaaldrich.com)D0632 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>주의:&nbsp; Dithiothreitol은 급성 피부와 눈 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 흄 후드, 방진 마스크)를 사용하여 피부와 눈의 접촉, 흡입 및 섭취를 피하십시오.</td></tr><tr><td>오르토 니트로 페닐 -&베타 ; -D- 갈락 토피라 노사이드</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>클로로 페놀 레드 -&베타 ; -D- 갈락 토피라 노사이드</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 염기</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>갈락토스</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 황산</td><td>염 시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>우라실</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>류신</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>히스티딘</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-Estradiol& 주의;</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MP 바이오메디컬&nbsp;</td><td>E8875-250 마그네슘&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0219456401 - 1 mg</td><td>주의:&nbsp; 에스트라디올은 발암 물질 및 생식 독성이 의심되는 물질입니다. 흡입, 삼키거나 피부를 통해 흡수되면 해롭습니다.&nbsp; 에스트라디올은 모유를 먹는 어린이와 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다.&nbsp; 에스트라디올은 수생 생물에 매우 유독합니다. 적절한 개인 보호구(장갑, 흄 후드, 방진 마스크)를 사용하고 임신 및 수유 중에는 노출을 피하십시오.&nbsp; 에스트라디올은 유해 폐기물로 처리해야 하며 환경에 방출되어서는 안 됩니다.</td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>시그마(www.sigmaaldrich.com)</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성(무수)</td><td>시그마(www.sigmaaldrich.com)</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마(www.sigmaaldrich.com)</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>칼륨시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>사르 코실 (N- 라우로 일 사르코신 나트륨 염)</td> <td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>L5125</td><td></td></tr><tr><td>탄산 나트륨</td><td>시그마 (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>S7795</td><td></td></tr><tr><td> Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments </td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 스프레드시트 소프트웨어</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Excel은 데이터 출력을 관리하고 R 분석을 위한 .csv 파일을 생성하는 데 편리한 스프레드시트 소프트웨어입니다.</td></tr><tr><td>Java 소프트웨어(부록 1 응용 프로그램에 필요)&nbsp;</td><td>Oracle Corporation</td><td></td><td>부록 1의 응용 프로그램을 사용하여 LacZ 값을 계산하려면 먼저 무료 Java 소프트웨어(https://www.java.com/en/download/)를 다운로드한 다음 부록 1에서 LacZ 응용 프로그램을 엽니다. 응용 프로그램에서 만든 LacZ 결과는 PC 키보드에서 "control (ctrl) + c"를 누르거나 Mac 키보드에서 "command + c"를 눌러 복사 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>JMP 통계 소프트웨어 버전 13.0.0</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>부록 2에는 JMP를 사용하여 LacZ 데이터를 4개 매개변수 로지스틱 회귀 곡선에 맞추는 지침이 포함되어 있습니다. 곡선은 에스트라디올 표준 곡선을 기준으로 테스트 샘플 에스트라디올 등가물(EEQ)을 보간하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>R 통계 컴퓨팅 및 그래픽 소프트웨어</td><td>R Foundation</td><td></td><td>Free R 소프트웨어는 https://www.r-project.org/.&nbsp 에서 다운로드 할 수 있습니다. R을 사용하여 LacZ 데이터를 4개 매개 변수 로지스틱 회귀 곡선에 맞추기 위한 지침과 코드는 부록 2에 나와 있습니다.</td></tr></tbody></table>

학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 estrogenic ligands를 검출

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

효 모 에스트로겐 화면 (예) 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하 고 내 분 비 장애의 연구에 광범위 하 게 적용 되었습니다. Estrogenic ligands는 자연적이 고 인공 "환경 에스트로겐" (EEs) 퍼스널 케어 제품 (Pcp), 플라스틱, 농약, 및 식품을 포함 한 많은 소비자 제품에서 발견 포함 되어 있습니다. EEs는 인간과 다른 동물에서 신호, 잠재적으로 비 옥을 감소 하 고 질병 위험 증가 호르몬을 방해. EEs 및 기타 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 결점은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있으면서도 참여 원칙을 설명 하는 관련 실험실 활동의 부족 때문에 부분적으로. 이 문서를 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ) 퍼스널 케어 제품에 ligands를 측정에 대 한 예는 최적화 된 제공 합니다. 메서드가 두 색도계 기판 중 통합 (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 또는 chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside (CPRG))는 β-galactosidase에 의해 죽 습, 6 일 냉장된 인큐베이션 단계 LacZ 계산과 관련된 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석에 대 한 R 코드에 대 한 학부 실험실 과정, 자동화 된 응용 프로그램에서 사용을 촉진 한다. 프로토콜 개발 하 고 있는 그들은 제품의 에스트로겐 모방에 대 한 그들의 선택의 화면 실험 학부생 수 있도록 설계 되었습니다. 이 과정에서 그들은 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 대해 알아보십시오. 동시에, 그들은 또한 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 기술을 연습와 같은: 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 직렬 diluting 표준; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여. 따라서,이 분석 결과 구현 기반 학습 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐험 하는 동안에 종사 하는 학생 들을 장려 한다.

이 문서는 퍼스널 케어 제품 (Pcp) 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ)를 결속 하는 ligands를 측정에 대 한 최적화 된 효 모 에스트로겐 화면을 표시 합니다. 메서드는 두 색도계 기판 옵션, 학부 과정에서 사용 하기 위해 6 일 냉장된 인큐베이션 및 데이터 분석을 위한 통계 도구를 통합합니다.

학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

본 실험 과정의 전체적인 목표는 효모 에스트로겐 스크리닝을 사용하여 퍼스널 케어 제품에서 추출한 인간 에스트로겐 수용체 작용제의 양을 측정하는 것입니다. 이 방법은 물, 식품 및 퍼스널 케어 제품 내의 환경 에스트로겐을 검출하고 정량화할 수 있으므로 독성학, 내분비계 교란 및 생태 생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 인 비트로(in vitro) 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 널리 사용되며, 기술적인 실험실 숙련도를 교육하기 위한 훌륭한 플랫폼을 제공한다는 점입니다.환경 에스트로겐의 검출은 특히 태아 발달기나 사춘기와 같은 생리적 전환기에 호르몬 신호 전달을 변화시킬 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이 방법에서 가장 어려운 부분은 계산과 데이터 분석이며, 저희는 사용하기 쉬운 애플리케이션을 개발하여 이를 간소화했습니다. 또한, 정확한 피펫팅이 필수적입니다.본 프로토콜은 시약 제조부터 시작합니다. 분석 첫째 날에 사용할 glucose 및 galactose 배지, 50% ethanol 용매 대조군, estradiol 표준물을 준비하고, 둘째 날에 사용할 LacZ 완충액, dithiothreitol 및 sodium carbonate를 준비하십시오. glucose 및 galactose 배지는 0.2 µm 필터로 여과하여 멸균합니다.하나의 96-well 플레이트에서 최대 23가지의 서로 다른 퍼스널 케어 제품(PCP) 및 추출 대조군을 3반복으로 테스트할 수 있습니다. PCP에는 비누, 헤어 크림, 샴푸, 자외선 차단제, 메이크업 제품, 면도 크림 및 로션이 포함됩니다. 촬영을 위해 8가지의 PCP로만 시료를 준비합니다.각 샘플 1g을 15mL 원추형 튜브에 넣고 무수 에탄올 10mL와 혼합합니다. 또한, 15mL 원추형 튜브에 무수 에탄올 11mL를 넣어 음성 추출 대조군을 준비합니다. 각 원추형 튜브의 내용물을 수동 흔들기와 볼텍싱을 병행하여 30분 동안 균질화합니다.원심분리기용 버킷을 사용하여 원뿔형 튜브를 최대 허용 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 각 튜브의 상층액을 40-micrometer 세포 스트레이너를 통해 50-milliliter 원뿔형 튜브에 디캔트합니다. 그런 다음 각 50-milliliter 튜브의 내용물을 유리 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.환기 후드 내에서 바이알의 뚜껑을 열어둔 채로 일주일 동안 두어 에탄올을 완전히 증발시킵니다. 빛에 민감한 성분의 분해를 방지하기 위해 건조 중인 시료를 빛으로부터 차단하십시오. 시료가 건조되면 각 시료를 1 mL의 50% ethanol로 재구성한 다음, 볼텍싱하여 균질화합니다.효모 에스트로겐 스크리닝(yeast estrogen screen) 또는 YES 플레이트를 준비하기 약 이틀 전(약 42시간 전), 멸균 기술을 사용하여 각각의 활성 효모 배양액 0.1 milliliters를 멸균된 삼각 플라스크에 담긴 필터 멸균된 포도당 배지 10 milliliters에 첨가하여 효모를 계대 배양합니다. 30 degrees Celsius에서 배양하고, 기존 배양액은 스톡으로 계속 배양합니다. 이틀 후, YES 어세이 1일 차에 멸균 기술을 사용하여 부유 효모 배양액과 필터 멸균된 갈락토스 배지를 멸균된 비커에 희석합니다.각 효모 샘플 120 µL와 갈락토오스 배지 공시료를 각각 3반복으로 투명 폴리스티렌 플레이트에 피펫팅하여 흡광도를 확인합니다. 플레이트 분광광도계를 사용하여 희석된 효모 배양액이 610 nm 파장에서 0.065 ± 0.005의 순 흡광도를 갖는지 검증합니다. 갈락토오스 배지 공시료의 OD610 값을 빼서 효모의 순 OD610을 결정합니다.멸균 주사기 팁이 장착된 리피팅 피펫을 사용하여, 이 플레이트 레이아웃에 따라 희석된 효모 현탁액을 멸균 폴리프로필렌 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 분주합니다. 피펫팅 하는 동안 비커를 계속해서 돌리거나 피펫으로 혼합하여 효모가 가라앉지 않고 현탁 상태를 유지하도록 합니다. 마지막으로, 플레이트 레이아웃에 녹색으로 표시된 H10에서 H12 웰에 필터 멸균된 갈락토스 배지 120 µL를 추가하여, 배지 자체에 의한 흡광도를 보정하기 위한 배지 대조군으로 사용합니다.테스트할 효모 균주와 비색 기질의 각 조합별로 별도의 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 플레이트 배치도에 따라 연속 희석을 수행하여 각 플레이트에 표준 곡선을 작성합니다. 멸균 팁이 장착된 단일 채널 피펫을 사용하여 웰 A1, A2, A3에 estradiol 표준물질 5 µL를 추가합니다. 다채널 피펫으로 웰의 내용물을 피펫팅하여 혼합한 다음, 웰 A1~A3에서 웰 B1~B3로 205 µL를 옮깁니다. G행까지 205 µL 전이 과정을 반복합니다. 연속 희석이 완료되면 웰 G1~G3에서 205 µL를 제거합니다. 이 단계가 끝나면 모든 표준 웰에는 120 µL가 포함되어 있어야 합니다.이 플레이트 배치도에서 파란색으로 표시된 효모 현탁액이 포함된 각 vehicle control 웰인 H1, H2, H3에 50% ethanol 5 µL를 추가합니다. 다음 단계는 플레이트 배치도에서 보라색으로 표시된 효모 현탁액 포함 웰에 샘플 또는 음성 추출 대조군(negative extraction controls)을 5 µL씩 세 번 반복하여 추가하는 것입니다. 어떤 샘플이나 추출 대조군이 어느 웰에 배치되었는지 기록하십시오.어느 웰에 샘플이 있고 어느 웰에 없는지 추적하려면, 새 팁 박스를 준비하여 박스 내 팁의 위치를 플레이트 내 해당 웰의 위치와 동일하게 사용하여 팁을 선택하십시오. 샘플, 추출 대조군 및 용매 대조군 웰의 내용물을 피펫팅하여 혼합합니다. 각 웰에서 205 µL를 제거하여 해당 웰의 부피를 120 µL로 조정하십시오.각 플레이트를 멸균된 접착성 다공성 필름으로 밀봉하고 라벨을 부착한 뒤, 30 °C에서 17시간 동안 배양합니다. 17시간의 배양이 끝나면 플레이트를 배양기에서 꺼냅니다. 플레이트를 즉시 처리할 수 없는 경우, 랩으로 감싸 4 °C에서 6일 동안 냉장 보관합니다.플레이트를 처리할 준비가 되면 포장을 풉니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 행의 웰 내용물을 혼합한 다음, 각 웰에서 50 µL의 효모 현탁액을 투명 폴리스티렌 96-웰 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 새 플레이트에 라벨을 부착합니다.웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 웰마다 새로운 피펫 팁을 사용하되, 팁이 반드시 멸균 상태일 필요는 없습니다. 흄 후드 내에서, 해동하여 상온 상태인 LacZ 버퍼 20 milliliters에 1 molar DTT 20 microliters를 첨가하여 DTT의 최종 농도가 1 millimolar가 되도록 합니다. LacZ 버퍼를 잘 혼합합니다.리피팅 피펫을 사용하여 DTT와 ONPG 또는 CPRG가 포함된 LacZ 버퍼 200 µL를 폴리스티렌 플레이트의 모든 웰에 분주하고, 플레이트 리더를 사용하여 즉시 모든 웰의 610 nm에서의 흡광도를 측정하고 기록합니다. 추가 플레이트가 있는 경우 필요한 만큼 반복합니다. 플레이트를 덮개로 덮고 지정된 시간 동안 30 °C에서 배양합니다.배양이 완료되면 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 리피팅 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 µL의 탄산나트륨을 첨가하여 베타-갈락토시다아제 반응을 중단시킵니다. 플레이트 분광광도계를 사용하여 모든 웰의 흡광도를 ONPG의 경우 405 nm에서, CPRG의 경우 574 nm에서 측정하고 기록합니다.Java가 설치되어 있어야 하는 자동화 애플리케이션을 사용하여 LacZ 값을 계산할 수 있습니다. 먼저, 부록 1에 설명된 LacZ 자동화 애플리케이션을 엽니다. 그림 1에 표시된 것과 동일한 플레이트 레이아웃을 사용하여, 모든 웰의 ONPG에 대한 405 nanometers 또는 CPRG에 대한 574 nanometers 광학 밀도 측정값을 붙여넣으십시오.분석 시 발색이 나타나기까지의 배양 시간과 시간을 입력한 후 Next를 클릭하십시오. 모든 웰의 610 nanometers에서의 흡광도 측정값을 붙여넣으십시오. Submit을 클릭하여 LacZ 결과를 표시하십시오.LacZ 결과는 키보드 명령어를 사용하여 복사한 뒤, 필요에 따라 스프레드시트나 다른 파일에 붙여넣을 수 있습니다. 온라인 YES 분석 데이터 분석 애플리케이션을 열어 분석을 시작하십시오. 첫 번째 탭에 설명된 형식으로 작성된 CSV 데이터 파일을 업로드하십시오.두 번째 탭에서 estradiol 표준 곡선을 디지털화하고 회귀 매개변수를 추정하십시오. 세 번째 탭에서 회귀 모델 출력 결과를 확인한 다음, 네 번째 탭에서 샘플의 LacZ 값에 해당하는 보간된 x축 값을 찾으십시오. 다섯 번째 탭을 클릭하여 샘플의 에스트로겐 당량 또는 EEQ 값을 확인하십시오.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 EEQ 값을 원래 샘플 질량에 맞게 표준화하십시오. 효모를 17 beta-estradiol과 함께 17시간 동안 배양한 후의 표준 곡선 예시가 제시되어 있습니다. 원고에서 논의된 이유로 인해, 일반적으로 CPRG가 ONPG보다 더 나은 기질 선택지입니다.이전 관찰 결과와 일치하게, ER Beta를 발현하는 효모를 이용한 분석법은 ER Alpha를 발현하는 효모를 이용한 분석법보다 민감도가 한 자릿수 이상 더 높았습니다. 따라서 ER Beta 발현 효모에서 에스트로겐 활성이 더 빈번하게 검출되었습니다. 본 연구의 추가적인 목적은 학부 실험 과정 일정에 적합한 배양 시간을 테스트하는 것이었습니다.17시간 배양 후 6일간의 냉장 보관 기간을 도입했을 때, 냉장 보관한 플레이트의 표준 곡선은 냉장 보관하지 않은 플레이트의 곡선과 유사했습니다. 4-매개변수 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 추정한 매개변수의 표준 오차는 냉장 보관한 플레이트가 냉장 보관하지 않은 플레이트보다 모두 작았습니다. 따라서 플레이트를 6일 동안 냉장 보관하면 오차가 줄어들고 EEQ 추정치의 정확도가 향상됩니다.이 기술을 숙달하면 3~4시간 분량의 세션을 두 번 진행하여 완료할 수 있습니다. 실험 절차를 수행할 때, 17시간의 배양 기간 이전에 수행되는 모든 단계에서 무균 조작법을 적용하고, 정확하고 세심하게 피펫팅하며, 그림 1에 제시된 플레이트 배치를 따르는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 에스트로겐 작용의 추가적인 메커니즘과 개체 전체에 미치는 영향을 조사하기 위해 생체 내(in-vivo) 동물 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 이후, 효모 에스트로겐 스크리닝은 식품, 식물 조직 및 개인용 세정 제품과 같은 환경 시료 내의 에스트로겐성 리간드를 측정하는 저비용 측정법으로 인정받았습니다. 이 영상을 시청하고 나면 개인용 세정 제품의 간단한 추출 방법, 효모 배양, 표준 희석 곡선 작성, 96-웰 플레이트를 이용한 YES 분석 수행 및 관련 계산 완료 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 estradiol을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑 및 기타 개인 보호 장구를 착용하고 적절한 폐기 방법을 준수하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 식물 유래 화합물의 에스트로겐 활성을 결정하기 위한 세포 기반 리포터 분석에 대해 설명합니다. 에스트로겐과 같은 활성을 가진 화합물은 에스트로겐 수용체에 대한 결합을 모방하고 다운스트림 리포터 효소 유전자 전사를 유도합니다. 리포터 효소는 반응에서 생물 발광을 생성하여 화합물의 에스트로겐 활성을 나타냅니다.

에스트로겐 수용체-리포터 활성 분석법은 식물성 에스트로겐 에스트로겐 활성을 스크리닝합니다.

내분비 교란 화합물 (EDC)는 수생 환경에 상당한 위험을 초래할. 시 폐수 처리 공장은 지표수의 에스트로겐 효능에 큰 기여입니다. 이 문서에서 제공하는 방법은 EDC 제거에 대한 효능 및 폐수 처리 공정의 적합성의 평가를 할 수 있습니다.

폐수 처리 프로세스의 효능의 평가를위한 화학 및 생체 독성 방법의 배터리를 사용하면 에스트로겐 효능을 제거하는 방법

처리된 폐수 유출수 및 지표수(수신)수를 포함한 물 샘플의 유기 추출물에서 내분비 활성을 스크리닝하기 위한 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 분할 정지("동결 및 해동") 체외 형질 전환 생물 검정을 사용하여 조정되었습니다.

물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판<em&gt; 체외</em&gt; 전이 활성화 생물학적 정량

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

우리는 에스트로겐 활성에 대한 인간 및 비 인간 영장류 식품을 선별하기위한 기자 분석 β 시판 가능한 에스트로겐 수용체를 최적화했습니다. 우리는 알려진 에스트로겐 성 인간 음식 콩 높은 등록 을 보여 줌으로써이 분석 확인, 다른 식품은 활동을 표시 하지 않는 동안.

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

이 프로토콜은 미세모세관을 통해 수집된 인간 눈물액에서 17β-에스트라디올과 테스토스테론을 검출하고 정량하는 최적화된 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 방법을 설명합니다. 이 방법은 눈물 호르몬 수치를 최소 침습적으로 측정할 수 있게 합니다.

효소 결합 면역흡착 분석법을 이용한 인간 눈물막에서의 성호르몬 검출

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

이 문서의 목적은 디지털 immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 pial 동맥 조각에 에스 트로겐 수용체 - α의 immunofluorescent 감지 (ERα)를 최적화하는 방법을 설명하는 것입니다.

디지털 Immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 Pial Arterioles에서 에스 트로겐 수용체 - α의 영상

이 프로토콜은 zebrafish 축산을위한 최적의 조건을 유지하기 위해 정기적 인 유지 보수 및 관리를 간략하게 설명합니다. 비디오 시스템 유지 보수, 일반 주택, 먹이, 사육하고, zebrafish 애벌레의 양육에 대한 프로토콜을 보여줍니다.

Zebrafish의 일반 관리 및 유지 관리 (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) 실험실 : 소개

배우세요 효모 에스트로겐 스크린을 사용하여 퍼스널 케어 제품에서 환경 에스트로겐을 정량하는 방법을. 이 저렴한 기술은 내분비 교란 물질 연구와 학부 실험실 교육에 탁월한 플랫폼을 제공합니다.

학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출

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