Name: 원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 상향변환 나노입자를 이용한 근적외선 광활성화로 세포 내 단백질 키나아제 A를 활성화하는 방법입니다. 이 기술은 광독성 없이 신호전달 경로를 연구하여 암 발생 메커니즘 이해에 기여합니다.

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우리는 자금 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2)에 대 한 나노 과학 및 기술 프로그램의 학계 Sinica 사역의 과학 및 기술의 대만 감사합니다.

참고: 프로토콜 업 기반 photoactivation에 대 한 자세한 계측 수정, 생성 하는 합성 절차 갇힌 PKA-UCNP, 실리 카 코팅 UCNP의 전송 전자 현미경 (TEM) 그리고 갇힌 PKA UCNP 샘플, 자외선과 NIR photolysis 설치, 셀 준비, PKA-UCNP microinjection, photoactivation 연구 및 REF52 세포의 스트레스 섬유 얼룩.
 1. 업 스펙트럼 측정을 위한 Fluorimeter 설치 <ol><li>레이저는 베트의 중간에 초점을 맞추고 형광 분석기의 베트 홀더 옆 4 X 객관적 렌즈 설치.</li>
	<li>가변 0.5-8 W 980 nm 레이저 다이오드는 렌즈에 대 한 90 ° 장소. 
	주의: 연산자 레이저 안전 지식을 하 고 NIR 레이저 고글을 착용 해야.</li>
	<li>렌즈와 레이저의 빛 경로 교차점에 전체 반사율 거울을 설치합니다. 검은 anodized 금속 접시 분광학의 여기 창 차단 하 고 내부 부품을 보호 하기 위해 배치.</li>
	<li>실리 카 코팅 UCNP 솔루션 (0.2-0.6 mg/mL)의 멧을 베트 홀더 에서도 밝은 업 컨버전 빔 구상 될 수 있다 고 거울 설치에 대 한 최고의 빛 정렬을 조정 하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>최저 PMT 전압 설정으로 발광 모드는 분광학 전환 (신호가 너무 약한 경우 더 높은 설정을 조정). 멧의 중간에 광속은 고는 PMT 강한 신호를 선택 최고의 맞춤 미러 조정.</li>
	<li>맞춤 원하는 전원 설정 후 업 스펙트럼을 측정합니다. 열 더미 전력 측정기를 사용 하 여 레이저 전력 공급에 전기 현재 독서에 대 한 레이저 파워의 보정 곡선을 건설. 끊임없이 성능 보정된 범위 안에 있는지 확인 하기 레이저 성능 확인.</li>
</ol> 2. 현미경 설치 참고: 다음 설치 현미경 2 계층 광학 경로 갖춘 작품. 사용자가 다시 포트 적외선 레이저와 같은 포트를 공유 하는 할로겐 램프를 여기 광원 스위치를 설치 하고자 하는 경우 샘플 난방을 감소 하도록 설계 되었습니다 때문에 다시 포트에 겨냥 틀에는 NIR 차단 크게 됩니다. 사용자는 어려운 선택을 해야 합니다:는 겨냥 틀을 계속 매우 낮은 업 효율성에서 고통 또는 제거는 겨냥 틀 하 고 여기는 epifluorescence에 대 한 빛의 강도 희생.
 참고: 수정 된 spectrofluorometer, 업 발광 및 NIR photolysis 모드와 epifluorescence 및 UV photolysis 모드, 그리고 실험 설정에 대 한 현미경 검사 법에 대 한 가벼운 경로 체계를 보여주는 장면 전환 다이어그램 이 실험을 위해 사용 하는 그림 2에 나와 있습니다.
<li>장비 금속 할로겐 빛과 형광 현미경 <ol>가이드, 뒤에 지시 포트 
	참고:이 상위 계층 빛 경로에서 큐브 포 탑은, 하나의 큐브 위치 NIR 낮은 계층 빛 경로에서 오는 수 있도록 비어 있어야</li>
	<li>오른쪽 포트를 오픈 사이드 포트 겨냥 틀에 가변 0.5 8.0 W 980 nm 레이저 다이오드 설치. 
	참고:이 10 X 객관적 렌즈 사용 하는 경우는 레이저 빛 자리 약 500 µ m 직경에서 확대 합니다. 이 겨냥 틀 제거 마이크로미터 범위 빛 자리에 결과 그리고 NIR 셀 방사선을 허무 하 게. 이 겨냥 틀은 NIR-투명.</li>
	<li>Dichroic 거울 (850 nm 짧은 패스)와 하위 계층 빛 경로에 여기 필터 (950 nm 긴 패스) 설치</li>
	<li>는 UCNP 솔루션을 사용 하 여 시각화 NIR 빛 자리. 가운데 맞춤을 완료 시야에서 NIR 광선에 레이저의 위치를 조정.</li>
</ol> 3. 준비 및 특성화의 갇힌 PKA UCNP 구성 <ol><li>품 재조합 PKA (9 µ M)에 1-2 h 25에 대 한 버퍼 (20 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 그리고 10 mM MgCl 2, pH 8.5)를 고른다면 2-nitrobenzylbromide (NBB) 0.5 m m와 ° C. 끄다 10 m m dthiothreitol (DTT)와 초과 NBB 다음에 대 한 4-(2-hydroxyethyl) dialyze 고 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) 버퍼 (10 m m, pH 7.5) 초과 시 약 및 염 분 제거. 
	참고: 배우면 솔루션의 pH는 인하 8.5에서 7.5 HEPES ph 7.5 후속 동원 정지 반응에 대 한 투 석 중.</li>
	<li>믹스 란타넘족 소금-Y(CH3CO2) 3 수화물 (99.9%, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (채널 3 CO 2) 3 수화물 (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol)과 Tm (채널 3 CO 2) 3 수화물 (99.9%, 0.0168 g, 0.02 m m o l)-octadecene (30 mL), 올레산 (12 mL)에서 30 분 동안 115 ° C에 혼합물을가 열 하 고 50 ° c.에 멋진 다음, NaOH 펠 릿의 0.2 g (5.0 m m o l)와 methanolic 솔루션 (20 mL)에 반응 혼합물을 녹이 고 0.2964 g (8 mmol) 쥡니다 15 분 대에 의해 염화 불 화물의 증가 (β-NaYF 4 UCNP 코어를 300 ° C에 반응 온도 : 1.0 %Tm 3 + / 30 %Yb 3 +) 나노.</li>
	<li>는 코어 나노 입자 (25mg) 공동-520 (0.5 mL)와 cyclohexane (10 mL)에 녹. 암모니아 (wt 30 %v / v, 0.08 mL)와 tetraethylorthosilicate (TEOS, 0.04 mL)을 추가 하 고 적용 하는 실리 카 코팅 β-NaYF 4를 실 온에서 12 h에 대 한 지속적인 교 반: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + 코어 nanoparticles.</li>
	<li>는 PKA를 품 어 (6 nmol) 또는 갇힌 PKA (6 nmol) HEPES buffer (10 m m, pH 7.5) 3 h 정전기 상호 작용을 통해 UCNP 실리 카 코팅에 PKA 무력화를 위한 4 ° C에서에서 UCNP (1 mg) 15.</li>
	<li>는 PVDF 필터 (0.45 μ m), 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심 분리기를 사용 하 여 혼합물을 필터 및 정화 PKA UCNP 복잡 한을 얻으려면 HEPES (50 µ L, 10 m m, pH 7.5) 포함 0.1% 단백질 안정제에 펠 릿을 redisperse. 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심과 1.5 mL 튜브에 Bradford 분석 실험에 대 한 상쾌한 수집.</li>
	<li>분석 UCNP 입자에 PKA 대체 수준을 다시 계산을 상쾌한 단계 3.5 Bradford 분석 실험에서에서 저장에 무제한 PKA는 일반적으로의 대체 수준을 ~ 입자의 밀리 그램 당 PKA의 4.5 nmol. 
	참고: Bradford 분석 실험 밝혀 탈 착 없이 높은 수준과 안정적인 단백질의 동원 정지를 건의 하는 펠 릿에는 강한 파란 색깔의 표면에 뜨는 분수 갇힌 PKA UCNP 솔루션 보여준다 색상 HEPES 버퍼 (비슷한 그림 4 c-4e).</li>
</ol> 4. 특성화 참고: 니 분석 결과 특정 pyruvate 키 니 아 제 활동을 계량 하는 데 사용 됩니다. 간단히, pyruvate 키 니 아 제 및 젖 산 효소를 결합 하 여 펩 티 드의 인 산화에서 NADH의 산화 결과. 후자의 형성은 340 NADH의 흡 광도 감소를 측정 하 여 모니터링 nm.
<li>결정 4 morpholinepropanesulfonic 산 (MOPS, 100 m m, pH 7.5)를 포함 하는 분석 결과 혼합물의 60 µ L 전체 볼륨에서 PKA와 PKA UCNP의 활동 <ol>KCl (100mm), phosphoenolpyruvate (흠, 1 m m), 아데노신 3 인산 염 (ATP, 1 m m), β- 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 형태 (NADH, 0.8 m m), 염화 마그네슘 (MgCl 2, 1 m m), kemptide (0.4 m m), 그리고 pyruvate 키 니 아 제/젖 산 효소 혼합물 (PK/LDH의 30/40 대) 감소.</li>
	<li>는 PKA 솔루션 (2 µ L) 분석 결과 혼합물을의 추가 후 시간이 지남에 NADH의 흡 광도 감소를 측정합니다. 직접 측정 되 고 키의 동작을 반영 하는 선의 기울기 계산.</li>
	<li>PKA UCNP 15의 활동 및 네이티브 PKA 특정 활동 및 계산 PKA 표면 코팅의 곱셈 제품와 잘 일치 한다 전반적인 활동 측정.</li>
</ol> 5. Photolysis 설치 <ol><li>Measure는 빛의 모든 힘 열 더미의 센서를 사용 하 여 및 전력량 계산 (PD = 전력 (W) / 지역 (cm 2)) 18 빛 반점 지역에 따라.</li>
	<li>Photolysis 실험에서 체 외에 UV 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15 상업 시스템에 수행.</li>
	<li>현미경 스테이지에 대 한 UV photoactivation 조명 상업 큐브 15 필터링 여기 빛 PKA UCNP 솔루션. 
	참고: 전원 밀도 ~ 15 mW/cm 2, 렌즈 초점 없이.</li>
	<li>생체 외에서 NIR photoactivation 현미경 무대에,에 대 한 조명 아래 계층 빛 경로, dichroic 거울 (850 nm 짧은 패스)에 설치 사용자 지정된 업 컨버전 필터/미러 설정으로 980 nm 레이저를 사용 하 여 PKA UCNP 솔루션 및 여기 필터 (950 nm 긴 패스). 
	참고: 출력 전력 밀도 4 X 렌즈 초점 전에 5 W/c m 2입니다. 전력 밀도 추정 됩니다 ~ 4 렌즈 초점 X 후 68 W/c m 2.</li>
</ol> 6. 샘플 준비 및 Microinjection의 PKA UCNP 단지 셀 <ol><li>0.45 μ m 필터를 통해 PKA 동원 정지 (3.5 단계) 후 샘플을 미리 필터링.</li>
	<li>품 어 L-15 매체를 포함 하는 인큐베이터에 밖에 서 안정적인 pH 컨트롤에 대 한 microinjection 기간 동안 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 셀. 
	참고: microinjection 완료 확인, 공동 투입 네이티브 PKA-UCNP, UCNP-갇힌된 PKA, 또는 PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)와 (10 µ M)에 셀.</li>
	<li>조정 PKA UCNP 입자의 농도, microinjection, 후 cytosolic 농도 1-3 μ M PKA-PKA 셀, 가정 주사 볼륨 세포 볼륨의 1/10에에서 대 한 생리 적인 농도 범위 .</li>
	<li>셀 (6.2 단계)로 microinjection를 수행 1 축 유압 micromanipulator ( 그림 3)와 결합 하는 microinjector 장치를 사용 하 여.</li>
	<li>사용 디지털 압력 게이지는 microinjector에 의해 적용 압력을 모니터링 하는 동작 범위 (~ 50-200 hPa) microinjection에 대 한 보상 압력을 제공 하기 위해 사용자 지정 된 압박 챔버에 분배기 밸브를 봉인. 철수는 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘.</li>
	<li>50 및 75 hPa, 200-300 ms와 모 세관 작용에 의해 바늘으로 문화 매체 역류를 방지 하기 위해 15 hPa에서 보상 압력 주입 시간 사이 사출 압력 유지.</li>
	<li>있도록 그들은 40 x 객관적 렌즈를 사용 하 여 이미지를 복용 하 여 확인 될 수 있는 1.3 및 1.5 µ m, 외부 직경 바늘의 팁 채용 검사.</li>
	<li>L-15 매체 포함 하는 10%의 2 mL로 세포 세척에서 microinjection 후 FBS. 5 (6)-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA) microinjection 완료 확인에서 세포 형광 이미징 관찰.</li>
</ol> 7. Photoactivation의 갇힌 PKA UCNP를 사용 하 여 UV 또는 생활 세포에서 NIR 빛 PKA UCNP microinjection 후 <ol><li>UV에 대 한 photoactivation 3.5 µ m 접시 REF52 셀 성장 하 고 현미경 스테이지에 배치 하 고, 자외선에 의해 필터링과 그들을 비추는 렌즈 초점 없이 3 분에 대 한 큐브. 
	참고: 셀에 10% 포함 된 DMEM 유지 되었다 REF52 5% CO 2 배양 기 및 셀에서 37 ° C에서 FBS 했다 subcultured는 confluency에 도달 하면 90%를 2-3 일 마다.</li>
	<li>PKA UCNP microinjection 후에 NIR photoactivation 조명 낮은 계층 필터/미러 설정에서 980 nm 레이저에 셀 5.4 단계에서 설명한 대로. 
	참고: 출력 밀도 5 W/c m 2 렌즈 초점 X 10 전에 이며 렌즈 초점 x 10 후 300 W/c m 2을 것으로 추정 된다. 업은 anti-Stoke 교대 큰 필요한 경우에 특히 높은 광자 밀도 요구 하는 프로세스입니다. 따라서, photoactivation 동안 필요한 초점.</li>
	<li>큰 백색 반점 (650 µ m x 520 µ m) 필요한 경우, NIR을 난방을 피하기 위해 모든 5 분 방사선 조사 후 5 분 어두운 간격 15 분 허용에 대 한 겨냥 틀을 10 배 대물 렌즈에 의해 집중 된 이러한 셀을 비추는. 
	참고: 때 높은 공간 해상도 (subcellular 백색 반점) 필요, 라이트 가이드의 출구 끝에 설치 된 작은 구멍으로 40 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 subcellular 차원 빛 자리 (5 µ m x 4 µ m)를 생성 합니다. 이 경우, 1 s 방사선의 NIR photoactivation 광자의 높은 유출 때문에 충분 하다.</li>
	<li>후 자외선 또는 적외선 photolysis는 5% CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 세포 응답을 생성 하는 완전 한 매체에 대 한 복구를 셀 수 있습니다. 그 후, 4 %paraformaldehyde / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 20 분의 1 mL에 추가 얼룩이 지기 전에 수정. 
	주의: Paraformaldehyde은 매우 독성; 피부, 눈, 또는 점 막과의 접촉을 피하십시오. 측정 하 고 준비 하는 동안 분말을 호흡 하지 마십시오.</li>
</ol> 8. 스트레스 섬유 해체 기인 NIR Photoactivation의 시각화 <ol><li>고정, 후 알 렉 사 594-phalloidin 사용 (얼룩에 대 한 PBS의 200 µ L를 6.6 µ M 재고 솔루션의 5 µ L를 추가, 실내 온도에 25 분 동안 품 어) 얼룩과 스트레스 섬유를 시각화 합니다. 필터 집합을 사용 하 여 알 렉 사 594-phalloidin (전 581 nm/Em 609 nm)의 이미지를 시각화.</li>
	<li>4에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 실내 온도에. 얼룩, 후 PBS로 샘플을 세척 하 고 스트레스 섬유와 핵의 형광 이미지를 별도로 받아.</li>
</ol>

<ol><li>Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Controlled+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Light-Controlled Tools.</a> Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).</li>
<li>Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Chemistry+of+Life%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Applications+of+%22Caged%22+and+Related+Photoresponsive+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds.</a> ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).</li>
<li>Pavlovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+and+Photochemical+Release+of+a+Caged+Inositol-pyrophosphate+Induces+PH-domain+Translocation+in+Cellulo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo.</a> Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).</li>
<li>Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Wavelength+Photoactivation+of+cAMP-+and+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways.</a> ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).</li>
<li>Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+One-+and+Two-Photon+Uncaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA.</a> ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).</li>
<li>Warther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Uncaging%3A+New+Prospects+in+Neuroscience+and+Cellular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology.</a> Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).</li>
<li>Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+Confocal+and+Caging+Technologies%3A+Selective+Three-Color+Communication+with+Profluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters.</a> Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).</li>
<li>Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-selective+cleavage+of+photoprotecting+groups%3A+strategies+and+applications+in+dynamic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems.</a> Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).</li>
<li>Chien, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light+Photocontrolled+Targeting%2C+Bioimaging%2C+and+Chemotherapy+with+Caged+Upconversion+Nanoparticles+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).</li>
<li>Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light-Mediated+Photoactivation+of+a+Platinum+Antitumor+Prodrug+and+Simultaneous+Cellular+Apoptosis+Imaging+by+Upconversion-Luminescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).</li>
<li>Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR+Light+Controlled+Photorelease+of+siRNA+and+Its+Targeted+Intracellular+Delivery+Based+on+Upconversion+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).</li>
<li>Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+UV-Blocking+Polymer+Shell+Prevents+One-Photon+Photoreactions+while+Allowing+Multi-Photon+Processes+in+Encapsulated+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).</li>
<li>Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+Construction+of+Hollow+Upconversion+Nanoparticles+for+Protein+Harvesting+and+Near-Infrared+Light+Triggered+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release.</a> Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).</li>
<li>Gao, H. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Near-Infrared-Activatable+Enzyme+Platform+To+Remotely+Trigger+Intracellular+Signal+Transduction+Using+an+Upconversion+Nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle.</a> ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).</li>
<li>Wehbi, V. L., Taskén, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+for+cAMP-Mediated+Immunoregulation+in+T+cells+-+Role+of+Anchored+Protein+Kinase+A+Signaling+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Fluorescence+Approaches+Shed+Light+on+Intracellular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs.</a> Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).</li>
<li>Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep22433">Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect.</a> Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).</li>
<li>Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0014579388807816">Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells.</a> FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).</li>
<li>Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).</li>
<li>Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote-control+Photorelease+of+Caged+Compounds+Using+Near-infrared+Light+and+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).</li>
<li>Garcia, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR-triggered+Release+of+Caged+Nitric+Oxide+Using+Upconverting+Nanostructured+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials.</a> Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).</li>
<li>Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NIR-responsive+and+sugar-targeted+polypeptide+composite+nanomedicine+for+intracellular+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy.</a> Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).</li>
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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전에 호프만 및 동료 발견 극적인 형태 변화 무료 PKA19의 microinjection 후 REF52 세포에서 관찰 되었다. 또 다른 연구에서는 로렌스 그룹 갇힌된 PKA 형태학 변화 및 스트레스 섬유 때 UV photolysis20의 해체를 활성화 vivo에서, 될 수 있는 시연 했다. 이전 이용 upconverted 자외선은 photoactivation 여러 UCNP 지원, 감 금, 작은 분자 bioeffectors21,,2223의 활성화를 보여 보고 합니다. 그러나, bioeffector, 효소의 가장 중요 한 클래스에 UCNP 기반 photoactivation를 사용 하는 프로토콜은 아직도 개발 될 필요가 있다. 따라서, 본이 연구에서는 우리 UCNPs...

Photoactivated (예를 들면, PKA 갇힌 단백질)을 될 수 있는 화학적 수정된 단백질 화학 생물학 세포 생화학 프로세스1,2 비 접촉 조작 하는 신흥 분야로 개발 되었습니다. 3. 이 활성화할 때 우수한 spatiotemporal 해상도 제공 하는 자극으로 빛을 사용 하 여 단백질 갇힌. 그러나, UV 빛 원치 않는 형태학, apoptosis, 변화와 셀4,5에 DNA 손상을 일으킬 수 있습니다. 따라서, photocaging 그룹의 최근 개발 디자인에 phototoxicity, 또한 깊은 조직 침투6,7증가로 줄이기 위해 긴 파장 또는 2 광자 여기 시 photocleavage를 사용에 초점을. 배우면 그룹 있도록 적당 한 uncaging 파장 (즉, 채널)을 선택 하는 것을 선택적으로 더 긴 파장에 반응 활성화 bioeffectors 두 개 또는 더 배우면 그룹은 현재7. 이러한 유용한 기능을 감안할 때, 새로운 레드 라이트 photocaging 그룹 개발8세포 활동 제어 하는 반응의 메커니즘을 탐색에서 배열 하는 생물학 학문을 위한 광화학 방법론에서 매우 중요 한 상류 작업 이다. 그럼에도 불구 하 고, 2 광자 배우면 그룹 일반적으로 너무 소수 융합된 향기로운 반지 구조 때문 이며 가시광선 배우면 그룹은 일반적으로 유기, 향기로운 ligands. 이 소수 성/향기로운 속성은 bioeffector은 단백질 또는 효소, 효소/단백질의 활성화 사이트를 변성 하 고 활용 및 photolysis2 화학 수준에 아직도 작동 하는 경우에 함수의 손실이 발생 하는 경우 적합 하지 않습니다. ,9.
UCNPs는 UV에 적외선 여기 빛을 변환 하는 효율적인 트랜스듀서. 과제를 해결 하기 위해 현실적인 해상도 photoactivation와 관련 된 및 작은 분자, 엽 산10를 포함 하 여 cisplatin 파생 상품11의 제어 릴리스 트리거 UCNPs의이 독특하고 매혹적인 속성 제공 , DNA/siRNA12, 공중 합체의 소포13, 그리고 빈 입자14. 그러나, 우리의 지식의 최선을, 효소 또는 단백질의 UCNP를 이용한 photoactivation는 테스트 되지 지금까지. 사용 하 여 붉은 빛 또는 적외선 광 효소의 성공적인 경우 있기 때문에, 우리는 실리 카 코팅와 화학적 수정된 갇힌된 효소 복합물의 구성 하는 단백질/효소 구조의 NIR 트리거 활성화를 수행 하 라는 메시지가 표시 했다 란타넘족 실수로 UCNP15. 이 연구는 UCNP 갇힌된 PKA의 형태로 빠르게 반응 신호 변환 키로 활용 했다. PKA는 glycogen 합성 cytosol16순환 아데노신 인산 염 (야영지) 규제를 통해 외부 자극에 응답 하는 cytoskeletal 규칙을 제어 합니다. 우리는 적외선 방사선 조사 후 세포 실험에서 시간적, 공간적 매너에서 효소 활성화의 가능성을 공부 했습니다. 이 UCNP 기반 photoactivation 플랫폼 photoactivate에 새로운 방법론 NIR를 사용 하 여 효소 이며 기존의 UV 방사선 조사2,4로 인 한 세포에서 원하지 않는 신호 변환 응답을 피 한다.
그것은 매우 어려운 큰 bioeffectors를 이동 (예를 들어, 단백질) 세포 활동을 제어 하는 세포 막에 걸쳐. 단백질 입자 움직일 수 있지만 쉽게 하는 cytosol로 endocytosis를 통해 이동, endocytosis 손상 또는 endosomal 함정 및 필연적인 lysosomal 저하2,4통해 저하 수 있습니다. 갇힌된 단백질은 막 전 후 여전히 기능, 경우에 translocated 금액 세포질 응답2,17를 일으킬 정도로 되지 않을 수 있습니다. 예리한 대조에서는, microinjection 세포의 세포질에 큰 bioeffectors를 제공 하는 직접적이 고 양적 접근 이다. 또한, UCNP 움직일 bioeffector upconverted 빛을 활성화 해야 합니다. 따라서, 광학 계측 해야 추가 측정, 시각화, 업 라이트를 활용 하는 수정을 합니다. 이 작품에서는, NIR photoactivation에 대 한 microinjection 및 다음 필수 분광학과 현미경 수정을 사용 하 여 셀에 갇힌된 PKA UCNP 복합물의 배달 자세히 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td><강한>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>시그마</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>이트륨 아세테이트&nbsp; 수화물</td><td>: 시그마</td><td>326046</td><td>Y (C2H 3 CO< >2) 3 &middot; xH 2 O</td></tr><tr><td>툴륨 (III) 아세테이트 수화물</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH3CO2)3</ 서브 > &미드 도트; xH2O</td></tr><tr><td>이테르븀(III) 아세테이트 테트라하이드레이트</td><td>시그마</td><td>326011</td><td>Yb(C2H3O2)3 &middot; 4H2O</td></tr><tr><td>1-Octadecene</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>올레산</td><td>시그마</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>마크론</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 플루오라이드</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp; CO-520</td><td>시그마</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥산</td><td>J.T.베이커</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄(28% - 30%)</td><td>J.T.베이커</td><td>972101</td><td>암모니아</td></tr><tr><td>테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)</td><td>시그마</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시말레이미드(NHM)</td><td>시그마</td><td>226351</td><td>PKA 활성 차단 시약</td></tr><tr><td>돼지 콜라겐의 Prionex 단백질 안정제 용액</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>단백질 안정제 용액</td></tr><tr><td>2-니트로벤질 브로마이드(NBB)</td><td>시그마</td><td>107794</td><td>PKA 케이지 시약</td></tr><tr><td>8-(4-클로로페닐티오)아데노신 3&prime;,5&prime;-cyclic monophosphate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소 토끼 근육에서 추출한 효소</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-triphosphate disodium</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td></td></tr> <tr><td>ATP&beta;-NADH from 디칼륨</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvate</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Bradford 분석 시약</td></tr><tr><td>cAMP-dependent protein kinase</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>PKA activity control</td></tr><tr><td>pET15b-PKACAT plasmid</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>pKaede-MC1 plasmid</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Cell 배양 매체</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-115-1A</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>생물학 산업</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>핵 염색 염료</td></tr><tr><td>Alexa 594-phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-actin 염색 염료</td></tr><tr><td>5(6)-Carboxytetramethylrhodamine&nbsp;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie(Bradford) 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 튜빙/공칭 필터 등급 MWCO 12,000 - 14,000 Da</td><td>멤브레인 여과 제품, Inc.</td><td>1430-33</td><td>투석 멤브레인</td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45 &마이크로; m, PVDF, 13mm, 감마 멸균</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>형광 분광 광도계</td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>캐리 이클립스&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&nbsp;</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm 롱패스 필터&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm 이색성 거울 단역 통과</td><td>크로마</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 컬러 CCD 시스템</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>형광 조명</td><td>PRIOR</td><td>루멘 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm 적외선 다이오드 레이저</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED 스포트 광원</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>200 mW/cm에서 UPH-056-365 nm LED가 있는 2</td></tr><tr><td>열 파일 센서</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>세포 내 미세주입 디스펜스 시스템</td></tr><tr><td>PC-10 니들 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>마노미터 디지털 압력계</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>단축 기름 유압 Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 분리기, 냉장</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

업 나노 (UCNP)-중재 photoactivation 원격 제어 bioeffectors 훨씬 적은 phototoxicity와 깊은 조직 침투 하는 새로운 접근입니다. 그러나, 시장에 기존 계측 쉽게 업 응용 프로그램과 호환 되지 않습니다. 따라서, 상업적으로 이용 가능한 악기 수정이 연구에 대 한 필수적입니다. 이 논문에서는, 우리가 먼저 기존의 fluorimeter와 광자 업 실험에 대 한 호환 수 있도록 형광 현미경의 수정을 보여 줍니다. 다음 우리는 근처-적외선 (NIR)의 합성을 설명-갇힌된 단백질 키 니 아 제 A 촉매 소 단위 (PKA) UCNP 복합물에 움직일 트리거. Microinjection 및 NIR photoactivation 절차에 대 한 매개 변수는 또한 보고 했다. 갇힌된 PKA UCNP REF52 fibroblast 세포에 microinjected는, 후는 기존의 UV 방사선에 상당히 우수한, NIR 방사선 살아있는 세포에서 PKA 신호 변환 통로를 효율적으로 트리거합니다. 또한, 긍정적이 고 부정적인 제어 실험 스트레스 섬유의 해체에 지도 하는 PKA 유도 통로 적외선 조사에 의해 트리거됩니다 구체적으로 확인 합니다. 따라서, 단백질 수정 UCNP 사용 하 여 빛 변조 세포 실험, 자외선에 직접 노출 피해 야 한다를 원격으로 제어 하는 혁신적인 접근 방식을 제공 합니다.

갇힌된 효소 UCNP 구조물의 디자인은 그림 1에 나와 있습니다. PKA 효소는 먼저 비활성 갇힌된 PKA를 생성 하기 위해 2-nitrobenzyl 브 로마 이드와 반응 하 고 UCNP의 표면에 정전 움직일 다음 이었다. UCNPs는 upconverted 빛을 방출 하 고 결과적으로 photolytically o nitrobenzyl 그룹 199 Cys Cys 343, 활성화 된 PKA를 생성에 쪼개 다. 가장 이미지와 Bradford 분석 실험 확인 PKA와 갇힌된 PKA UCNPs의 표면에 움직일 수 있었다 고 갇힌된 PKA UCNP 솔루션 후 UV photoactivation의 키 니 아 제 활동 분석 (그림 4). PKA immobilization, 후 동적 산란 악기 크기와 제타 잠재력 PKA 입자 복합체의 120을 공개 및-16.0 mV, 각각. PKA...

이 프로토콜에 갇힌된 단백질 키 니 아 제 A (PKA), 셀룰러 신호 변환 bioeffector 나노 입자 표면에 움직일, cytosol에 microinjected 이었고 upconverted 근처-적외선 (NIR) 방사선에서 자외선에 의해 활성화 유도 다운스트림 스트레스는 cytosol에서 섬유 분해.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

본 실험의 목적은 근적외선 조사를 이용하여 효소를 광활성화하는 방법의 타당성을 입증하는 것입니다. 케이지형 단백질 인산화효소 A(Caged-protein kinase A)를 세포 내로 미세 주입된 업컨버전 나노입자의 표면에 고정시키고, 근적외선 조사 후 살아있는 세포에서 인산화효소로 인해 유도된 반응을 관찰합니다. 전통적인 광활성화 방식은 광독성이 있는 UV 광선을 필요로 하며, 이는 불가피하게 원치 않는 화학 반응과 유사한 반응을 동시에 유도합니다. 반면, 본 연구에서 제시하는 근적외선 조사와 같은 친화적인 옵션은 에너지가 낮기 때문에 이러한 반응을 일으키지 않습니다.업컨버전 나노입자는 생체 친화적인 저에너지 근적외선(near IR) 광자를 고에너지 자외선(UV) 광자로 효율적으로 업컨버전하여, 직접적인 자외선 조사 없이도 입자 표면 근처에서 화학 반응을 유도할 수 있습니다. 키나아제(Kinase)는 종양 발생에서 핵심적인 역할을 하며, 이 기술을 이용하면 자외선 광독성 및 그 부반응으로 인한 간섭 노이즈를 훨씬 줄이면서 더 많은 신호 전달 정보를 조사할 수 있습니다. 일반적으로 이 분야에 처음 입문하는 연구자들은 업컨버전 응용을 위한 장비 개조 및 광학 설정 단계에서 어려움을 겪게 됩니다.먼저, 레이저가 큐벳 중앙에 초점을 맞출 수 있도록 형광 분광계의 큐벳 홀더 옆에 4x 대물렌즈를 설치하십시오. 대물렌즈와 90도 각도가 되도록 가변 980 nanometer 레이저 다이오드를 배치하십시오. 대물렌즈와 레이저의 광경로 교차 지점에 전반사 거울을 설치하십시오.내부 부품을 보호하기 위해 분광계의 여기 창(excitation window)을 차단하는 양극 산화 금속판을 배치하는 것을 잊지 마십시오. 그런 다음 실리카 코팅된 상향변환 나노입자 용액이 담긴 큐벳을 홀더에 넣으십시오. 레이저가 켜지면 밝은 상향변환 빔을 확인할 수 있습니다.분광기를 루미네선스 모드로 전환하고, 정렬하는 동안 PMT 전압을 가장 낮게 설정하십시오. PMT가 가장 강한 신호를 감지할 수 있도록 빔이 큐벳의 중앙을 통과하게끔 미러와 레이저 스테이지를 조정하십시오. 다이크로익 미러와 여기 필터를 장착한 후, 하단 층 광로에 980 nanometer 레이저 다이오드를 설치하십시오.레이저와 거울 사이에 콜리메이터를 추가하여 초점 평면에서 NIR 조사 영역을 확산시키고 확대합니다. 그 후, 업컨버전 나노입자 용액을 사용하여 근적외선 빔을 시각화합니다. 레이저 스테이지의 위치를 조정하여 근적외선 광빔을 중앙에 맞추면 정렬이 완료됩니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 caged-PKA 합성을 수행하고 caged-PKA/UCNP를 고정하여 caged-PKA/UCNP를 생성합니다. UV 광분해 전 두 구조체의 활성을 측정하려면, 분석 혼합물에 2 µL의 PKA 용액을 첨가한 후 시간에 따른 분석 혼합물 내 NADH 흡광도의 감소를 측정합니다. PKA/UCNP에 대해서도 동일한 측정을 반복합니다.다음으로, PKA가 활성화될 수 있는지 확인하기 위해 얼음물 배스(ice water bath) 내에서 caged-PKA 및 caged-PKA/UCNP에 대해 200 mW/cm²의 UV 광분해를 수행합니다. PKA 활성은 피루브산 키나아제 젖산 탈수소효소(pyruvate kinase lactate dehydrogenase) 효소 결합 분석법으로 결정합니다. PKA 용액을 첨가한 후 시간에 따른 NADH 흡광도의 감소를 측정합니다.배양기 외부에서 안정적인 pH 조절을 위해, 미세주입 기간 동안 세포를 10% fetal bovine serum이 포함된 L15 배지에서 배양하십시오. 나중에 팁 입구를 열기 위해, 니들 풀러를 직경 약 1.5 microns의 원뿔 모양 팁이 생성되도록 설정하십시오. 팁 입구를 열려면, 니들을 미세주입기에 설치하고 니들 팁을 슬라이드 가장자리에 접촉시킨 후 현미경 스테이지의 미세 조절 나브를 사용하여 조절하십시오.이 진동력은 팁을 약간 파손시켜 개구부를 확장하기에 충분합니다. 40배 대물렌즈를 이용한 현미경 이미지로 확인할 수 있도록, 바늘 개구부의 외경이 1.3에서 1.5 microns인지 검사하십시오. 다음으로, 가압 간격을 200에서 300 milliseconds로 설정하고 주입 압력을 50에서 75 hectopascals로 설정하며, 바늘 내부로 배지가 역류하는 것을 방지하기 위해 일정 보상 압력을 15에서 30 hectopascals로 설정하십시오.바늘의 뒷부분에 TAMRA 염료가 포함된 caged-PKA/UCNP 복합체를 로딩합니다. 로딩된 바늘을 30도에서 45도 사이의 각도로 단축 유압 마이크로매니퓰레이터에 설치합니다. 현미경으로 바늘을 확인하여 샘플 로딩 후 기포가 생성되지 않았는지 확인합니다.바늘을 배지에 담근 후 형광 모드로 전환하여, 주입 압력을 가했을 때 염료가 일시에 방출되고 보정 압력을 지속적으로 가했을 때 염료가 천천히 방출되는지 확인하십시오. 그런 다음 위상차 명시야 모드로 전환하여 세포 미세주입을 시작합니다. 주입이 성공적으로 이루어지면 막 충격파가 관찰될 수 있습니다.세포를 두 번 세척하고, 주입된 세포에서 공동 주입된 TAMRA 형광을 확인하여 미세 주입이 성공적으로 이루어진 세포의 위치를 찾습니다. UCNP는 도입되었으나 공동 주입된 염료 신호가 없는 세포는 주입 과정에서 세포막이 파열된 것으로 간주하며, 이후 실험에서 제외해야 합니다. 10x 대물렌즈로 초점을 맞춘 하단 층 광로의 980 nanometer 레이저 다이오드로 세포를 15분 동안 조사합니다.가열을 방지하기 위해 5분간의 조사 후 매번 5분 동안의 암소 간격을 둡니다. 초 단위 또는 그 미만의 짧은 활성화 시간이 필요한 경우, 단순히 40x 대물렌즈로 교체하여 초점 광자 밀도를 높입니다. 광분해 및 세포 회복 후, PBS에 희석된 4% paraformaldehyde 1 mL로 세포를 20분 동안 고정한 다음, alexa 594 염색을 진행합니다.마지막으로, NIR 유도 스트레스 섬유 붕괴를 시각화합니다. NIR 조사 후, 흰색 화살표로 표시된 caged-PKA/UCNP가 미세주입된 세포에서 업컨버전 방출이 나타납니다. 성공적인 PKA NIR 광활성화로 인해 발생한 스트레스 섬유 붕괴는 더 많은 f actin을 노출시키며, 결과적으로 UCNP 근처에서 강한 녹색 염색 결과로 이어집니다.세포에 미세주입을 수행하되 암흑 상태로 유지한 음성 대조군에서는 스트레스 섬유의 붕괴가 나타나지 않습니다. NIR 광활성화 후의 f actin 노출 수준은 alexa 594로 염색한 후 image J를 통해 정량화할 수 있습니다. 빨간색 화살표를 따라 f actin 염색의 강도 곡선을 도식화하여, NIR 유도 PKA 활성과 상관관계가 있는 스트레스 섬유 붕괴에 대한 정량적 정보를 제공하였습니다. 미세주입 기술에 익숙해지면, 준비 과정과 caged-PKA/UCNP의 품질 관리를 포함하여 하루 안에 이 기술을 수행할 수 있습니다.본 실험 장비의 수정 사항 및 실험 절차를 통해, 전통적인 UV 적정법과 같이 매우 높은 시공간 해상도로 원하는 반응을 근적외선(near IR)으로 유도할 수 있으며, 광독성이 없어 세포에 무해합니다. 이 영상을 시청하신 후, 미세주입법을 통해 효소-나노입자 복합체를 세포 내로 전달하고, 세포 호환성 근적외선을 사용하여 효소를 광활성화하는 방법에 대해 충분히 이해하시길 바랍니다. 이 기술은 세포가 UV 광독성을 견딜 수 없는 상황에서, 시공간 해상도를 위해 빛을 이용해 살아있는 세포 내에서 원하는 효소 반응을 유도해야 하는 화학생물학 분야 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.이 절차에 따라, 시공간적 광활성화가 필요한 추가적인 질문들에 답하기 위해 다른 생물학적 작용제를 업컨버전 나노입자에 결합할 수 있습니다. 생물학적 작용제가 세포 외에서 작동하는 경우에는 미세주입조차 필요하지 않습니다. 근적외선 광활성화 플랫폼은 조직 내에서 더 깊은 투과 깊이를 제공할 수 있으므로, 소동물에 적용하여 정해진 시간과 위치에서 원하는 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

유기 염료 분자와 올레산으로 코팅된 상향 변환 나노 입자는 수용성이 아닙니다. 이 프로토콜은 유기 염료 분자를 전달하고 입자를 초기 소수성 용매에서 물로 상향 변환할 수 있는 '플러그 앤 플레이' 방법을 설명합니다.

&#39;플러그 앤 플레이&#39;방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

단단히 초점을 맞춘 펨토초 레이저는 공초점 현미경 검사법에 결합되어 세포에 정확한 자극을 전달하여 실시간 관찰 및 광자극을 가능하게 합니다. 광자극은 ERK 신호 통로 및 반응성 산소 종의 미토콘드리아 섬광을 포함한 세포 분자 이벤트를 활성화할 수 있습니다.

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

배우세요 상향변환 나노입자를 이용한 근적외선 광활성화로 세포 내 단백질 키나아제 A를 활성화하는 방법입니다. 이 기술은 광독성 없이 신호전달 경로를 연구하여 암 발생 메커니즘 이해에 기여합니다.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

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