쥐의 Sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유 과정에서 수용자 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과: 방법론 설명

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 시점에서 수술로 절제된 쥐 아킬레스 건의 저항 및 치유 과정에 대한 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 단일 주입의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 힘줄 병변에 대한 근골격계에 대한 간단한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수술, 생체 역학 및 PRP 진행 절차가 잘 표준화되어 있다는 것입니다.

이러한 기술의 의미는 인간에 대한 PRP 사용으로까지 확장되는데, 이러한 유형의 병변과 힘줄 치유 과정이 쥐와 인간 간에 유사하기 때문입니다. 이 방법은 근골격계 부상에 대한 PRP 준비에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 이 주입 기술은 심장이나 피부 질환과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 수술 및 생체 역학 단계는 최적의 결과를 얻기 위해 일관된 재현성이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다.

쥐의 무게를 측정하고 귀에 태그를 붙이는 것으로 시작하십시오. 발가락 꼬집음으로 적절한 진정 수준을 확인한 후 동물의 각막에 물방울을 바르고 왼쪽 뒷다리의 털을 제거합니다. 노출된 피부를 1:10 희석한 이소-베타딘 용액으로 소독하고 동물을 섭씨 20도의 가열 패드에 올려 놓고 왼쪽 뒷다리를 우위에 두고 측면 욕창 위치에서 해부 현미경으로 놓습니다.

왼쪽 뒷발을 집게로 잡고 아킬레스건 주위를 20-25mm 측면 피부 절개합니다. 가는 가위를 사용하여 근막을 절개하여 아킬레스건 복합체를 노출시키고 족저근을 제거합니다. 종골 삽입부에서 5mm 떨어진 아킬레스건을 가로로 자르고 5mm 길이의 부분을 제거합니다.

그런 다음 흡수성 실을 사용하고 봉합사를 계속하여 근막과 피부를 닫고 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 쥐를 열원 아래에 놓습니다. 수용 동물이 회복하는 동안 실험 동물 1마리당 기증자 쥐 심장 1마리에서 20ml의 전혈을 3.2%의 완충된 구연산나트륨이 포함된 개별 튜브에 수집합니다. 혈소판이 풍부한 혈장을 얻으려면 혈액을 원심분리하고 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 PRP 함유 상부를 두 번째 플라스틱 튜브로 조심스럽게 채취합니다.

수집된 PRP의 부피를 측정하고 혈액학 분석기에서 혈소판 수를 측정합니다. PRP를 다시 원심분리하고 상층액을 새 플라스틱 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. PRP 튜브의 남은 부피는 마이크로리터당 6번째 혈소판의 2.5 곱하기 10을 달성하는 데 필요한 부피의 약 2/3여야 합니다.

다음으로, 피펫팅으로 혈소판 펠릿을 부드럽게 다시 매달아 놓습니다. 이 농축된 혈소판이 풍부한 혈장의 혈소판 수를 측정하고, 필요에 따라 목표 농도에 도달하기 위해 적절한 부피의 자가 혈소판 부족 혈장을 다시 추가합니다. PRP 1밀리리터당 50마이크로리터의 염화칼슘으로 혈소판을 실온에서 약 1시간 동안 활성화합니다.

그런 다음 21게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기에 혈소판을 넣고 50마이크로리터의 혈소판을 각 동물의 봉합 부위에 직접 주입합니다. 적절한 실험 종점에서 마취된 실험 동물의 왼쪽 뒷다리를 면도하고 방금 시연한 것처럼 쥐를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 손가락으로 발을 잡고 수술 부위를 10mm 절개하여 삼두근이 드러나게 합니다.

아킬레스건을 제거하려면 종골 뼈를 부착부에서 원위 5-10mm로 가로로 자르고 동결턱에 들어갈 만큼 큰 삼두근 수랄리스 조각을 절개합니다. 집게를 사용하여 샘플을 cryo-jaw의 상부 죠에 즉시 놓고 기기를 닫습니다. cryo-jaw를 만능 재료 시험기에 수직으로 놓고 아래쪽 클램프 사이에 종골 뼈를 고정합니다.

단면적을 계산하려면 카메라를 서로 수직으로 배치하십시오. 양쪽 위턱 대야에 액체 질소를 첨가하여 근육을 힘줄보다 더 단단한 크기로 얼려 인장 시험 중에 변형되지 않도록 합니다. 동결 영역이 금속 클램프 경계에 도달하면 파열될 때까지 초당 1mm의 일정한 속도로 기계의 변위 속도를 설정하고 컴퓨터를 사용하여 극한 인장 강도를 뉴턴 단위로 기록하여 인장 시험을 시작합니다.

치유 힘줄의 단면적 차이를 설명하려면 극한 인장 강도를 조직이 받는 기계적 응력을 나타내는 단위 면적으로 정규화합니다. 그런 다음 힘줄이 파열되면 파열된 힘줄 샘플을 액체 질소에 급속 동결하고 RNA 추출 및 RTPCR 분석이 완료될 때까지 섭씨 음의 80도에서 보관합니다. 이 대표적인 실험에서는 테스트 시점마다 대조군 식염수를 투여한 그룹보다 PRP를 주입한 그룹에서 힘줄 파열을 유도하는 데 더 큰 힘이 필요했으며, 이는 PRP 투여된 동물 내에서 더 강력한 치유 과정 또는 더 나은 기계적 특성을 시사합니다.

PRP 그룹이 식염수 그룹보다 더 높은 그룹 내 산란을 보였지만, 힘줄의 단면적은 병변 유도 후 15일과 30일에 PRP 주입 그룹에서 더 큰 것으로 확인되었습니다. 또한, Masson의 트리크롬 염색은 PRP 처리 동물에서 5일과 15일에 힘줄 형태 및 강도의 핵심 구성 요소인 섬유소 콜라겐이 더 높은 존재를 보여주었으며, 주사 후 30일째까지 두 그룹 모두에서 유사한 염색 강도가 관찰되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 표준 병변을 유도하는 방법과 PRP 주사 후 치유 과정을 평가하기 위해 힘줄을 샘플링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.