Name: 생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술 콜레라 비브리오 임상 적 및 환경 적 분리 물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 Vibrio cholerae 임상 및 환경 분리물을 생화학 분석으로 특성화하는 방법을. 이 기술은 비용이 많이 드는 실험 없이도 신뢰할 수 있는 생물형 구별을 가능하게 합니다.

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뉴 햄프셔 - 인 브레 (New Hampshire-INBRE)가 NIH의 국립 종합 의학 연구소 (National Medical Sciences of NIH)의 기관 개발상 (IDeA), P20GM103506을 통해 지원

참고 : 개별 배지 준비가 다른 시간을 필요로하기 때문에 각 분석에 대한 시간 고려 사항을 만들어야합니다. 예를 들어, 고체 한천 평판 배지는 충분히 냉각되고 건조되어야합니다 (1-2 일). 추가적인 시간 고려 사항 ( 즉, 단일 식민지와 야간 배양기의 성장)은 각 프로토콜에 명시되어 있으며 표 2 에 나와 있습니다. 1. 미디어 준비 <ol><li> 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) <ol><li> NaCl 4.0g, KCl 0.1g, Na2HPO4 0.72g 및 KH2PO4 0.12g을 칭량한다. 1 L 삼각 플라스크에 성분을 합하고, 탈 이온수로 부피를 500 mL로 조정하고, pH 미터를 사용하여 pH를 7.2로 조정하고, HCl을 용액에 적가 한 다음, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 오토 클레이브 또는 필터 멸균한다. 1x PBS는 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다. 주의 : HCl은 농축산이므로 취급시주의해야합니다.기관, 지방, 주 및 연방 규정에 따라 다릅니다. 적절한 취급 지침은 제조업체가 제공 한 안전 데이터 시트를 참조하십시오. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) 배지 <ol><li> 트립 톤 5.0g, 효모 추출물 2.5g, NaCl 2.5g. 구성 성분을 1L 병에 넣고 탈 이온수, 오토 클레이브로 500mL로 부피를 조절하고 최대 6 개월 동안 실온에서 보관하십시오. 고전적인 생물 형 독성 유발 조건의 경우, 오토 클레이브 전에 HCl을 사용하여 pH를 6.5로 조정하십시오. </li></ol></li><li> 0.03 % (w / v) NaHCO3를 함유하는 AKI 배지 <ol><li> 성분 1 (AKI 배지)의 경우 : 펩톤 7.5g, 효모 추출물 2.0g 및 NaCl 2.5g의 무게를 잰다. 1 L 병에 성분을 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 용량을 450 mL로 맞 춥니 다. AKI 배지는 실온에서 최대 6 개월 동안 보관할 수 있습니다. </li><li> 성분 2 (NaHCO3)의 경우 : 1.5g NaHCO3의 무게를 재고, 부피를 조절한다멸균 된 소포에서 탈 이온수로 50 mL로. 0.22 μm 필터를 사용하여 NaHCO 3 을 멸균 여과하십시오. NaHCO 3 는 사용 직전에 준비해야합니다. </li><li> 사용하기 전에 구성 요소 2를 구성 요소 1로 필터링하여 1:10 비율을 만드는 두 구성 요소를 무작위로 결합합니다. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트 <ol><li> 트립 톤 5.0 g, 효모 추출물 2.5 g, NaCl 2.5 g 및 한천 7.5 g의 무게를 잰다. 1L 삼각 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수, 오토 클레이브로 500mL로 부피를 조절하고 표준 크기의 100mm x 15mm 무균 페트리 접시로 준비합니다. 도금 된 배지는 최대 6 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Polymyxin B가 보충 된 LB 한천 플레이트 <ol><li> 성분 1 (LB 한천)의 경우 : 트립 톤 5.0 g, 효모 추출물 2.5 g, NaCl 2.5 g 및 한천 7.5 g을 잰다. 성분을 1L 삼각 플라스크에 합치고 부피를 500 mL로 맞춘다.탈 이온수 및 오토 클레이브. </li><li> 성분 2 (polymyxin B)의 경우 : 멸균 된 2 mL microcentrifuge tube에서 탈 이온수에 polymyxin B를 50,000 IU / μL의 농도로 용해시키고 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균합니다. </li><li> 일단 성분 1이 차갑지 만 아직 고화되지 않으면 무균 적으로 성분 2 500 μL를 성분 1에 첨가하여 50 IU / μL의 최종 농도를 만들고 철저하게 혼합합니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 표준 크기의 100mm x 15mm 멸균 배양 접시에서 준비합니다. 도금 된 용지는 최대 3 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑이있는 쪽은 4 ° C까지 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 최소 구연산염 중형 한천 플레이트 <ol><li> 성분 1 (브롬 티몰 블루가 포함 된 한천) : 7.5g 한천과 0.02g 브로 모티 몰 블루. 1L 엘렌 마이어 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수로 450mL로 부피를 조절하고 혼합물을 고압 멸균한다. </li><li> 구성 요소 2 (10x VBMM)의 경우 : 1MgSO4 7H2O 10g, 구연산 H2O 10.0g, K 2 HPO 4 무수물 50.0g 및 NaNH 4 HPO 4 4H 2 O 17.5g을 넣는다. 1L 삼각 플라스크에 성분을 합하여 용량을 500mL 탈 이온수 및 오토 클레이브로 여과하거나 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 필터 살균합니다. 10x VBMM은 실온에서 6 개월까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 구성 요소 1에 구성 요소 2 50 ML을 추가하고 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 표준 크기의 100mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비하십시오. 도금 된 배지는 최대 6 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 우유 한천 접시 <ol><li> 성분 1 (우유)의 경우 : 1L 삼각 플라스크에 인스턴트 무 지방 분유 8.0g을 달아 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 200mL로 맞춘다. </li><li> 성분 2 (뇌 심장 주입 한천) : 뇌 심장 주입 3.68 g과 한천 6.0 g의 무게를 잰다. 사기를 맺어 라.수용액을 500 mL 삼각 플라스크에 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 200 mL로 맞춘다. </li><li> 오토 클레이브 한 후 성분 2를 성분 1에 붓고 두 성분을 혼합하고 철저히 혼합합니다. 150mm x 15mm 무균 페트리 접시를 준비하십시오. 밀크 플레이트는 플라스틱으로 싸여 1 주일 동안 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 아래로 4 ° C 아래에 보관할 수 있습니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비합니다. </li></ol></li><li> 운동성 한천 플레이트 <ol><li> 성분 1 (LB 한천) : tryptone 5.0g, 효모 추출물 2.5g, NaCl 2.5g 및 한천 2.0g을 잰다. 1L 엘렌 마이어 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 500mL로 맞춘다. </li><li> 성분 2 (1 % (w / v) 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드; TTC) : 0.25 g TTC의 무게. 멸균 소포에서 탈 이온수로 25 mL로 부피를 조정하고 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균합니다. 상온에서 6 개월 동안 보관하십시오.광 노출을 최소화하기 위해 호일에 넣습니다. </li><li> 1 % (w / v) 멸균 TTC 2.5 ML을 autoclaved 미디어에 추가합니다. </li><li> 대형 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에 가능한 한 두꺼운 배지 (≥50mL / 플레이트)를 붓습니다. 도금 된 미디어는 최대 1 주일 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비합니다. </li></ol></li><li> 보그 - 프로스카 우어 (VP) <ol><li> 성분 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer broth, MR-VP) : 500 mL 삼각 플라스크에 1.7 g MR-VP 배지를 달고 탈 이온수와 오토 클레이브로 100 mL로 부피를 조절한다. 무균 MR-VP 배지는 실온에서 6 개월까지 보관할 수 있습니다. </li><li> 성분 2 (5 % (w / v) 알파 (나) 나프톨)의 경우 : 멸균 소포에서 1.0 g의 α- 나프톨을 달아 95 % 에탄올로 20 mL로 부피를 조절한다. α- 나프톨은 실온에서 최대 1 주간 호일에 싸여 가벼운 효과를 최소화 할 수 있습니다.오 슈레. </li><li> 성분 3 (40 % (w / v) 수산화 칼륨, KOH) : 멸균 소포에서 KOH 20.0g을 멸균 탈 이온수로 50mL로 부피를 조절한다. KOH는 상온에서 최대 6 개월 동안 플라스틱 용기에 보관할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. V의 유지와 성장. 콜레라 균 균주 <ol><li> 냉동 주식 배양 물의 준비와 사용 <ol><li> 멸균 2 ML microcentrifuge 튜브에서 centrifugation (≥8,600 xg)에 의해 2 분 동안 액체 밤새 문화의 펠렛 1.8 ML, 뜨는 제거하고 pipetting하여 신선한 LB 국물의 900 μL에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 멸균 60 % (V / V) 글리세롤 900 μL를 배양 물에 넣고 볼 텍싱하여 혼합합니다. </li><li> 혼합물을 멸균 2 mL 극저온 튜브에 옮기고 -80 ° C에 무기한 보관하십시오. </li><li> 사용하려면 LB ag에 단일 식민지에 대한 멸균 접종 루프 및 줄무늬를 사용하여 소량의 얼어 붙은 주식을 제거하십시오ar 접시. 배양 물이 완전히 해동되는 것을 방지하기 위해 냉동 재고를 사용 후 즉시 -80 ° C로 되돌립니다. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오. </li></ol></li><li> 액체 배지에서의 밤새 배양의 성장 <ol><li> 얼린 주식에서 LB 한천 플레이트로 단일 식민지에 대한 줄무늬 (섹션 2.1.4에 따라). 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오. </li><li> 멸균 어플리케이터 스틱으로 단일 식민지의 표면을 만지고 액체 배지로 식민지를 전송하여 단일 식민지와 멸균 10 ML 배양 튜브에 액체 LB 배양액 4 ML을 예방 접종. </li><li> 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 225 rpm으로 쉐이커 배양기에서 통기와 함께 품어 낸다. </li></ol></li><li> 성장 곡선 <ol><li> 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다. </li><li> 밤새 문화 250 μL를 2로 옮겨서 야간 배양 물을 1 : 100로 희석한다.멸균 된 250 mL 삼각 플라스크에 5 mL의 신선한 LB 브로스. </li><li> 접종 시간 (T 0 )에 시작하여 매시간 600 nm (OD 600 )에서 액체 배양 물의 광학 밀도를 측정합니다. </li><li> 37 ° C에서 30 시간 동안 225 rpm의 쉐이커 배양기에서 통기와 함께 밤새 배양 한 1 : 100 희석 배양 물을 배양하거나 배양액이 최대 밀도에 도달 할 때까지 배양하십시오. </li><li> OD 600 vs. Time을 그래프로 표시하고 선형 회귀를 사용하여 각 변형에 대한 대략적인 배가 시간을 결정합니다. </li></ol></li><li> 엘 토르 바이오 타입 병원성 유도 조건 <ol><li> 얼린 주식에서 LB 한천 접시에 단일 식민지에 대한 줄무늬. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 플레이트 뚜껑면을 아래로 배양하십시오. </li><li> 단일 식민지와 0.03 % (w / v) NaHCO 3 함유 AKI 매체 10 ML을 예방 접종. </li><li> 37 ° C에서 3.5 시간 통기없이 배양하십시오. </li><li> 배양액 7 mL를 제거하고 나머지 3 mL 배양쉐이커 인큐베이터 (saker incubator)에서 225rpm으로 폭기하여 추가 4 시간. </li></ol></li><li> 고전적 Biotype 병적 상태 유도 조건 <ol><li> 얼린 주식에서 LB 한천 접시에 단일 식민지에 대한 줄무늬. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오. </li><li> 단일 콜로니와 함께 4 ML 액체 LB 브로스 (pH 6.5)를 예방 접종. </li><li> 30 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 225 rpm으로 쉐이커 인큐베이터에서 폭기로 품어 낸다. </li></ol></li><li> 1x PBS로 세척 셀 펠렛 <ol><li> 멸균 2 ML microcentrifuge 튜브에서 원심 분리 (≥8,600 XG)에 의해 2 분 동안 밤새 문화의 펠렛 1.8 ML 및 피펫을 사용하여 뜨는을 제거하십시오. pipetting하여 1.8 ML 1X PBS에서 세포 펠렛을 다시 중단하십시오. </li><li> 1.8 ML 1X PBS에서 최종 resuspension 다음에 세 번 세척 절차를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 3. V 특성화. cholerae Biotypes <ol><li> 피ctxB 와 tcpA 를 이용한 CR 기반 유전자 스크린 <ol><li> ctxB 및 tcpA의 번역 시작 및 정지 부위의 상류 및 하류에 각각 약 50-70 bp 어닐링하는 프라이머 세트를 설계하십시오. </li><li> 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다. </li><li> 염색체 DNA를 그람 음성 세균 용으로 설계된 시판용 키트를 사용하여 분리합니다. 정화 된 염색체 DNA는 -20 ° C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하는 염색체 DNA 분리는 일반적으로 약 4 시간이 걸립니다. </li><li> 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 염색체 DNA 샘플이 고품질 (A 260/280 &gt; 1.8)인지 확인하십시오. </li><li> 각 염색체 DNA 단리에 대해 멸균 200 μL PCR 튜브 (s)에서 얼음으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 만들고 표준 PCR 성분을 사용하여 ctxB 및 tcpA의 영역을 증폭시킵니다 : Taq polymerase and buffer (또는 등가물), dNTP 용액 및 정방향 / 역방향 프라이머가 포함됩니다. 표준 PCR 매개 변수를 사용하십시오 (~ 3 시간). 예를 들어, 다음 프로토콜을 사용하십시오. <ol><li> 95 ° C에서 120 초 동안 초기 변성. </li><li> 95 ° C에서 60 초 동안 변성. </li><li> 60 ° C에서 45 초 동안 Anneal 프라이머. </li><li> 72 ° C에서 90 초간 연장하십시오. </li><li> 34 사이클 동안 3.1.5.2 ~ 3.1.5.4 단계를 반복하십시오. </li><li> 최종 연장 72 ° C에서 600 초. </li><li> 4 ° C에서 무한히 기다리십시오. </li></ol></li><li> 표준 6X DNA 겔로드 염료를 사용하여 각각의 PCR 산물 5 μL를 염색하고 1X Tris-Borate-EDTA (TBE)의 1 % 아가 로스 젤에 1 kb 사다리와 10 μL의 PCR 산물 약 10 μL를 넣습니다. 완충기. </li><li> 염료 전선이 젤의 끝 부분에 도달 할 때까지 130V에서 겔 전기 영동을 실행하십시오 (약 90 분). 전압에 따라 지속적인 모니터링이 권장되며 장비에 따라 작동 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> 확인시예상 크기의 성공적인 PCR 증폭, 시중에서 판매하는 DNA 청정 및 농축기 키트를 사용하여 나머지 45 μL PCR 생성물을 정제하십시오. </li><li> PCR 증폭에 사용 된 것과 동일한 프라이머를 사용하여 PCR 제품을 세척하고 로컬 시퀀싱 설비 지침에 따라 준비하십시오. </li><li> 검색 결과 상자에서 다음 수식 번호를 검색하여 NCBI 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)에서 사용할 수있는 출판 된 서열에 대한 각각의 분리 된 유전자 서열의 FASTA 형식을 비교하십시오. </li><li> ctxB : (클래식) VC0395_A1059 ~ VC0395_A1060 (엘 토르) VC_1456 </li><li> tcpA : (클래식) VC0395_A0353 (엘 토르) VC_0828 </li></ol></li><li> Spotting을 통한 Biotype 분류를위한 Phenotypic Assays <ol><li> 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다. </li><li> 프로토콜 2.6에 명시된대로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 피펫을 사용하여세척 한 배양액 1 μL를 각각의 배지에 넣는다. 중간 배양 및 항온 배양에 대해서는 표 2를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 운동성 분석 <ol><li> 앞서 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다. </li><li> 프로토콜 2.6에 명시된대로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 씻은 액체 배양액에 주사 접종을 삽입하고 배지에 수직으로 &quot;삽입&quot;하여 운동성 한천 플레이트를 접종합니다. 각 접종 사이에 Bunsen 버너를 사용하여 와이어 찌꺼기를 멸균하고, 한천을 찔렀을 때 접종 된 찌름이 구부러지지 않도록하십시오. 결과가 바뀔 수 있습니다. </li><li> 37 ° C에서 14 ~ 24 시간 동안 뚜껑이 위를 향하도록 플레이트를 배양하십시오. 14 시간 후, 운동성 플레이트를 면밀히 모니터하여 배양 물의 과증식을 예방하십시오. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) 분석법 <ol><li> 앞서 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다. </li><li> 접종 4미리 준비한 하룻밤 배양액 10 μL를 멸균 배양 튜브에서 MR-VP broth 4 mL에 pipette하고, 쉐이커 배양기에서 225 rpm으로 12에서 16 사이의 통기와 함께 배양하여 메틸 레드 Voges-Proskauer 또는 MR-VP broth h에서 37 ° C. </li><li> 멸균 배양 튜브에서 MR - VP 하룻밤 배양의 1 ML의 aliquots 각각 5 % (W / V) α- 나프톨과 50 μL 40 % (W / V) KOH 150 μL를 추가합니다. </li><li> 간단히 와동하고 색상 변화가 발생할 때까지 최대 4 시간 동안 실온에서 방치합니다. </li></ol></li></ol>

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200 개 이상의 식별 된 V 중 . cholerae serogroups, 오직 O1과 O139만이 전염병 가능성이있다. O1 혈청 그룹은 클래식과 엘 토르의 두 가지 바이오 타입으로 나눌 수 있습니다. 그러나 엘 토르 (El Tor) 변종 13,17이라고 불리는 하이브리드 계통이 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입 배경을 가지고 있으며 고전적 특성 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 <sup...

콜레라 (Cholera)는 오염 된 음식물이나 수생 그람 음성 박테리아 인 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)를 함유 한 물의 섭취로 말초 소장의 질병입니다. 콜레라의 증상으로는 구토와 통제 할 수없는 수분 설사가 있으며 심한 탈수증을 유발합니다. 제대로 치료하지 않으면 사망에 이릅니다. V. 콜레라 는 세포 표면 리포 폴리 사카 라이드 O- 항원의 구조에 따라 200 개 이상의 혈청군으로 나눌 수 있습니다. 그러나 O1과 O139의 2 가지 혈청군 만이 전염병 또는 유행성 잠재력 1 , 2을 나타냈다. 또한, 혈청 그룹 O13은 주로 동남 아시아 3 , 4에 격리되어 있으며 혈청 그룹 O1은 전 세계적으로 분포되어있다. 또한, O1 혈청 그룹은 2 가지 주요 바이오 타입으로 분류 될 수있다 : 클래식 및 엘 토르. 고전적인 생물 종은 콜레라 전염병 유행병진행중인 일곱 번째 전염병은 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입의 결과로 환경에서 5 , 6 , 7 의 고전적 바이오 타입을 전 세계적으로 대체하고있다. 최근에는 클래식 및 엘 토 바이오 타입 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 의 특징을 지닌 균주가 생겨 났으며 , 이후 엘 토르 변종 13 , 17 이라고 명명되었습니다. 일부 엘 토르 (El Tor) 변종은 이전에 관찰 된 것보다 더 빠르고 심각한 질병 진행으로 상승 된 병독성 능력을 입증했으며,에이전트 식별 및 질병 예방 및 치료에 대한보다 포괄적 인 접근 방법의 필요성 8 , 9 , 18 . 생물 종 동정은 치료를 즉시 지시하지는 않지만 백신 개발 및 향후 치료제의 발전은 생물 형별의 이점을 얻을 수 있습니다. 여기에 열거 된 첫 번째 일련의 프로토콜은 조사자가 V 를 적절히 유지할 수있게합니다. cholerae 실험실 환경에서의 변종. 일관성 및 후속 분석을 위해서는 생물학적 특성에 의존하지 않는 균주의 재배 및 성장이 필요합니다. 그러나, 독성 유전자 발현을 최적으로 유도하기 위해서는 독립적 인 생물 종 특이 적 배양 기술이 필요합니다 19 . 또한, 다양한 유전 및 생화학 분석을위한 준비가이 원고에 설명되어 있습니다. 콜레라 독소 (CT)와 독소가 다시 반응합니다.gulated pilus (TCP)는 V 의 두 가지 생물 유형 모두에서 마스터 조절 자 ToxT에 의해 제어되는 두 가지 주요 독성 인자이다. cholerae O1 혈청 군 20 . CT는 5 개의 CtxB로 구성된 bipartite 독소입니다. 단일 CtxA 서브 유닛을 둘러싸고있는 서브 유닛이며 콜레라와 관련된 급속한 전해질 손실을 일으킨다. TCP는 tcp 오페론 ( tcpABQCRDSTEF )에 의해 암호화 된 유형 IV 파일로 말초 소장의 부착과 집락에 관여합니다. tcpA 는 필라 스 8 구축에 필수적인 개별 필린 서브 유닛을 암호화하는 tcp 오페론의 첫 번째 유전자입니다. ctxA 의 유전자 서열은 클래식과 El Tor 바이오 타입 사이에서 완전히 보존되는 반면, ctxB 와 tcpA 는 두 바이오 타입 간에 다르지만 각 바이오 타입 내에서 보존된다. ctxB 는 2 개의 염기 자리를 제외한 바이오 타입 사이에서 완전히 보존된다(115 및 203). 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입에서, 티민은 115 번과 203 번 위치에 있고, 전형적인 바이오 타입은이 염기에 시토신을 포함하고있다. tcpA 는 각 바이오 타입 내에서 완전히 보존되지만, 바이오 타입 사이의 여러 기지에서 다르다. 이러한 유전 적 특성은 일차적 인 생물 종 식별 마커 역할을하며, 이들 부위를 포함하는 폴리 메라 이제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 산물을 시퀀싱 한 후에 야생형 (WT) 고전 O395 또는 WT El Tor N16961과 비교하여 생물 형질의 배경을 결정할 수있다 주어진 V. cholerae 균주에서 CT와 TCP의 발현 양상을 비교 하였다. 클래식과 El Tor biotypes 21 , 22 , 23 사이의 표현형 차이를 특성화하기 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. Polymyxin B는 그람 음성 백신에서 외부 세포막의 완전성을 손상시키는 펩타이드 항생제입니다.teria 및 polymyxin B 저항성은 polymyxin B 저항성 분석을 통해 시각화 할 수 있습니다 21 . 구연산염은 크렙스 사이클의 주요 기질이며 구연산염을 유일한 탄소원으로 대사하는 능력은 구연산 대사 분석법 22 를 사용하여 결정할 수 있습니다. hapR 은 다양한 프로모터 지역에 결합하고 유전자와 오페론 발현을 조절하는 V. cholerae, HapR의 글로벌 조절기와 마스터 쿼럼 감지 조절기를 암호화합니다. V. cholerae 의 일부 병원성 균주는 hapR 유전자에서 자연적으로 발생하는 프레임 변이 돌연변이를 가지고 있으며, 이로 인해 독성 유전자 발현의 밀도 의존적 ​​조절이 24 , 25 개 손실되었다. 우유 한천 배지를 사용하여 HapR- 조절 프로테아제 활성을 측정하면 연구자는 특정 분리주가 기능적 HapR23을 함유하고 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 그만큼용혈 분석법은 적혈구를 용해시키는 용혈 효소를 분비하는 균주의 능력을 시험한다. 용혈 정도를 혈액 한천 플레이트 23 에서 시각화 할 수 있습니다. 운동성은 종종 V. cholerae의 병독성과 관련이 있으며 운동성 한천 플레이트 23을 사용하여 분석 할 수 있습니다. Voges-Proskauer assay는 포도당을 유일한 탄소원으로 발효시켜 부산물 인 acetoin 21 을 생산하는 균주의 능력을 시험합니다. 엘 토르 (El Tor) 변종이 출현함에 따라 광범위한 유전자형 스크리닝없이 V의 바이오 타입 배경을 추론하기 전에 주어진 표현형 분석의 결과를 예측하기가 어렵습니다. cholerae isolates의 경우, assays 23 의이 assembly를 수행하고 그 결과를 표 2 에서와 같이 참조 균주와 비교하는 것이 추천된다. 여기서 우리는 일련의 프로토콜을 발전 시켰으며,V 를 특성화하기위한보다 포괄적 인 접근을위한 genotypic 및 phenotypic 분석법의 사용. cholerae biotypes. 또한, 우리는 알려진 V 의 genotypic 및 phenotypic 구분을 설명했다. (WT 고전적 O395, WT El Tor C6706 및 WT El Tor N16961, 표 1 )와 비교하여, 콜레라 엘 토르 변이체 (MQ1795 및 BAA-2163)를 사용하는 것이 바람직하다. 엘 토르 (El Tor) 변종의 출현은 이전에 사용 된 단일 분석 생물 형질 규명 프로토콜의 신뢰성에 대한 문제점을 제기했다. 그러나,이 다중 분석법 식별 시스템은 임상 및 환경 V 의보다 신뢰성있는 특성 분석을 가능하게합니다. cholerae isolates.

<table><tbody><tr><td>1kb DNA 사다리</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder 60% 글리세롤</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352 Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>뇌-심장 주입 한천</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>무수 K2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>혈액 한천 플레이트</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>4 &deg에 저장; 씨;&nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>붕산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>브로모티몰 블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &middot; H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 Deoxynucleotide (dNTP) 솔루션 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>-20 &deg; 씨;&nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>디소듐 EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA 클린 & 집중 장치 &trade; -25 키트</td><td>자이모 리서치</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen 핵산 스테인</td><td>비오튬</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr> <tr><td>Genesys 10SUV-VIS 분광 광도계</td><td>써모 사이언티픽</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene 효모/박테리아 키트</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td></td></tr><tr><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>부식성의; &nbsp; </td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID KCl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr> <tr><td>르 스탭</td><td>디콘 랩스 Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr> <tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>미니 서브 셀 GT 수평 전기영동 시스템</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP 육수</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH4HPO4&middot; 4H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 분광계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>네슬레 카네이션</td><td>N/A</td> N<td>/</td></tr><tr><td>A 펩톤</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>페트리 접시 (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>페트리 접시 (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID 폴리믹신 B 황산염 소금</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>2-4 &deg에 저장; C; </td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=USTaq DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>-20 &deg에서 저장; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Taq 반응 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>-20°C에서 보관; 씨;&nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>써멀 사이클러 Bio-Rad C1000 Touch&trade; &nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td></td><td>1840148 http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드</td><td>알파 Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr> <tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID 트립톤</td><td>벡토, 디킨슨 및 공동.</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch 효모 추출물</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td></td></tr> <tr><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch&alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em&gt; 콜레라 비브리오</em&gt; 임상 적 및 환경 적 분리 물

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

수중 그람 음성 박테리아 Vibrio cholerae 는 감염성 위장병 콜레라의 원인균입니다. 이 질병의 세계적 유병률과 중증도 때문에 V. cholerae 는 환경 및 실험실 환경에서 광범위하게 연구되어 왔으며 적절한 유지 관리 및 배양 기술이 필요합니다. Classical과 El Tor는 V 를 구성하는 두 가지 주요 biotypes입니다. cholerae O1 serogroup은 각각 고유 한 genotypic과 phenotypic 특성을 나타내어 생물 종 특성 결정을위한 신뢰할 수있는 메커니즘을 제공하고 배양 조건을 유도하는 독성을 필요로한다. 주어진 감염 또는 발병에 대한 원인 균주의 생물 유형에 관계없이, 질병의 표준 치료에는 항생제 처방으로 보충 된 수분 요법이 포함됩니다. 그러나 생물학적 분류는 실험실 연구에 필요할 수 있으며 생물 의학 분야에서 더 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.2000 년대 초반에는 임상 적으로 분리 된 균주가 확인되었는데, 이는 고전 및 엘 토 바이오 타입의 유전형 및 표현형 특성을 나타냅니다. 엘 토르 (El Tor) 변종으로 불리는 새롭게 확인 된 잡종 (hybrid)은 임상 적 및 환경 적으로 격리 된 생물 종 식별을 이전의 전통적인 단일 분석 식별 프로토콜보다 더 복잡하게 만들었다. V 를 기술하는 것 외에. (copyyyin B 저항성, 구연산 대사, 단백 분해 활성, 용혈 활성, 운동성 및 포도당 대사)에 대한 일련의 유전자 특이 적 ( ctxB 및 tcpA ) PCR 기반 유전자 스크린과 표현형 분석을 기술하고있다. Proskauer assay)은 고전적 및 엘 토르 생물 유형을 특성화 및 / 또는 구별하기 위해 집합 적으로 사용되었습니다. 함께,이 assays는 대안으로, 또는 추가로, characteriza에 비용이 많이 드는, 노동 집약적 인 실험에 사용되는 효율적인 체계적인 접근 방식을 제공합니다V의 변화 . cholerae 임상 (및 환경) 균주.

박테리아 균주의 적절한 유지 관리 및 사용을 위해서는 관심있는 균주의 배가 시간을 알아 두는 것이 좋습니다. 여기서, 일반적으로 사용되는 V 의 변화하는 성장 속도. 콜레라 균주는 성장 곡선을 통해 입증되었고 근사 배가 시간은 선형 회귀를 사용하여 계산되었다. WT El Tor N16961 및 El Tor 변종 MQ1795는 WT 고전 O395 (~ 2 시간)보다 짧은 배증 시간 (각각 1 시간 및 ~ 1 시간)을 나타냈다 ( 그림 1 ; 표 2 ). V. cholerae의 유전자 조작 및 후속 분석은 종종 생물 형을 적절하게 구별하는 능력에 의존한다. PCR 기반의 유전자 스크린과 표현형 분석은 총체적으로 V 형...

이 원고는 일련의 생화학 분석법 외에도 적절한 Vibrio cholerae 유지 기술을 설명하며, 임상 적 및 환경 적 V 사이의 신속하고 안정적인 차별화를 위해 집합 적으로 활용됩니다. 실험실 환경에서 cholerae biotypes.

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

이 기술의 전반적인 목표는 수행하기 간단하며 어떤 연구자라도 특정 임상 또는 환경 유래 Vibrio cholerae 분리주를 특성화하는 데 도움이 될 수 있는 프로토콜 모음을 제공하는 것입니다. 이 방법은 특히 임상적 관련성이 있는 Vibrio cholerae 분리주의 구체적인 유전자형 및 표현형 특성과 같이 세균학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 이 분석법 모음을 사용하여 임상 또는 환경 Vibrio cholerae 분리주를 신뢰성 있게 특성화하고 구별할 수 있다는 점입니다.이러한 분석법들을 종합하면 비용이 많이 들고 노동 집약적인 실험이나 Vibrio cholerae 임상 및 환경 분리주의 특성 분석을 대체하거나 보완할 수 있는 체계적인 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 Vibrio cholerae 생형(biotypes)의 특성 분석에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 장내 세균의 생화학적 및 대사 능력을 분석하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 최적의 결과를 얻기 위해 필요한 배양 시간이 생화학 분석법마다 다르기 때문에 시간 관리에 어려움을 겪을 수 있습니다.스포팅(spotting) 및 스태빙(stabbing) 프로토콜의 시각적 시연은 매우 중요한데, 이는 비산물로 인해 교차 오염이 발생할 수 있으며 배양물 간의 병합을 방지하기 위해 최대 간격을 유지해야 하기 때문입니다. 멸균된 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 1.8 mL의 하룻밤 배양된 액체 배양물을 넣고, 최소 8,600 xG에서 2분간 원심분리하여 펠릿을 형성함으로써 프로토콜을 시작하십시오. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 피펫팅을 통해 세포 펠릿을 900 mcL의 신선한 Luria-Bertani 또는 LB 배지에 재현탁하십시오.다음으로, 멸균된 60% (v/v) 글리세롤 900 mcL를 배양액에 추가하고 볼텍싱하여 혼합합니다. 혼합물을 멸균된 2 mL 냉동 보관 튜브에 옮기고 스톡 배양액을 80 °C에서 보관합니다. 스톡을 사용하려면 멸균된 백금이를 사용하여 냉동된 스톡의 소량을 덜어내고, LB 한천 배지에 세균을 스트리킹하여 단일 콜로니를 얻습니다.배양물이 완전히 녹는 것을 방지하기 위해 사용 후 즉시 냉동 스톡을 -80°C로 되돌려 놓으십시오. 플레이트를 뒤집은 상태로 37°C에서 12-16시간 동안 배양하십시오. 미리 준비한 플레이트를 준비합니다.멸균된 루프로 단일 콜로니의 표면을 접촉하여 액체 배지로 옮김으로써, 멸균된 10 mL 배양 튜브에 담긴 4 mL의 액체 LB 배지에 단일 콜로니를 접종합니다. 그 후, 진탕 배양기에서 37 °C로 225 rpm의 속도로 12-16시간 동안 통기 배양합니다. 이렇게 하여 액체 LB 배지에서 하룻밤 배양액을 준비합니다.다음 날, 배양물을 원심분리하여 펠렛을 형성하고, 세포 펠렛을 1.8 mL의 1x phosphate-buffered saline 또는 PBS에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다. 세 번째 세척 후, 최종적으로 1.8 mL의 1x PBS에 재현탁합니다.그런 다음, 피펫 팁을 사용하여 세척된 배양액 1 mcL를 각각의 배지에 점적합니다. 하룻밤 동안 배양하여 얻은 세포 펠렛을 세척합니다. 세척된 액체 배양액에 접종침을 넣어 motility agar 플레이트에 수직으로 찔러 넣어 접종합니다.배지에 찌를 때 접종용 직선침이 휘어지지 않도록 주의하십시오. 매 접종 사이에 분젠 버너를 사용하여 직선침을 멸균하십시오. 플레이트를 뚜껑이 위로 향하게 하여 37 °C에서 14-24시간 동안 배양하십시오.14시간 후, 배양물의 과잉 성장을 방지하기 위해 운동성 플레이트를 면밀히 관찰하십시오. 이전에 준비한 하룻밤 배양액 10 mcL를 멸균 배양 튜브에 담긴 4 mL의 Methyl Red Voges-Proskauer 또는 MR-VP 배지에 피펫팅하여 접종하고, 셰이커 배양기에서 37 degrees Celsius로 12-16시간 동안 225 rpm으로 통기하며 배양하십시오. 다음으로, 멸균 배양 튜브에 분주된 1 mL의 MR-VP 하룻밤 배양액에 5%weight per volume Alpha-naphthol 150 mcL와 40%weight per volume 수산화칼륨 50 mcL를 각각 첨가하십시오.그 다음, 튜브를 짧게 볼텍싱합니다. 색 변화가 나타날 때까지 튜브를 상온에서 최대 4시간 동안 방치합니다. V.Cholerae 임상 및 환경 분리주의 바이오타입 배경을 구분하기 위해 PCR 기반 유전적 스크리닝과 표현형 분석에 바이오타입 표준 균주 및 대표적인 El Tor 변이주를 포함하였습니다.야생형 classical O395는 classical ctxB 및 tcpA 서열을 나타냈다. 반대로, 야생형 El Tor 균주 N16961 및 C6706은 El Tor ctxB 및 tcpA 서열을 나타냈다. MQ1795 및 BAA-2163은 O395와 유사한 classical 생체형 ctxB 하위 단위를 포함하고 있다.그러나 두 El Tor 변이주 모두 El Tor 생체형 배경을 나타내는 tcpA를 포함하고 있었습니다. polymyxin B가 첨가된 LB 한천 배지에서 배양했을 때, 야생형 classical 생체형 균주 0395는 polymyxin B에 민감성을 보인 반면, 야생형 El Tor 생체형 균주는 내성을 보였습니다. 대표적인 El Tor 변이 균주들 또한 이 항생제에 대해 유사한 내성을 나타냈습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 본 원고에 기술된 다중 분석 식별 시스템을 사용하여 Vibrio cholerae 생형(biotype)을 구별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. BSL-2 병원균을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 모든 재료와 폐기물의 적절한 취급 및 폐기는 기관, 지역, 주 및 연방 규정에 따라 엄격히 준수해야 함을 잊지 마십시오. 본 원고에 나열된 프로토콜 외에도, 생물막 형성 및 자동응집과 같은 다른 표현형 특성을 조사함으로써 Vibrio cholerae 분리주의 추가적인 특성 분석이 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

문화 미생물에 사용되는 미디어 및 시약과 함께 작업할 경우 무균 기술은 오염을 최소화하기 위해 실천해야합니다. 도금 방법의 다양한 정기적으로, 고립 전파, 또는 열거 세균 및 파지, 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함 모두의하는 데 사용됩니다.

무균 실험실 기술 : 도금 방법

TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em&gt; 장염 cholerae</em&gt; 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

출처: Yeung, M., et al. Vibrio parahaemolyticus 및 기타 Vibrio 종의 검출을 위한 보다 민감하고 특이적인 발색 한천 배지 개발. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 비브리오 종을 식별하기 위한 배양 기반 방법을 보여주며, 일반적으로 사용되는 티오황산염-구연산염-담즙염-자당 또는 TCBS 한천에 대한 보다 정확한 대안으로 발색성 한천을 강조합니다. 발색 한천은 종 특이적 효소 활성을 검출하여 비브리오 균주의 우수한 분화를 제공합니다.

비브리오 종의 신속한 검출을 위한 새로운 발색 배지

출처: Brumfield, K. D. 외, Vibrio 콜레라 의 생물형 유지 및 구별을 위한 임상 및 환경 분리 기법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 액체 배지에서 박테리아 배양물을 성장시키는 과정을 보여줍니다. 흔들림은 통기를 촉진하고 영양분을 고르게 분배하여 기하급수적 성장을 지원하고, 하류 적용에 적합한 균일하고 대사적으로 활발한 현탁물을 만듭니다.

액체 배지에서 순수 박테리아 배양 생성

출처: 브럼필드, K. D. 외 비브리오 콜레라의 생물형 유지 및 구별을 위한 임상 및 환경 분리주. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 트리페닐테트라졸륨 클로라이드를 이용한 부드러운 한천 분석법을 시연하며, 활발히 이동하는 세포 주변의 적색 구역 형성을 통한 대사 활동을 시각화하여 비브리오 콜레라 균주의 운동성을 평가하고 비교합니다.

트리페닐테트라졸륨 염화를 이용한 콜레라 균주 비교를 위한 운동성 분석

출처: Brumfield, K. D. 외, Vibrio 콜레라의 생물형 유지 및 구분을 위한 임상 및 환경 분리 실험실 기법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 콜 레라 균의 세 가지 생물형인 고전형, 야생형 엘 토르, 그리고 엘 토르 변종을 구별하기 위한 보게스-프로스카우어(VP) 검사를 시연합니다. 각 배양액은 포도당 함유 배지에 접종되어 배양 후 α-나프톨과 수산화칼륨으로 처리하여 아세톤 존재를 검출합니다. 분홍빛이 도는 붉은색은 양성 VP 반응을 나타내며, 야생형 엘 토르 생물형에서만 관찰되어 고전형과 변종형과 구별됩니다.

비브리오 콜레라 생물형 구별을 위한 보게스-프로스카우어 검사법

출처: Nag, D. 외 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 항생제 내성 콜레라균에 감염된 성체 제브라피시의 장내 세균 부하를 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 안락사 및 해부 후에는 장을 분리하고 유리 구슬로 균질화한 후 박테리아를 방출하기 위해 처리됩니다. 결과된 균질체는 선택적 배지에 플레이트되고, β-갈락토시다아제를 발현하는 파란색 콜로니를 세어 박테리아 부하를 추정합니다.

비브리오 콜레라에 감염된 제브라피시의 장내 세균 부하 정량화

일렉트로 변형으로 알려진 공정에서 박테리아로 DNA를 도입하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. electrocompetent 세포의 제조를위한 기존의 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 문서는 다른, 빠른, 그리고 현재 일부 실험실에서 사용 electrocompetent 세포의 준비를위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

임상적으로 관련된 Vibrio 종의 검출 및 분리에는 선택적이고 차등적인 배양 배지가 필요합니다. 이 연구는 V. parahaemolyticus 및 기타 관련 종을 감지하고 식별하는 새로운 발색 매체의 능력을 평가했습니다. 새로운 배지는 기존 배지보다 더 나은 민감도와 특이도를 갖는 것으로 밝혀졌습니다.

의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발<em&gt; 장염 비브리오 균</em&gt; 및 기타<em&gt; 비브리오</em&gt; 종

이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

학습하세요 Vibrio cholerae 임상 및 환경 분리물을 생화학 분석으로 특성화하는 방법을. 이 기술은 비용이 많이 드는 실험 없이도 신뢰할 수 있는 생물형 구별을 가능하게 합니다.

생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술

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