생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화
August 9th, 2017
여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.
이 실험 절차의 전반적인 목표는 중간엽 줄기 세포의 심근성 유도를 유도하고 관찰하는 것입니다. 이 방법은 기능적 심근세포를 생성하기 위해 환경 신호에 의해 어떤 치료법이 유도될 수 있는지와 같은 중간엽 줄기세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약리제나 유전 물질 대신 응집체 형성과 심장 태아 층을 적용한다는 것입니다.
이 기술의 의미는 중간엽 줄기 세포의 심근 생성 잠재력에 대해 자세히 설명하기 때문에 심혈관 질환 치료로 확장됩니다. 저와 함께 이 절차를 시연할 사람은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Miss Farwah Iqbal과 우리 연구실의 연수생인 Max Librach와 Nadav Gasner입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 새끼 쥐 부위를 분리한 후 심실을 반으로 자르고 10ml의 PBS와 얼음 위에 핀 스트라이프가 있는 10cm 접시에 옮겨 혈액을 씻어냅니다.
그런 다음 구부러진 가위를 사용하여 심실 벽을 직경 2-3mm의 작은 조각으로 자릅니다. 혈청학 피펫을 사용하여 10-12 마리의 동물의 심장 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 안정시킵니다. 하트 조각을 제거하지 않고 가능한 한 많은 PBS P/S를 제거하십시오.
그런 다음 10mm의 새 PBS P/S를 추가합니다. 심근세포를 분리하려면 심장 조각이 가라앉은 후 PBS에 0.15%트립신을 사용하여 PBS P/S를 대체하고 섭씨 37도의 조직을 10분 동안 흔들면서 배양합니다. 상등액을 버리십시오.
그런 다음 100% FBS 10밀리리터를 포함하는 50ml 수집 튜브에 디캔터 상등액을 넣는 것을 제외하고 트립신 분해를 세 번 더 반복합니다. 다음으로 세포관을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 10%FBS 및 1%P/S와 함께 DMEM-F12를 사용하여 세포를 재현탁하고 6웰 플레이트에 시드합니다.
세포가 부착되면 배지를 2ml의 새 배지로 교체합니다. 사전 염색된 MSC를 준비하려면 10cm 접시에서 70%에서 80%의 포화도에 도달한 MSC 배양액에서 배지를 제거하고 3ml의 세포 해리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분 동안 접시를 배양합니다.
해리된 세포를 15ml 튜브로 옮기고 400 x G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상등액을 흡인하고 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
10%FBS 및 1%P/S를 함유한 DMEM-F12에서 1 x 10의 농도로 셀을 1 x 10의 농도로 희석하여 밀리리터당 6번째 MSC를 생성합니다. 그런 다음 1.5ml 원심분리 튜브의 세포에 실행 가능하고 비전달성 형광 염료를 첨가하고 MSC를 30분 동안 배양합니다. 튜브를 400 x G에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 흡인하고 펠릿을 1 x 10에서 밀리리터당 6번째 MSC의 농도로 다시 현탁합니다.
그런 다음 MSC를 10 x 10의 농도로 심근세포로 6웰 플레이트의 웰당 네 번째 세포로 전달합니다. 응집체 공동 배양을 위해 10% FBS 및 1%P/S가 보충된 알파 MEM에서 MSC의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 10cm 조직 배양 접시의 뚜껑 내부 표면에 25마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨려 응집체 형성을 시작합니다.
PBS P/S가 들어 있는 아래쪽 뚜껑을 놓습니다.접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 실체 현미경으로 3일 후 방울의 응집체 형성을 관찰합니다.
방울의 80% 이상이 응집체를 형성한 경우, 1ml 마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 방울을 채취하고 응집체를 1차 쥐 심근세포 단층으로 직접 옮깁니다. 골재 공동 배양을 최대 2주 동안 배양합니다. 72시간마다 매체의 전체 볼륨을 변경합니다.
매일 명시야 현미경을 사용하여 태아 세포층에 부착되는 응집체를 관찰합니다. 관찰 시 수축 집계를 기록합니다. 활성 응집체는 동기화된 방식으로 수축하며, 우리는 물리적 활동이 없는 태아층 전체에 걸쳐 그들 사이의 전도도를 제안합니다.
배지를 흡입하고 6개의 웰 접시의 웰당 2밀리리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 웰당 2밀리리터의 해리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3분 동안 접시를 배양합니다.
여기에서 볼 수 있듯이, 세 가지 다른 유형의 HMSC는 직접 공동 배양에서 유사한 풍부함과 출현을 보였습니다. 응집체 공동 배양에서 매달린 방울을 심장 세포에 옮긴 후 2-3일 후, FTM과 텀 헉 PBC가 BMSC에서 볼 수 있는 것보다 더 큰 응집체에서 나타났습니다. 이 실험에서 미분화 MSC에서 CD49F 발현에 대한 유세포 분석은 89%의 헉 PBC와 53%의 BMSC라고 하는 FTM 헉 PBC의 96%가 세포 표면 CD49F에 대해 양성임을 보여주었습니다.
TRA에 대한 유세포 분석은 85개 세포를 획득했으며, FTM huck PBC 및 term huck PBCs에서 심근세포 관련 마커인 SIRPA의 상향 조절을 보여주었지만 직접 심근세포 공동 배양에서 얻은 BMSC에서는 그렇지 않았습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, cx43 상향 조절은 직접 공동 배양에서 용어 헉 PBC 또는 BMSC에 비해 FTM 헉 PBC에서 유의하게 높았습니다. 형광 현미경 분석은 FTM과 텀 헉 PBC를 구별하는 것이 둘 다 cx43을 상향 조절하는 것으로 나타났습니다.
텀 헉 PBC가 FTM보다 더 높은 부분을 차지합니다. 그러나 형광 현미경 검사는 FTM huck PBC의 세포막에서 cx43 양성 반점이 관찰되었으며 말 세포에서 주로 세포질임을 밝혔습니다. 마지막으로, 여기에서 볼 수 있듯이 공동 배양 후 분류된 인간 세포에 대해 고배율 형광 현미경 검사를 수행하고 원형질막에서 cx43의 높은 함량을 확인했습니다.
이 절차의 주요 단계를 숙달하면 제대로 수행하기만 하면 각각 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 무균 예방 조치를 유지하는 것이 중요합니다. 적절하게 취급하지 않을 경우 오염을 유발할 수 있는 1차 동물 조직.
이 절차에 따라, 수축 골재의 추가 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 구조의 수명과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술을 통해 MSC 분야의 연구자들은 추가 배아 조직과 같은 중간엽 줄기 세포의 젊은 공급원의 분화 가능성을 탐구할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 심근성 분화를 위한 적절한 유도를 제공하는 방식으로 MSC 응집체를 준비하고 이를 직접 1차 조직 태아층과 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
BRDU로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 세포 독성 폐기물의 적절한 취급과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 기사는 체외에서 기능적 심근 세포와 유사한 세포를 생성하는 데 중점을 두고, 중간엽 줄기 세포에서 심근 유도 분화를 유도하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 약물 물질이나 유전자 조작보다는 환경 신호의 사용을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 심근 유도 분화
- 중간엽 줄기 세포
- 심혈관 질환 치료
배경
- 중간엽 줄기 세포는 심장 수복 가능성이 있습니다.
- 환경 신호를 이해하면 심근 세포 생성을 향상시킬 수 있습니다.
- 현재 방법은 종종 약물 또는 유전자 접근법에 의존합니다.
- 이 연구는 집합체 형성을 사용한 새로운 기술을 탐구합니다.
연구 목적
- 중간엽 줄기 세포에서 심근 유도 분화를 유도합니다.
- 환경 신호가 줄기 세포 분화에 미치는 영향을 조사합니다.
- 심혈관 질환 치료법에 대한 가능한 치료법에 대한 통찰력을 제공합니다.
사용된 방법
- 쥐 새끼 심장 조직의 분리.
- 실험을 위한 심실 조직 준비.
- 분화를 유도하기 위한 환경 신호의 적용.
- 심근 세포와 유사한 세포 형성 관찰.
주요 결과
- 중간엽 줄기 세포로부터 심근 세포와 유사한 세포의 성공적인 유도.
- 분화에서 환경 신호의 역할 시연.
- 심혈관 질환 치료법에 대한 잠재적 영향.
- 실습 시연을 위한 실험실 연수생과의 협력.
결론
- 이 방법은 전통적인 분화 기술에 대한 실행 가능한 대안을 제공합니다.
- 연구 결과는 줄기 세포 생물학의 이해에 기여합니다.
- 향후 연구는 심장 질환에 대한 치료 응용을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Cardiomyogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs) addresses a critical bottleneck in regenerative cardiac research by enabling the generation of functional cardiomyocyte-like cells in vitro. This aggregate-based, feeder layer-driven protocol provides a physiologically relevant alternative to pharmacological or genetic induction, supporting predictive confidence in early-stage target validation. The approach enhances translational continuity for cell therapy pipelines targeting myocardial repair and heart failure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of MSC cardiomyogenic potential using physiologically relevant environmental cues.
- Supports functional target validation by quantifying expression of cardiomyocyte markers and contractile behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by comparing differentiation efficiency across MSC sources.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of cell source immunogenicity and regenerative potential.
Screening & Assay Development
- Establishes validated co-culture systems for reproducible assessment of MSC differentiation.
- Delivers quantitative outputs via flow cytometry and fluorescence microscopy for marker expression.
- Enables screening of MSC sources for aggregate formation and contractile cluster generation.
- Supports assay standardization for downstream compound or genetic modulator evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with disease-relevant cardiac phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling functional assessment of MSC-derived cardiomyocytes.
- Reduces translational risk by demonstrating immunoprivileged properties of early-stage MSC sources.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates for cardiac repair.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregate-based differentiation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early functional screening and mechanistic de-risking of MSC sources for cardiac applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on MSC differentiation capacity and immunogenicity.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing MSC sources and differentiation efficiency.
- Analytics: Utilizes flow cytometry and microscopy to deliver marker-based and functional outputs for decision-making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by demonstrating contractile function and immunological properties.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various MSC sources and cardiac research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in MSC-based cardiac repair strategies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of differentiation assays across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy candidates and optimizes resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of MSC sources and differentiation protocols for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, aggregate formation, and co-culture techniques.
- Demands access to flow cytometry, fluorescence microscopy, and primary cardiac tissue preparation infrastructure.
- Necessitates rigorous aseptic technique and cross-team standardization to minimize contamination risk.
- Adaptation may be needed for different MSC sources or cardiac feeder layers.
- Handling of cytotoxic reagents (e.g., BRDU) and animal tissues requires strict safety protocols.
