원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

이 실험의 목표는 근적외선 조사를 사용하여 효소를 광활성화할 수 있는 가능성을 입증하는 것입니다. 케이지 단백질 키나아제 A는 상향 변환 나노 입자가 세포에 미세 주입되고 근적외선 조사 후 살아있는 세포에서 키나아제 유도 반응이 관찰됩니다. 전통적인 광활성화는 광독성 자외선을 필요로하며 필연적으로 바람직하지 않은 화학 반응 및 유사한 반응을 동시에 유도하지만, 근적외선 조사와 같은 친숙한 옵션에서는 낮은 에너지로 인해 반응을 유발할 수 없습니다.

상향 변환 나노 입자는 생체 친화적 인 저에너지 IR 광자를 고 에너지 UV 광자로 효과적으로 상향 변환하여 직접적인 자외선 조사 없이 입자 표면 근처에서 화학 반응을 유발할 수 있습니다. Kinase는 종양 발생에 중요한 역할을 하며, 이 기술은 UV 광독성 및 그 부반응으로 인한 간섭 노이즈를 훨씬 낮추면서 더 많은 신호 전달 정보를 검사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 분야를 처음 접하는 개인은 상향 변환 응용 프로그램을 위한 기기 및 광학 설정을 수정하는 데 어려움을 겪을 것입니다.

시작하려면 형광분광계의 큐벳 홀더 옆에 4x 대물 렌즈를 설치하여 레이저가 큐벳 중앙에 초점을 맞출 수 있도록 합니다. 대물 렌즈에 대해 조정 가능한 980 나노미터 레이저 다이오드를 90도 각도로 놓습니다. 완전 반사 거울과 대물 렌즈와 레이저의 광 경로 교차점을 설치하십시오.

내부 부품을 보호하기 위해 분광계의 여기 창을 차단하기 위해 양극 산화 처리된 금속판을 배치하는 것을 잊지 마십시오. 그런 다음 실리카로 코팅된 상향변환 나노입자 용액의 큐벳을 홀더에 놓습니다. 레이저가 켜질 때 밝은 상향 변환 빔을 시각화할 수 있습니다.

분광학을 발광 모드로 전환하고 정렬 중에 가장 낮은 PMT 전압을 사용합니다. PMT가 가장 강한 신호를 포착할 수 있도록 빔이 큐벳 중앙을 통과하도록 미러 및 레이저 스테이지를 조정합니다. 이색성 미러와 여기 필터를 설치한 후 하단 광 경로에 980나노미터 레이저 다이오드를 설치합니다.

레이저와 미러 사이에 콜리메이터를 추가하여 초점면에서 NIR 조사 영역을 확산시키고 확대하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 상향 변환 나노 입자 용액을 사용하여 근적외선 빔을 시각화합니다. 레이저 스테이지의 위치를 조정하여 근적외선 광선을 중앙에 배치하여 정렬을 완료합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 caged-PKA/UCNP를 생성하기 위해 caged-PKA synthesis를 수행하고 caged-PKA/UCNP를 demobilize합니다. UV 광분해 전에 두 구조체의 활성을 측정하려면 분석 혼합물에 2마이크로리터의 PKA 용액을 첨가한 후 시간이 지남에 따라 분석 혼합물에서 NADH 흡수제의 감소를 측정합니다. PKA/UCNP에 대해 측정을 반복합니다.

다음으로, 얼음물 수조에서 caged-PKA 및 caged-PKA/UCNP의 제곱센티미터당 200밀리와트에서 UV 광분해를 수행하여 PKA가 활성화될 수 있는지 확인합니다. PKA 활성은 피루브산 키나아제, 젖산, 탈수소 효소, 결합 분석법에 의해 결정됩니다. NADH 흡수제가 감소하면 PKA 용액을 첨가한 후 시간이 지남에 따라 측정됩니다.

인큐베이터 외부에서 안정적인 pH 제어를 위해 미세주입 기간 동안 L15 배지를 함유한 10%소 태아 혈청에서 세포를 배양합니다. 나중에 팁을 열 수 있도록 직경이 약 1.5미크론인 원뿔 모양의 팁에 대해 바늘 풀러를 구성합니다. 팁을 열려면 마이크로인젝터에 바늘을 설치하고 바늘 끝을 슬라이드 가장자리와 접촉하도록 움직인 다음 현미경 s의 가벼운 손잡이로 따르십시오.tage.

이 진동력은 팁을 약간 부러뜨리고 개구부를 확대하기에 충분합니다. 바늘 개구부를 검사하여 외부 직경이 1.3 - 1.5미크론인지 확인하고, 이는 40x 대물 렌즈를 사용하여 현미경 이미지로 확인할 수 있습니다. 다음으로, 200 - 300 밀리초의 가압 간격으로 주입 압력을 50 - 75 헥토파스칼로 설정하고 일정한 보상 압력을 15 - 30 헥토파스칼로 설정하여 바늘로의 매체 역류를 방지합니다.

침의 뒤쪽 위치에 TAMRA 염료가 든 caged-PKA/UCNP 복합체를 로드합니다. 그런 다음 적재된 바늘은 30도에서 45도 사이의 각도로 1축 유압 미세 조작기에 설정됩니다. 현미경으로 바늘을 확인하여 샘플 로딩 후 기포가 발생하지 않았는지 확인합니다.

바늘을 배지에 담근 후 형광 모드로 전환하여 주입 압력이 가해질 때 염료의 파열 방출과 보상 압력이 지속적으로 적용될 때 염료의 느린 방출을 확인합니다. 그런 다음 위상차 명시야 모드로 전환하여 세포 미세주입을 시작합니다. 멤브레인 충격파는 성공적인 주입에서 관찰될 수 있습니다.

세포를 두 번 세척하고 주입된 세포에 동시 주입된 TAMRA 형광이 있는지 확인하여 성공적으로 미세주입된 세포를 찾습니다. UCNP가 입회하지만 동시 주입된 염료 신호가 없는 세포는 주입 중 세포막이 파열되었음을 나타내므로 추가 실험에서 제외해야 합니다. 10x 대물 렌즈로 초점을 맞춘 하단 광 경로의 980 나노미터 레이저 다이오드를 15분 동안 세포에 조사합니다.

가열을 피하기 위해 5분마다 조사 후 5분 동안 어두운 시간을 두십시오. 몇 초 또는 몇 초 미만과 같이 더 짧은 활성화 시간이 필요한 경우 더 높은 초점 광자 밀도를 위해 40x 대물 렌즈로 전환하기만 하면 됩니다. 광분해 및 세포 회수 후 PBS에서 1밀리리터 또는 4%파라포름알데히드로 세포를 20분 동안 고정한 후 염색 내에서 Alexaa 594를 추가로

마지막으로, NIR에 의한 응력 섬유 분해를 시각화합니다. NIR 조사 후 흰색 화살표로 표시된 대로 caged-PKA/UCNP를 미세주입한 세포는 상향 전환 방출을 보여줍니다. 성공적인 PKA NIR 광활성화로 인한 응력 섬유 분해는 더 많은 f actin을 노출시켜 결과적으로 UCNP 근처에서 강한 녹색 염색을 초래합니다.

세포가 미세 주입되었지만 어둠 속에 남아 있는 음성 대조군은 응력 섬유의 분해를 보여주지 않습니다. NIR 광활성화 후 f 액틴 노출 수준은 alexa 594로 염색한 후 이미지로 정량화할 수 있습니다. 빨간색 화살표를 따라 염색되는 f 액틴 염색의 강도 곡선을 그려 NIR 유도 PKA 활성과 상관관계가 있을 수 있는 응력 섬유 붕괴의 정량적 정보를 제공합니다. 미세주입에 익숙해지면 이 기술은 caged-PKA/UCNP의 준비 및 품질 관리를 포함하여 하루 이내에 완료할 수 있습니다.

기기 수정 및 실험에 대한 지침을 통해 원하는 반응은 적정 방법을 위한 기존 UV와 같은 고도의 공간적 시간 해상도로 근적외선에 의해 트리거될 수 있지만 광독성이 없으면 전염성이 없습니다. 이 비디오를 시청한 후 벨 호환 근적외선을 사용하여 효소 나노 입자 복합체를 미세 주입으로 세포에 전달하고 효소를 광활성화하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다. 이 기술은 세포가 UV 광독성을 견딜 수 없을 때 살아있는 세포에서 원하는 효소 반응을 유발하기 위해 빛을 사용하여 원하는 효소 반응을 유발해야 하는 화학 생물학 분야의 연구자들에게 길을 열었습니다.

이 절차에 따라 다른 바이오 영향체를 상향 변환 나노 입자와 연결하여 공간적 시간 광활성화가 필요한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 바이오 영향 물질이 세포 밖에서 작용한다면 미세주입은 필요하지도 않습니다. 근적외선 광활성화 플랫폼은 또한 조직에 더 많은 침투 깊이를 제공할 수 있으므로 주어진 시간과 위치에서 원하는 반응을 유발하기 위해 작은 동물에 적용할 수 있습니다.