뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 조직에서 세포 외 공간의 부피, 분율 및 비틀림을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 세포 외 공간과 생리학 및 질병 사이의 관계에 관한 주요 질문에 답합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 외 공간의 두 가지 중요한 매개변수를 실시간으로 특성화할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이온 동동 미세전극이 실험 중에 특성을 변경하는 경향을 보이고 실험 중에 문제 해결이 자주 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 성공적인 기록을 얻기 위해 여러 단계에 걸쳐 이온 선택성 미세 전극인 이온 선택 미세 전극의 정밀한 조작이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 테트라메틸암모늄(TMA)이 포함된 ACSF를 침수 챔버를 통해 분당 2밀리리터로 실행합니다.

온도 조절기를 원하는 온도로 설정하고 실험 기간 동안 ACSF에 95%의 산소, 5%의 이산화탄소를 거품을 일으킵니다. 다음으로, 접지 전극을 홀더에 장착하고 침수 챔버를 통과하는 ACSF에 팁을 담그십시오. 그런 다음 다공성 컵에 이전에 준비한 TMA가 함유된 0.3% 아가로스를 채우고 침수실에 넣습니다.

이제 iontophoresis microelectrode를 하나의 micromanipulator의 피펫 홀더에 고정합니다. iontophoresis microelectrode wire를 iontophoresis 장치의 헤드 스테이지에 연결합니다. 다음으로, 보정된 ISM을 두 번째 마이크로 매니퓰레이터에 고정하고 ISM을 헤드 스테이지에 연결합니다.

그런 다음 Wanda 및 Walter 프로그램이 포함된 컴퓨터를 켭니다. Wanda GUI에서 Calibrate(보정)를 클릭합니다. 그런 다음 Calibration(교정) 상자에 ISM 교정 중에 측정된 전압을 입력하고 Fit Data(데이터 맞춤)를 클릭합니다.

그런 다음 Calibrate 상자에서 Accept를 클릭하여 생성된 기울기와 간섭을 기본 GUI로 자동으로 전송합니다. GUI의 왼쪽에서 모든 실험 매개변수가 해당 항목에 설정되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 한천 컵에 온도 프로브를 놓습니다.

GUI의 Measuring Electrode(측정 전극) 상자의 Temperature 항목에 측정된 온도를 기록합니다. 그런 다음 미세 전극을 아가로스 속으로 최소 1, 000마이크로미터 깊이로 낮추고 컵의 중앙에 놓습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 시각화합니다.

2채널 증폭기에서 ISM 채널 커넥터를 전압 감산 출력으로 수동으로 이동하여 기준 채널과 ISM 채널 사이의 감산을 설정합니다. 세 방향 축 모두에서 팁을 서로 중앙에 맞춥니다. 다음으로, 미세 조작기 제어 상자에서 두 미세 전극의 상대 위치를 영점으로 설정하고 미세 전극이 정확하고 정밀하게 중앙에 있는지 확인합니다.

그런 다음 ISM을 한 축에서 iontophoresis 미세 전극에서 120μm 떨어진 곳으로 이동합니다. 그런 다음 GUI에서 Acquire를 클릭하여 녹음을 시작하고 프로그램이 전체 녹음을 위해 실행되도록 합니다. 이 절차에서는 컴퓨터에서 Walter 프로그램을 엽니다.

Zero Records From 메뉴에서 Wanda Voltoro 버튼을 클릭하여 Wanda에서 생성된 레코드를 읽습니다. 다음 팝업 창에서 읽을 레코드를 하나 이상 선택하고 열기를 클릭합니다. One Write Excel 메뉴에서 Sheet 1.3을 클릭하고 레코드가 자동으로 그래프로 표시될 때까지 프롬프트를 따릅니다.

피팅 절차를 시작하려면 두 가지 옵션(Two Options) 메뉴에서 선택 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 그림 2 팝업 창에서 마우스를 사용하여 처리할 첫 번째 레코드 위로 십자선을 이동하고 마우스 버튼 중 하나를 눌러 레코드를 선택합니다. 그런 다음 메뉴에서 맞춤 곡선을 클릭하고 최소 20회 반복을 사용하여 데이터의 정확한 맞춤을 얻습니다.

다음으로, 모든 데이터 포인트에 맞게 모두를 선택하고 계속을 선택합니다. 프로그램이 표시된 곡선에 맞습니다. 그런 다음 7개의 결과 메뉴에서 Excel을 클릭하여 적절한 스프레드시트 프로그램에 결과를 쓰는 옵션을 선택합니다.

Excel 파일의 이름을 지정합니다. iontophoresis microelectrode의 기능을 결정하는 데 사용될 생성된 데이터를 기록하고 기록합니다. iontophoresis 미세전극이 실험에 적합한 것으로 간주되는 경우 Wanda GUI의 TransportNum 끝 필드에 모든 시도의 평균 수송 횟수를 기록합니다.

이 절차에서는 400마이크로미터 두께의 뇌 절편을 기록실에 놓고 흐르는 ACSF에 완전히 잠기도록 합니다. 다음으로, 이온토영동 미세전극과 ISM을 모두 뇌 절편의 관심 영역 위로 이동합니다. 두 전극을 흐르는 ACSF에 담그되 슬라이스 위에 담그십시오.

그런 다음 레퍼런스 및 이온 감지 채널 모두의 전압을 0밀리볼트로 오프셋합니다. 두 채널의 전압이 안정화될 때까지 기다립니다. 차트 레코더에서 ISM의 이온 감지 채널에서 측정된 전압을 표시합니다.

다음으로, ISM과 iontophoresis 미세전극을 슬라이스에 200마이크로미터 깊이, 서로 120마이크로미터 떨어진 곳에 놓습니다. 흐르는 ACSF와 뇌에서 측정된 TMA 신호 간의 전압 차이를 계산하고 이 값을 Wanda GUI의 측정 전극 상자의 Baseline Volt Millivolt 필드에 입력합니다. GUI의 왼쪽에서 모든 실험 매개변수가 올바르게 입력되었는지 확인합니다.

Acquire(획득)를 클릭하여 녹음을 시작하고 전체 녹음을 허용합니다. 슬라이스에서 두 미세 전극을 모두 이동한 후 차트 레코더를 사용하여 vol 사이의 변화를 확인합니다.tage 지금 측정한 값과 이전에 측정한 값입니다. 뇌의 기록을 분석하려면 Walter 프로그램을 사용하여 아가로스 데이터 분석 절차를 반복합니다.

Walter 메뉴에서 Excel을 클릭하여 스프레드시트 프로그램에 데이터를 씁니다. 그런 다음 뇌 ECS의 부피 분율, 뇌 ECS의 비틀림 및 비특이적 청소율을 기록합니다. 운송 번호를 확인하려면 agarose에서 새 녹음을 수행하고 Walter 프로그램의 절차를 반복하여 운송 번호를 얻습니다.

스프레드시트를 검사하고 뇌 측정 전에 얻은 운송 번호에서 10% 이상 변경된 운송 번호가 있는지 확인합니다. 그렇다면 이온 동동 미세 전극으로 얻은 데이터는 신뢰할 수 없습니다. 이 단계에서 측정된 수송 횟수는 뇌 측정 전에 얻은 수치와 거의 일치해야 하며, 그렇지 않으면 부피 분율이 정확한 것으로 간주될 수 없습니다.

새로 얻은 ISM 교정 데이터를 Wanda Calibrate 상자의 입력으로 사용하고 기울기 값이 이전 교정과 10% 미만 차이가 나는지 확인합니다. 다음은 한천에서 얻은 단일 시험의 대표적인 데이터로, TMA의 농도 곡선을 입증합니다. 이것은 Walter의 데이터 처리에서 얻은 적합 곡선입니다.

피팅 곡선에서 데이터가 중복된다는 것은 Walter가 수행한 곡선 피팅이 이 시험에서 확산을 정확하게 모델링했음을 보여줍니다. 다음은 뇌에서 실험하기 전의 한천 측정 표입니다. 다음은 대조군 및 실험 조건 하에서 쥐의 뇌 절편에서 수행된 측정치를 요약한 것입니다.

알파는 저삼투압 챌린지 동안 감소한 반면 비틀림은 예상대로 증가했습니다. Alpha가 복구 조건에서 컨트롤 값을 초과했습니다. 그리고 다음은 뇌에서 실험한 후의 아그라 측정 표입니다.

실험 전후의 평균 수송 횟수는 서로 10% 이내였으며, 이는 뇌에 기록된 값이 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 마스터하면 이틀에 걸쳐 14시간 만에 수행할 수 있습니다. 첫째 날에는 ISM이 제작되고 보정됩니다.

2일차에는 ISM을 재보정하고 실시간 이온영동을 수행합니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 전극의 간격을 정확하게 하는 것이 중요합니다. 둘째, 이온 영동 미세전극의 수송 수가 실험 과정 전반에 걸쳐 안정적으로 유지되는 경우에만 실험을 수락하는 것이 중요합니다.

세포 외 공간에서 작은 양이온의 확산을 특징짓는 이 절차를 따라 세포 외 공간에서 큰 미세분자가 어떻게 움직이는지에 대한 질문에 답할 수 있는 통합 광학 이미징 방법과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 건강 및 질병에서 살아있는 뇌의 뇌 세포 외 공간 부피 및 비틀림을 정량화하기 위해 실시간 이온 영동 방법을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.