Name: 쥐의 Sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유 과정에서 수용자 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과: 방법론 설명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 쥐의 아킬레스건 절단 후 PRP 주입을 통한 건 치유 평가 방법을. 표준화된 수술 및 생역학 분석으로 재현 가능한 결과를 얻어 인간 치료에 적용 가능한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 스탕다르 드 리에주에 의해 지원 되었다 고 Lejeune-Lechien 레온 Frédéricq 자금 부여 합니다.

배려 및 처리는 동물의 배려를 위한 가이드에 따라 수행 된 실험 동물의 사용 국립 과학 아카데미의에 의해 준비 하 고 출판에 의해 국립 연구소의 건강 (미국). 유럽 및 국가 입법 신중 하 게 따라 했다.
1. 동물 준비
<ol><li>132 2 개월 된 남성 Sprague-Dawley 쥐 320-450 g (120 쥐 실험에 대 한) 및 12 쥐 혈액 샘플링, 그림 1에 대 한 무게를 사용 합니다. Dell13을 바탕으로, 각 그룹에 대 한 15 쥐 0.8 (80% 지정된 효과 있으면 통계적 의미를 찾는 기회)의 힘에 대 한 충분 했다.</li>
	<li>변화 역을 갖춘 기존 시설에 격리 상태에서 고아 한 장에 모든 쥐를 집. 특히 구매 되는 SPF (특정 병원 체 무료) 쥐와 IVC (개별적으로 통풍이 케이지) 랙, 번 식 선동.</li>
	<li>사용 다음 주택 조건: 19-24 ° C에서 온도 범위 상대 습도: 40-60%; 환기: 공기 갱신의 주파수: h; 당 10-15 명암 주기: 12h-12 h.</li>
	<li>모든 배우면 장비를 소독 하 고 비친된 침구를 사용 합니다. 체계적으로 감 금 소 안쪽 살 균 종이 쟁반, 수건을 배치 하 여 케이지 농축을 구현 합니다.</li>
	<li>제한 된 조건 하에서 영역에 대 한 액세스 허용: 입구에 새 실험실 외 투, 마스크, 장갑, 신발, 및 머리 모자.</li>
	<li>기존 시설에 대 한 Felasa14 권장 사항에 따라 연간 기준 더러운 침구에 지 내게 하는 센 티 넬 동물에 식민지 상태 모니터링 실시 합니다. 유지 적절 한 조사와 감 금 소 당 4 ~ 5 동물 다이어트 제공 물 광고 libitum산성화. 매일 모니터링 합니다.</li>
	<li>쥐 외 과적 수술 방에 수술 전에 2 h 최고의 새 장을 필터링에 대 한 선출을 전송 합니다.</li>
</ol>2. 수술
<ol><li>수술 기구 준비:가 위, 클램프, 2 개의 hemostatic 클램프 및 바늘 홀더. 모든 절차 동안 장갑, 마스크, 후드, 그리고 실험실 코트를 착용.</li>
	<li>무작위로 두 그룹 (PRP와 염 분 해결책)으로 쥐를 나눕니다.</li>
	<li>그것의 감 금 소에서 쥐를가지고 고 그것의 무게. 쥐를 식별 하기 위해 번호가 매겨진된 귀 태그를 사용 합니다. 눈의 건조를 방지 하려면 각 막에 물방울을 배치 합니다.</li>
	<li>Intraperitoneally xylazine (체중의 10mg/kg)과 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg)와 쥐 anesthetize Anesthetization 확인, 심장-호흡 모니터링 및 어떤 눈 반사에 대 한 확인에서 동물을 배치 합니다.</li>
	<li>Buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사 (0.01-0.05 mg/kg 매 8-12 h) 진통제로 목 부분에.</li>
	<li>전기 면도기로 왼쪽된 뒷 다리를 면도 하 고 3 iso-betadine/알코올 (희석된 1:10) 솔루션의 스크럽을 번갈아 소독 해 현미경 따뜻한 패드 (20 ° C)에 쥐를 놓습니다. 우량한 위치에서 작동 될 다리와 옆 decubitus에 쥐를 놓습니다. 발 수술 집게로 잡으십시오.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 왼쪽된 아 킬 레 스 힘 줄을 둘러싼 피부에 작은 측면 절 개 (20-25 m m)를 확인 하 고 아 킬 레 스 힘 줄 복잡 한 (그림 2a)를 노출 하도록 좋은 위를 사용 하 여 근 막 해 부.</li>
	<li>가 위 (그림 2b)와 plantaris 힘 줄을 제거 합니다.</li>
	<li>아 킬 레 스 힘 줄 종횡 5mm의 발뒤꿈치 뼈 삽입 인접 고가 위를 사용 하 여 5-m m의 긴 부분을 제거. (그림 2c, 2d) 힘 줄을 봉합 하지 마십시오.</li>
	<li>Overjet 봉합 (연속 봉합) 하 고 resorbable 원사로 근 막과 피부를 봉합. Monofilament 봉합 수술 절 개에 피부에서 wicking 방지 하기 위해 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>깨어 때까지 열 램프에서 쥐를 놓고 케이지 (58 x 38 cm) 다시 쥐를 배치 (Nota 베네: 없음 immobilization 부과).</li>
</ol>3. PRP 준비15
<ol><li>Xylazine (10 mg/kg의 몸 무게)와 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg) 기증자 쥐 복 주입에 의해 anesthetize. PRP 주사 2 h postoperatively 어떤 다시 마 취 없이 수행 됩니다.</li>
	<li>진통제로 buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사.</li>
	<li>전체 혈액 수집 (쥐, 당 20 mL 최종 출혈) 심장 찔린 무 균 튜브에 의해 나트륨 시트르산 버퍼링 포함 된 3.2% (0.109 M, 응고 제). 다음 intracardiac 주입 하 여 쥐를 안락사.</li>
	<li>PRP를, 150 x g 및 실 온에서 10 분 동안 혈액을 원심. 두 가지 단계를 산출 하는이 초기 저속 원심 분리 단계: 적혈구 (Rbc) 전체 볼륨의 약 80-90%를 차지 하는 구성 된 낮은 위상 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) (일반적으로 10-20%는 혈액의 구성 된 위 단계 샘플)입니다.</li>
	<li>부드럽게 PRP (상위 단계) 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 보조 플라스틱 튜브에 수집 합니다. PRP와 적혈구 사이의 인터페이스는 매우 느슨한, 할 하지 플라스틱 너무 가까이 인터페이스. 103 셀 x 0.05 미만 이어야 제대로 처리, PRP에 Rbc 오염 / µ L. 버리고 나머지 낮은 단계와 기본 혈액 컬렉션 튜브.</li>
	<li>혈액학 분석기에 혈소판 수를 측정 및 수집된 PRP의 볼륨을 결정 합니다. 이러한 값은 다음 단계에서 혈소판 농도 조정 계산에 대 한 필요. 혈액 세포 수 Rbc와 잠재적인 오염 평가에 유용 하 고이 단계에서 PRP에 Wbc 혈소판 농도 일반적으로 1-1.5 x106/µL.</li>
	<li>1000 x g 및 실 온에서 10 분에 대 한 PRP의 두 번째 원심 분리를 수행 합니다. 이 고속 원심 분리 단계 생성 느슨한 혈소판 펠 릿과 상쾌한 헌 혈소판 가난한 플라스마 (PPP) 구성 된 합니다. 3.6, 단계에서 결정 하는 값을 사용 하 여 계산 하는 PRP를 집중 하 고 2.5의 최종 농도 도달 삭제 됩니다 상쾌한의 볼륨 x106/µL.</li>
	<li>부드럽게 단계 3.7에서에서 계산한 최종 볼륨의 약 2/3를 떠나 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 보조 플라스틱 튜브에 상쾌한 (PPP)를 수집 합니다. 펠 릿은 느슨한, PPP 삭제, 따라서 잠재적으로 최종 원하는 농도 감소 하면 혈소판의 상당한 수량을 손실 됩니다.</li>
	<li>신중 하 게 부드러운 반복 pipetting으로 나머지 상쾌한와 혈소판 펠 릿 resuspend. 이 집중된 PRP의 혈소판 수를 측정 합니다. 필요한 경우 최종 대상 농도 도달 헌 PPP의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 참고: 준비의 3 h 이내 PRP를 사용 합니다.</li>
	<li>CaCl2 의 50 µ L 추가 (11 mEq 10 mL) PRP는 혈소판 활성화의 mL 당.</li>
	<li>준비 후 봉합 작업 사이트 약 1 시간에 직접 21g 바늘으로 50 µ L 신선한 PRP 또는 생리 식 염 수 주사. 이 시간 동안 실 온에서 PRP를 유지.</li>
	<li>및 모니터링 하는 쥐의 기능 복구 밀접 하 게 일 동안 수술 후 아 킬 레 스 힘 줄의 제거 하기 전에.</li>
</ol>4. 아 킬 레 스 힘 줄과 Biomechanical 테스트16 의 제거
<ol><li>5, 15, 또는 30 일 이후의5, 쥐의 무게. 그런 다음, 복 주입에 의해 xylazine (10 mg/kg의 몸 무게)와 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg) anesthetize.</li>
	<li>진통제로 buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사. 가능한 오래 위한 생리 조건을 유지 하는 동물을 희생 하기 전에 힘 줄을 제거 합니다.</li>
	<li>왼쪽된 뒷 다리를 면도 하 고 해 현미경으로 쥐를 놓습니다. 우량한 위치에서 작동 될 다리와 옆 decubitus에 쥐를 놓습니다. 손가락으로 발을 잡으십시오.</li>
	<li>이전 작업 사이트에 작은 절 개 (10mm)를 확인 하 고 삼 두 근 suralis 노출 될 때까지 확장.</li>
	<li>치유 아 킬 레 스 힘 줄을 제거 하려면 잘라 발뒤꿈치 뼈 뼈 5-10 mm 종횡 원심 킬 첨부 파일. 다음 아 킬 레 스 힘 줄 (그림 3b)에 붙어 있는 삼 두 근 suralis의 일부를 해 부. 근육 부분 cryo-턱 (그림 3 c-d)에 맞게 충분히 큰 있다. 곳을 알아내는-턱에 샘플을 즉시 배치 집게 (그림 3e)를 사용 하 여.</li>
	<li>제거한 후에 근육 힘 줄 뼈 단지, Nembutal (200 mg/kg)로 intracardiac 주입 하 여 쥐를 안락사. 심장 리듬과 15 분 동안 호흡의 부재를 평가 하 여 죽음을 확인 합니다.</li>
	<li>(그림 3e) 위 턱에 근육 단위를 배치, 그것을 닫고 보편적인 시험기에 수직으로 배치 (106.2 kN, 그림 3a). 다음 (그림 3 층)의 더 낮은 클램프 사이의 뼈를 수정 합니다.</li>
	<li>모두 위 턱 분 지 근육, 힘 줄 보다 엄격한 크기 순서 이며 인장 시험 동안 변형 하지 않습니다 있도록 동결에 액체 질소를 추가 합니다.</li>
	<li>냉동 영역에 금속 클램프 테두리를 도달 하는 때, 그래서 힘 줄 구조 유지 됩니다 인장 시험을 시작 합니다. 파열까지 1 m m/s의 일정 한 속도로 컴퓨터의 변위 속도 설정 합니다. 뉴턴 (N)에 컴퓨터에 주어진 궁극 장력 강도 (UTS)를 기록 합니다.</li>
	<li>단면적을 계산 하려면 두 개의 카메라, 서로 게 수직 타원형 모양 형성 놓고 사진을 찍을.</li>
	<li>치유 힘 줄의 단면적에 차이 담당 하는 조직에 의해 발생 하는 기계적 스트레스를 나타내는 단위 지역 (제곱 밀리미터 당 N), UTS 정상화.</li>
</ol>5. 조직학 분석
참고: 각 그룹의 15 힘 줄 조직학 분석을 받았다.
<ol><li>그것의 제거 후, 잠수함의 구조를 유지 하기 위해 4 %paraformaldehyde 즉시 아 킬 레 스 힘 줄 (조직의 1 mm은 시간, 그래서 고정 고정 시간은 힘의 크기에 따라 다릅니다).</li>
	<li>paraformaldehyde 70% 에탄올으로 대체 하 고이 솔루션에서 최소한 1 박 샘플을 둡니다.</li>
	<li>구멍으로 작은 플라스틱 용기에 힘 줄을 놓고 1 시간을 위한 신선한 70% 에탄올 솔루션에서 해당 컨테이너를 배치 합니다.</li>
	<li>장소 1 헤에 대 한 95% 에탄올에 컨테이너를 반복 합니다.</li>
	<li>장소 1 헤에 대 한 100% 에탄올에 컨테이너를 반복 합니다.</li>
	<li>장소 1 헤에 대 한 100% 크 실 렌에서 컨테이너를 반복 합니다.</li>
	<li>지금 힘 줄을 포함 하는 플라스틱 컨테이너, 액체 파라핀 (56 ° C)에 놓고 그것을 떠나 하룻밤.</li>
	<li>포함 역 (녹은 왁 스, 핫 플레이트, 그리고 감기 플레이트 장착)를 사용 하 여 조직 샘플에 가장 적합 한 금속 형을 선택 하 고 그렇게 기지 덮여 있다 약간 액체 파라핀 그것을 채워. 참고:는 톰에서 수직 섹션을 샘플을 찾으시는.</li>
	<li>샘플 위치에 올바르게 때 액체 파라핀을 가진 형을와 냉장 기계에 그것을 배치. 그것은 적어도 15 분 동안 진정 하자.</li>
	<li>파라핀 블록에서 제거 하 고 적어도 30 분 동안 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>여러 깨끗 한 유리 슬라이드를 준비 하 고 그들에 이온된 물이 몇 방울을 넣어.</li>
	<li>톰에서 5 µ m (힘 줄의 중간 부분에서만 사용 섹션)의 섹션에 블록을 잘라 하 고 슬라이드에 섹션을 놓습니다.</li>
	<li>파라핀 그냥 유리에 조직 본드 녹기 시작 몇 분, 65 ° C에서가 열 오븐에서 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>파라핀 섹션에 슬라이스 홀더를 포함 하는 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>지금 deparaffinize 하 고 다음 연속 욕조에 그것을 배치 하 여 조직 rehydrate: 크 실 렌 (욕실 1) 8 분 크 실 렌 (욕조 2) 4 분 100% 에탄올에 2 분 95% 에탄올에 2 분 70% 에탄올에 2 분 이온된 수에 2 분</li>
	<li>되며 오신 얼룩, 다음 솔루션에는 조직 장소.<ol>
<li>젖어 되며 솔루션 (1 g 되며 토스, 0.2 g KIO3, 50 g AIK (이렇게4)2.12H2O; 200 mL 글 리세 린; 증류수 1 l 조정)에서 8 분 조직.</li>
		<li>젖어 수돗물을 실행 하는 아래의 8 분에 대 한 조직.</li>
		<li>30에 대 한 조직 담가 오신 솔루션 (undiluted 아세트산의 200 µ L을 포함 하는 증류수 100 mL에 0.25% 오신) s.</li>
		<li>젖어 수돗물을 실행 하는 아래 2 분에 대 한 조직.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Masson의 Trichrome 얼룩에 대 한 다음이 단계를 따르십시오.<ol>
<li>재, 후 철 졸업생 (0.5 g (NH4) Fe (이렇게4)2.12H2O 10 mL H2O)와 컨테이너에 섹션을 배치 하 고 컨테이너를 닫습니다. 280 W 전자 레인지에 3 분 위해 그것을 열.</li>
		<li>잠시 진정 하 고 이온을 제거 된 물으로 그것을 씻어 보자.</li>
		<li>Regaud의 되며 솔루션 닫힌된 컨테이너에 섹션을 배치 (0.5 g 되며 50 mL H2O에서 50 ° C에에서 용 해 후 추가 5 mL 95% 에탄올 및 글 리세 린 5 mL), 90 대 열에서 W. 280 s</li>
		<li>이온된 수로 그것을 씻어.</li>
		<li>섹션 3 분 (에서 메탄올에 채도) picric 산 솔루션, 수돗물을 실행 하는 아래 5 분 동안 씻어 놓고 몇 초 동안 이온된 수에 배치.</li>
		<li>지금 5 s와 린스 산 fuchsin (0.5 g 50 mL H2O undiluted 아세트산의 0.25 mL를 포함)에 섹션을 배치 염료 사라질 때까지 수돗물을 실행.</li>
		<li>Phosphomolybdic 산 성 솔루션 (0.5 g 50 mL H2O) 5 분에 대 한 섹션을 품 어, 이온된 수에 몇 초 동안 그것을 배치.</li>
		<li>또 다른 5 분에 대 한 밝은 녹색 (0.5 g 50 mL H2O undiluted 아세트산의 0.25 mL를 포함) 솔루션 섹션을 놓고 염료 사라질 때까지 수돗물을 실행 하는 아래에 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이제는 조직 다시 탈수.<ol>
<li>1 분에 70% 에탄올에 대 한 섹션을 젖어.</li>
		<li>95% 에탄올에 1 분에 대 한 섹션을 젖어.</li>
		<li>100% 에탄올에 1 분에 대 한 섹션을 젖어.</li>
		<li>크 실 렌 (욕실 1)에서 1 분에 대 한 섹션을 젖어.</li>
		<li>크 실 렌 (욕조 2)에서 1 분에 대 한 섹션을 젖어.</li>
		<li>너무 많이 크 실 렌을 제거 하지 않고 섹션을 제거 하 고 샘플 설치 매체의 한 방울을 넣어.</li>
		<li>(어떤 거품 도발) 없이 coverslip 상단에 넣어 하 고 적어도 2 시간에 대 한 강화 하자.</li>
		<li>5 조직학 (각각 다른 힘 줄)의 섹션 3 h 6 N HCl에 각 그룹은 고 5 µ m 흠 없는 섹션에서 인덱스 하이드를 측정 하 여 콜라겐의 농도 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 섹션 영역에 의해 결과 정상화.</li>
	<li>빛 그린 시각화 하 고 컴퓨터를 이용한 분석에 의해 원 콜라겐 계량 얼룩과 얼룩 섹션의 일부.</li>
	<li>섹션을 검사 하 고 변환 IrfanView 소프트웨어를 사용 하 여 회색의 뉘앙스에 그림. 소프트웨어를 사용 하 여 반 정량화 (예를 들어, 수량 1 개)에 대 한.</li>
</ol>6. 분자 평가
<ol><li>힘 줄 파열, 기계적인 테스트 하는 동안 발생 후 샘플, 스냅 액체 질소에 그들을 동결-80 ° C (PRP와 염 분 해결책)17에 그들을 저장 하 고.</li>
	<li>상업 총 RNA 키트를 사용 하 여 전체 RNA17분리.</li>
	<li>콜라겐의 식 측정 (열 나 고 열 III), 매트릭스 Metalloproteinases (MMP-2, MMP-3 및 MMP-9), 및 RT-PCR17,18여 tenomodulin (TNMD).</li>
	<li>정상화 28S19의 수준에 mRNA의 식 수준.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

혈소판은 프로세스를 치유 하는 힘 줄의 염증 초기 단계에 대 한 필수적입니다. 이러한 혈소판 바인딩 조직이 나 응고 유발 요인에 노출 되는 때 그들은 α과 립에 방류 하는 성장 인자를 발표할 예정 이다. 이 상호 작용으로 인해 세포 외 매트릭스 고분자 synthetized 고 중간 엽 세포 증식. 혈소판에는 또한 신생 및 세포질 감 별 법6,20을 자극, 혈액 순환 조상 셀에 혈 활동이 있다.
이루어졌다 biomechanical 테스트 테스트용 비보 전 인장 쥐15킬의 특별히 만든 클램핑 장치를 사용 하 여. Cryo-턱 액체 질소를 추가 하 여 근육의 수 고는 시료의 아래쪽은, 발뒤꿈치 뼈 뼈, 직접 컴퓨터에 고정 됩니다. 그것은 매우 때 근육이 완전히 엄밀한, 그러나 힘 줄은 여전히 유연 인장 시험을 시작 하는 것...

응고, 염증 성 프로세스 및 혈소판의 면역 변조 역할은 잘 알려진1입니다. 최근에, 그들은 또한 회복 속성2,3는 증명 되었습니다. 실제로, 다양 한 cytokines 및 성장 요인 (VEGF, PDGF, TGF B, IGF-난, 그리고 HGF) degranulation 동안 혈소판에 의해 발표. 이러한 성장 요인 홍보 신생, 조직 리 모델링, 그리고 상처 치유 (뼈, 피부, 근육, 힘 줄)2. 격리 방법 높은 혈소판 농도 포함 된 혈소판 리치 플라즈마 (PRP)을 생성 centrifuging 혈액 헌 혈 (3 사이 10 시간 기준 농도 혈액). 실제로, 다양 한 PRP 준비 기술 동일한 최종 제품을 제공할 수 없습니다. 지금 까지는,이 문제에 아무 국제 일반 계약이 되었습니다. 전반적으로, PRP 치료 tendinopathy, 발바닥의 근 막 염, 관절염, 등 없앤4만성 musculoskeletal 조건에 대 한 매력적인 치료 옵션 일 수 있었다. 그것은 개선 하 고 뼈 임 플 란 트 삽입 후 치유를 가속 구강 수술 및 implantology4 에서 처음으로 사용 되었다. 이 연구에서 우리는 동물 실험4에 대 한 PRP의 수집 수 있는 재연 가능한 방법도 설명 합니다.
힘 줄의 병 변을 자주 운동과 육체 노동자에서 관찰 된다, 이후 큰 관심5는 치유 과정와 따라서 복구 시간을 단축. 자주 개발 하는 새로운 치료 방법을 성장 인자를 사용 하 여 포함 하 고 PRP의 내 인 성 성장 요인4의 조화를 제공 하는 간단 하 고 최소한 침략 적 방법 이다.
여러 생체 외에서 또는 동물 연구 생물학 중재자를 방출 하 여 혈소판, 높은 수준의 포함 된 플라즈마의 생물학 중재자6 를 방출 하 여 힘 줄과 인 대 복구를 자극 수 증명 7,,89. 또한, 다른 연구 PRP 유형 I 및 III 콜라겐 합성 힘 줄에9,,1011세포 자극 수 있습니다 나타났습니다. 그것은 또한 건의 되었다 PRP 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)의 활성화를 감소 하 고 따라서 매트릭스의 저하를 줄일 수 있습니다. 염증 과정에 관련 된 셀 MMP-9, 조직 리 모델링 (생리와 pathologic) 염증12에 의해 유도 된에서 역할을 생성할 수 있습니다.
이 정보를 바탕으로, 우리가 쥐의 sectioned 아 킬 레 스 힘 줄에 단일 PRP 주사 복구 과정과 복구 조직의 기계적 강도 향상 시킬 수 있을 것을 가정 했다. 이 복구 프로세스 동안 치유 힘 줄의 biomechanical 속성을 측정 하 여 및 새로 형성된 된 조직에서 개장 하는 콜라겐을 평가 하는 조직학 및 분자 분석을 수행 하 여 테스트 됩니다. 연구의 목표는 경우 수용자 PRP의 단일 주사를 영향을 미칠 수 sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유를 관찰 했다.

<table><tbody><tr><td>자일라진(Xyl-M)</td><td>VMD</td><td>무</td><td>마취</td></tr>제 <tr><td>케타민(J&eacute; 타민 1000 CEVA)</td><td>CEVA 산트에큐트; Animale</td><td>무</td><td>마취제</td></tr><tr><td>부프레노르핀(Veterg&eacute; sic Multidosis)</td><td>ALSTOE</td><td>없음</td><td>진통제</td></tr><tr><td>iso-Betadine</td><td>MEDA-Pharma</td><td>없음</td><td>소독제</td></tr><tr><td>흡수성 원사 Vicryl 6/0</td><td>Johnson & </td><td></td><td></td>존슨</tr><tr><td>Nembutal</td><td>CEVA Sant&eacute; Animale</td><td>none</td><td>마취제</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>조직의 구조를 보존합니다</td></tr><tr><td>이소프로판올 100%</td><td>VWR</td><td>20,922,364</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 95%</td><td>VWR</td><td>20,823,362</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>VWR</td><td>28973.363</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>VWR</td><td>LEIC3950.1006</td><td></td></tr><tr><td>헤마톡실린</td><td>Millipore</td><td>1.15938.0025</td><td>착색제</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Millipore</td><td>1.15935.0100</td><td>착색제</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유 과정에서 수용자 혈소판이 풍부한 혈장 (prp)의 효과: 방법론 설명

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

이 문서에서는 PRP 긍정적으로 영향을 미칠 수 힘 줄 치유를 관찰 하는 데 사용 하는 실험 절차를 설명 합니다. 따라 4 주요 단계가 있다: 킬;에서 병 변 유발 PRP를 준비 하 고 주사 (또는 염 분 해결책); 제거 힘; 그리고 수행 평가 biomechanical, 분자, 그리고 조직학. 각 단계에서 모든 절차와 방법을 설명 세부 사항, 그래서 그들은 쉽게 재생 될 수 있다 합니다.
아 킬 레 스 힘 줄 수술 sectioned 5-m m 긴 섹션의 (제거) 되었습니다. 이후에, PRP 또는 염 류 용액 공부 PRP에 힘 줄의 치료에 긍정적인 영향을 주입 했다. (총 120 쥐가이 연구에 사용 되었다) 40 동물의 3 개 그룹 2 하위 그룹으로 세분화 했다: PRP 주사 그룹 및 식 염 수 주입 제어 그룹. 쥐가 증가 하는 시간 포인트 (그룹 a: 5 일;에 희생 했다 그룹 b: 15 일; 그룹 c: 30 일)와 힘 줄이 제거 되었습니다. 90 힘 줄 수술 biomechanical transcriptomic 분석을 수행 하기 전에 테스트 하 고 30 나머지 힘 줄 조직학 분석을 제출 했다.

결과 뜻의 평균 ± 표준 편차로 표현 하 고 분산 분석 (ANOVA)와 비교 했다. 양방향의 ANOVA와 임시 게시 테스트 데 있어, 파라메트릭 테스트, 사용 되었다.
쥐의 비 부상 아 킬 레 스 힘 줄의 파열을 자극 하는 데 필요한 궁극 장력 강도 (UTS)는 42.0 ± 5.7 N (n = 10). 인장 강도 크게 증가 (p < 0.0001) 5 일 후 두 그룹에서. 두 그룹을 비교는 UTS 높았다 PRP 그룹에서 언제 든 지 측정, 특히 15-30 일. Biomechanical 평가 (11.4 ± 5.5 m m2 에 대 한 부상 아닌 힘 줄)을 진행 하기 전에 제거 된 힘 줄의 단면적을 측정 하 여 5 일에 했다 염 분 처리 그룹에서 더 큰 발견 했다. 하지만 하루 15와 30, 단면적 PRP 그룹에서 큰이 염 치료 그룹 ...

이 프로토콜 아 킬 레 스 힘 줄의 일부를 제거한 후 수용자 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 또는 염 분 해결책 주입 되어 쥐에 있는 힘 줄 치유의 평가 과정을 설명 합니다. 힘 줄 치유의 진행은 분석의 다른 종류를 사용 하 여 여러 개의 시간 지점에서 계산 됩니다.

쥐의 Sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유 과정에서 수용자 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과: 방법론 설명

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 단회 Platelet-Rich Plasma(PRP) 주입이 수술적으로 절단된 쥐의 아킬레스건 저항성과 치유 과정에 미치는 영향을 다양한 시점에서 관찰하는 것입니다. 이 방법은 근골격계 분야의 건 손상에 관한 질문에 빠르게 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수술, 생체역학 및 PRP 진행 절차가 잘 표준화되어 있다는 점입니다.이러한 기술의 함의는 PRP를 인간에게 적용하는 것까지 확장되는데, 이는 쥐와 인간 사이의 이러한 유형의 병변과 건 치유 과정이 유사하기 때문입니다. 이 방법은 근골격계 부상을 위한 PRP 준비에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 심장 또는 피부 질환과 같은 다른 계통에도 이 주입 기술을 적용할 수 있습니다. 수술 및 생체역학적 단계는 최적의 결과를 얻기 위해 일관된 재현성이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저 쥐의 체중을 측정하고 귀 표지를 부착합니다. 발가락 집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 수준을 확인한 후, 동물의 각막에 수적을 가하고 왼쪽 뒷다리의 털을 제거합니다. 노출된 피부를 1:10으로 희석한 iso-Betadine 용액으로 소독하고, 동물을 왼쪽 뒷다리가 위로 오게 하여 측와위(lateral decubitus position)로 배치한 뒤, 해부 현미경 아래 20°C 가열 패드 위에 올립니다.포셉으로 왼쪽 뒷다리 발을 잡고 아킬레스건 주변으로 20에서 25mm 길이의 외측 피부 절개를 실시합니다. 미세 가위를 사용하여 근막을 박리하여 아킬레스건 복합체를 노출시키고 족저근건을 제거합니다. 아킬레스건의 종골 부착부에서 근위쪽으로 5mm 지점을 횡단면으로 절단하고, 5mm 길이의 부분을 제거합니다.그 다음 흡수성 봉합사를 사용하여 근막과 피부를 봉합하여 닫고, 완전히 회복될 때까지 쥐를 열원 아래에 두고 모니터링합니다. 수혜 동물이 회복되는 동안, 실험 동물당 한 마리의 공여 쥐 심장에서 20 milliliters의 전혈을 채취하여 3.2% buffered sodium citrate가 포함된 개별 튜브에 담습니다. 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻기 위해 혈액을 원심 분리하고, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 PRP가 포함된 상층액을 두 번째 플라스틱 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.수집된 PRP의 부피를 결정하고 혈액 분석기로 혈소판 수를 측정합니다. PRP를 다시 원심 분리하고 상층액을 새 플라스틱 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. PRP 튜브에 남은 부피는 µL당 2.5 × 10⁶개의 혈소판을 달성하는 데 필요한 부피의 약 2/3가 되어야 합니다.다음으로, 피펫팅을 통해 혈소판 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 이 농축 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 혈소판 수치를 측정하고, 필요에 따라 목표 농도에 도달할 수 있도록 적절한 부피의 자가 혈소판 결핍 혈장을 다시 첨가합니다. PRP 1 mL당 50 µL의 염화칼슘을 넣어 실온에서 약 1시간 동안 혈소판을 활성화합니다.그런 다음 21-gauge 바늘이 장착된 1mL 주사기에 혈소판을 충전하고, 각 동물의 봉합 부위에 혈소판 50 µL를 직접 주입합니다. 적절한 실험 종료 시점에 마취된 실험 동물의 왼쪽 뒷다리 털을 깎고, 방금 시연한 것과 같이 해부 현미경 아래에 쥐를 배치합니다. 손가락으로 발을 잡고, 수술 부위에 10 mm 절개를 가하여 triceps suralis를 노출시킵니다.아킬레스건을 제거하려면, 부착 부위에서 원위쪽으로 5~10 mm 지점에서 종골을 횡단면으로 절단하고 크라이오-죠(cryo-jaw)에 들어갈 만큼 충분한 크기의 비복근-가좌미근(triceps suralis) 조각을 박리합니다. 포셉을 사용하여 샘플을 즉시 크라이오-죠의 상부 죠에 배치하고 기기를 닫습니다. 크라이오-죠를 만능 재료 시험기(universal testing machine)에 수직으로 설치하고, 하부 클램프 사이에 종골을 고정합니다.단면적을 계산하기 위해 카메라를 서로 수직으로 배치합니다. 인장 시험 중 근육이 변형되지 않도록, 근육이 건보다 한 자릿수 더 뻣뻣해질 때까지 양쪽 상악 베이슨에 액체 질소를 추가하여 동결시킵니다. 동결 구역이 금속 클램프 경계에 도달하면, 기기의 변위 속도를 파단 시까지 초당 1mm의 일정한 속도로 설정하고 인장 시험을 시작하며, 컴퓨터를 사용하여 뉴턴(N) 단위의 최종 인장 강도를 기록합니다.치유 중인 힘줄의 단면적 차이를 고려하기 위해, 최대 인장 강도를 조직이 겪는 기계적 응력을 나타내는 단위 면적으로 정규화하십시오. 그 다음 힘줄이 파열되면, 파열된 힘줄 샘플을 액체 질소에 급속 냉동하고 RNA 추출 및 RTPCR 분석 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 이 대표 실험에서, 테스트한 모든 시점에서 대조군인 식염수 처리군보다 PRP 주입군에서 힘줄 파열을 유도하는 데 더 큰 힘이 필요했으며, 이는 PRP 처리된 동물에서 더 강력한 치유 과정 또는 더 나은 기계적 특성이 나타났음을 시사합니다.PRP 군의 그룹 내 분산이 식염수 군보다 더 크게 나타났으나, 손상 유발 후 15일 및 30일째에 PRP 주입 군의 건 단면적이 더 큰 것으로 확인되었습니다. 또한, Masson's trichrome 염색 결과, 건의 형태와 강도의 핵심 성분인 섬유성 콜라겐이 PRP 처리 동물에서 5일 및 15일째에 더 많이 관찰되었으며, 주입 후 30일째에는 두 그룹 모두에서 유사한 염색 강도가 관찰되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 쥐의 표준 손상을 유발하는 방법과 PRP 주입 후 치유 과정을 평가하기 위해 건 샘플을 채취하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 비디오는 쥐의 절편된 아킬레스건에 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 주입하는 기술을 보여줍니다. 수혜자 쥐의 아킬레스건에서 작은 부분을 절제하고, 해당 부위를 봉합하고, 쥐가 회복할 수 있도록 합니다. 동시에, 기증자 쥐에서 전혈을 채취하고 원심분리하여 PRP를 얻은 다음 활성화하고 수혜자 쥐의 봉합 부위에 주입하여 힘줄 복구를 유도합니다.

쥐의 절편화된 아킬레스건에 혈소판이 풍부한 혈장 주입

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