생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술 콜레라 비브리오 임상 적 및 환경 적 분리 물

이 기술의 전반적인 목표는 수행이 간편하고 연구자가 비브리오 콜레라의 주어진 임상적 또는 환경적 분리를 특성화하는 데 도움이 될 수 있는 프로토콜 모음을 제공하는 것입니다. 이 방법은 모든 Vibrio cholerae isolate의 특정 유전형 및 표현형 특성, 특히 임상적 관련성과 같은 세균학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 연구자가 이 분석 모음을 사용하여 임상 또는 환경적 Vibrio cholerae 분리물을 신뢰할 수 있게 특성화하고 구별할 수 있다는 것입니다.

많이 드는 노동 집약적인 실험 및 Vibrio cholerae 임상 및 환경 분리물의 특성화에 대한 대안 또는 추가로 사용할 수 있는 체계적인 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 비브리오 콜레라 생물형의 특성화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 장 세균의 생화학적 및 대사 능력을 특성화하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 최적의 결과를 보장하는 데 필요한 배양 시간이 생화학적 분석마다 다르기 때문에 시간 관리에 어려움을 겪을 것입니다.

스플래터는 종종 교차 오염으로 이어질 수 있고 배양 간의 병합을 방지하기 위해 최대한의 간격이 필요하기 때문에 스포팅 및 찌르기 프로토콜의 시각적 시연이 중요합니다. 멸균 2mL 마이크로 원심분리 튜브에서 최소 8, 600 xG의 원심분리로 1.8mL의 액체를 2분 동안 하룻밤 배양액을 펠릿화하는 것으로 프로토콜을 시작합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 피펫팅을 통해 900mcL의 신선한 Luria-Bertani 또는 LB 육수에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 900mcL의 멸균 60% 부피 대 부피 글리세롤을 배양액에 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합물을 멸균 2mL 극저온 튜브로 옮기고 스톡 배양액을 섭씨 80도에서 보관합니다. 스톡을 사용하려면 멸균 접종 루프와 함께 소량의 냉동 스톡을 제거하고 박테리아를 줄무늬로 만들어 LB 한천 플레이트에 단일 콜로니를 얻습니다.

배양물이 완전히 해동되는 것을 방지하기 위해 사용 후 냉동 스톡을 즉시 섭씨 80도로 되돌리십시오. 접시의 뚜껑 면이 아래를 향하도록 하여 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 배양합니다. 미리 준비한 접시를 구하십시오.

멸균된 10mL 배양 튜브에 액체 LB 육수 4mL를 멸균된 루프로 단일 콜로니의 표면을 접촉하고 콜로니를 액체 브로스로 옮겨 단일 콜로니를 접종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 225rpm의 셰이커 인큐베이터에서 폭기로 배양합니다. 액체 LB 육수에 하룻밤 배양을 준비합니다.

다음날, 배양액을 펠렛화하고 세포 펠렛을 1.8mL의 1x 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 다시 현탁시켜 세포를 세척합니다. 세탁 절차를 세 번 반복합니다. 세 번째 세척 후 1.8mL의 1x PBS에서 최종 재현탁

그런 다음 피펫 팁을 사용하여 각 배지에서 세척된 배양액 1mcL를 찾아냅니다. 하룻밤 배양에서 얻은 세포 펠렛을 세척합니다. 세척된 액체 배양액에 접종 찌르기를 삽입하여 운동성 한천 플레이트를 접종하고 배지에 수직으로 찌릅니다.

한천을 찌르는 동안 접종 찌르기가 구부러지지 않도록 하십시오. 각 접종 사이에 분젠 버너를 사용하여 와이어 찌르기를 소독하십시오. 플레이트 뚜껑 면이 위로 향하게 하여 섭씨 37도에서 14-24시간 동안 배양합니다.

14시간 후, 배양물의 과잉 증식을 방지하기 위해 운동성 플레이트를 면밀히 모니터링하십시오. 멸균 배양 튜브에 넣어 10mcL의 사전 배양 중량물을 4mL의 MR-VP 육물에 피펫팅하여 4mL의 메틸 레드 보지스-프로스카우어(Methyl Red Voges-Proskauer) 또는 MR-VP 육수를 접종하고 225rpm의 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 폭기로 배양합니다. 다음으로, 알파-나프톨 부피당 5중량 150mcL와 수산화칼륨 부피당 40중량 50mcL를 멸균 배양 튜브에서 MR-VP 야간 배양 1mL 분취액에 각각 첨가합니다.

그런 다음 튜브를 잠시 와류로 만듭니다. 색 변화가 발생할 때까지 튜브를 최대 4시간 동안 실온에 두십시오. V.Cholerae 임상 및 환경 분리물의 생물형 배경을 구별하기 위해 PCR 기반 유전자 스크리닝 및 표현형 분석에 생물형 참조 균주 및 대표적인 El Tor 변이체를 포함시켰습니다.

야생형 클래식 O395는 클래식 ctxB 및 tcpA 시퀀스를 보여주었습니다. 반대로, 야생형 El Tor 균주 N16961 및 C6706은 El Tor ctxB 및 tcpA 서열을 시연했습니다. MQ1795 및 BAA-2163에는 0395에 필적하는 고전적인 생체 유형 ctxB 서브유닛이 포함되어 있습니다.

그러나 두 El Tor 변종 모두 El Tor 생물형 배경을 나타내는 tcpA를 포함하고 있습니다. 폴리믹신 B가 보충된 LB 한천 플레이트에서 성장했을 때, 야생형 클래식 바이오타입 균주 0395는 폴리믹신 B에 대한 민감성을 보인 반면 야생형 El Tor 바이오타입 균주는 내성을 보였습니다. 대표적인 El Tor 변종 균주는 항생제에 대해 유사한 내성을 보였습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 이 원고에 설명된 다중 분석 식별 시스템을 사용하여 Vibrio cholerae 생물형을 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BSL-2 병원체에 대한 작업은 매우 위험할 수 있으며 모든 재료 및 폐기물의 적절한 취급 및 처리는 기관, 지역, 주 및 연방 규정에 따라 시행되어야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 원고에 나열된 프로토콜 외에도 Vibrio cholerae isolates의 추가 특성화는 생물막 형성 및 자가응집과 같은 다른 표현형 특성을 조사하여 달성할 수 있습니다.