생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 중간엽 줄기 세포의 심근성 유도를 유도하고 관찰하는 것입니다. 이 방법은 기능적 심근세포를 생성하기 위해 환경 신호에 의해 어떤 치료법이 유도될 수 있는지와 같은 중간엽 줄기세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약리제나 유전 물질 대신 응집체 형성과 심장 태아 층을 적용한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 중간엽 줄기 세포의 심근 생성 잠재력에 대해 자세히 설명하기 때문에 심혈관 질환 치료로 확장됩니다. 저와 함께 이 절차를 시연할 사람은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Miss Farwah Iqbal과 우리 연구실의 연수생인 Max Librach와 Nadav Gasner입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 새끼 쥐 부위를 분리한 후 심실을 반으로 자르고 10ml의 PBS와 얼음 위에 핀 스트라이프가 있는 10cm 접시에 옮겨 혈액을 씻어냅니다.

그런 다음 구부러진 가위를 사용하여 심실 벽을 직경 2-3mm의 작은 조각으로 자릅니다. 혈청학 피펫을 사용하여 10-12 마리의 동물의 심장 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 안정시킵니다. 하트 조각을 제거하지 않고 가능한 한 많은 PBS P/S를 제거하십시오.

그런 다음 10mm의 새 PBS P/S를 추가합니다. 심근세포를 분리하려면 심장 조각이 가라앉은 후 PBS에 0.15%트립신을 사용하여 PBS P/S를 대체하고 섭씨 37도의 조직을 10분 동안 흔들면서 배양합니다. 상등액을 버리십시오.

그런 다음 100% FBS 10밀리리터를 포함하는 50ml 수집 튜브에 디캔터 상등액을 넣는 것을 제외하고 트립신 분해를 세 번 더 반복합니다. 다음으로 세포관을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 10%FBS 및 1%P/S와 함께 DMEM-F12를 사용하여 세포를 재현탁하고 6웰 플레이트에 시드합니다.

세포가 부착되면 배지를 2ml의 새 배지로 교체합니다. 사전 염색된 MSC를 준비하려면 10cm 접시에서 70%에서 80%의 포화도에 도달한 MSC 배양액에서 배지를 제거하고 3ml의 세포 해리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분 동안 접시를 배양합니다.

해리된 세포를 15ml 튜브로 옮기고 400 x G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상등액을 흡인하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.

10%FBS 및 1%P/S를 함유한 DMEM-F12에서 1 x 10의 농도로 셀을 1 x 10의 농도로 희석하여 밀리리터당 6번째 MSC를 생성합니다. 그런 다음 1.5ml 원심분리 튜브의 세포에 실행 가능하고 비전달성 형광 염료를 첨가하고 MSC를 30분 동안 배양합니다. 튜브를 400 x G에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 흡인하고 펠릿을 1 x 10에서 밀리리터당 6번째 MSC의 농도로 다시 현탁합니다.

그런 다음 MSC를 10 x 10의 농도로 심근세포로 6웰 플레이트의 웰당 네 번째 세포로 전달합니다. 응집체 공동 배양을 위해 10% FBS 및 1%P/S가 보충된 알파 MEM에서 MSC의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 10cm 조직 배양 접시의 뚜껑 내부 표면에 25마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨려 응집체 형성을 시작합니다.

PBS P/S가 들어 있는 아래쪽 뚜껑을 놓습니다.접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 실체 현미경으로 3일 후 방울의 응집체 형성을 관찰합니다.

방울의 80% 이상이 응집체를 형성한 경우, 1ml 마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 방울을 채취하고 응집체를 1차 쥐 심근세포 단층으로 직접 옮깁니다. 골재 공동 배양을 최대 2주 동안 배양합니다. 72시간마다 매체의 전체 볼륨을 변경합니다.

매일 명시야 현미경을 사용하여 태아 세포층에 부착되는 응집체를 관찰합니다. 관찰 시 수축 집계를 기록합니다. 활성 응집체는 동기화된 방식으로 수축하며, 우리는 물리적 활동이 없는 태아층 전체에 걸쳐 그들 사이의 전도도를 제안합니다.

배지를 흡입하고 6개의 웰 접시의 웰당 2밀리리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 웰당 2밀리리터의 해리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3분 동안 접시를 배양합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 세 가지 다른 유형의 HMSC는 직접 공동 배양에서 유사한 풍부함과 출현을 보였습니다. 응집체 공동 배양에서 매달린 방울을 심장 세포에 옮긴 후 2-3일 후, FTM과 텀 헉 PBC가 BMSC에서 볼 수 있는 것보다 더 큰 응집체에서 나타났습니다. 이 실험에서 미분화 MSC에서 CD49F 발현에 대한 유세포 분석은 89%의 헉 PBC와 53%의 BMSC라고 하는 FTM 헉 PBC의 96%가 세포 표면 CD49F에 대해 양성임을 보여주었습니다.

TRA에 대한 유세포 분석은 85개 세포를 획득했으며, FTM huck PBC 및 term huck PBCs에서 심근세포 관련 마커인 SIRPA의 상향 조절을 보여주었지만 직접 심근세포 공동 배양에서 얻은 BMSC에서는 그렇지 않았습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, cx43 상향 조절은 직접 공동 배양에서 용어 헉 PBC 또는 BMSC에 비해 FTM 헉 PBC에서 유의하게 높았습니다. 형광 현미경 분석은 FTM과 텀 헉 PBC를 구별하는 것이 둘 다 cx43을 상향 조절하는 것으로 나타났습니다.

텀 헉 PBC가 FTM보다 더 높은 부분을 차지합니다. 그러나 형광 현미경 검사는 FTM huck PBC의 세포막에서 cx43 양성 반점이 관찰되었으며 말 세포에서 주로 세포질임을 밝혔습니다. 마지막으로, 여기에서 볼 수 있듯이 공동 배양 후 분류된 인간 세포에 대해 고배율 형광 현미경 검사를 수행하고 원형질막에서 cx43의 높은 함량을 확인했습니다.

이 절차의 주요 단계를 숙달하면 제대로 수행하기만 하면 각각 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 무균 예방 조치를 유지하는 것이 중요합니다. 적절하게 취급하지 않을 경우 오염을 유발할 수 있는 1차 동물 조직.

이 절차에 따라, 수축 골재의 추가 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 구조의 수명과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술을 통해 MSC 분야의 연구자들은 추가 배아 조직과 같은 중간엽 줄기 세포의 젊은 공급원의 분화 가능성을 탐구할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 심근성 분화를 위한 적절한 유도를 제공하는 방식으로 MSC 응집체를 준비하고 이를 직접 1차 조직 태아층과 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

BRDU로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 세포 독성 폐기물의 적절한 취급과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.