Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

다음 동영상은 C-Brick 표준물질을 사용하여 CRISPR 관련 단백질인 Cpf1을 사용하여 DNA 부품을 조립하는 절차를 자세히 설명합니다. 이 방법은 합성 생물학 분야에서 DNA 어셈블리의 개발을 촉진할 수 있습니다. 예를 들어, 복잡한 유전 회로의 구축을 촉진하는 것과 같은.

이 방법의 주요 장점은 서열에 독립적이고 DNA 구조체의 반복적인 조립이 가능하다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 Cpf1이 단일 siRNA와 촉매 DNA가 쌓여 있는 것에 의해 유도된다는 것을 알게 되었을 때 처음 떠올랐습니다. 따라서 DKN을 생성합니다.

시연은 제 연구실의 대학원생인 Shi-Yuan Li가 시연할 것입니다. crRNA 템플릿을 복구하려면 RNase 자유수에 있는 개별 올리고뉴클레오티드를 10마이크로몰의 농도로 다시 현탁시킵니다. 0.2 millil PCR 튜브에 상단 가닥 올리고뉴클레오타이드, 하단 가닥 올리고뉴클레오티드 및 10x 어닐링 완충액을 동봉된 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

총 부피가 50마이크로리터인지 확인하십시오. 이 표는 6개의 서로 다른 하단 가닥 올리고뉴클레오티드를 보여주며, 각 올리고뉴클레오티드는 상단 가닥 T7-F와 개별적으로 쌍을 이루어야 합니다. 소문자는 crRNA의 안내 서열로 전사될 염기서열을 나타냅니다.

PCR 튜브를 열 순환기에 넣습니다. 초기 탈질로 섭씨 95도에서 5분 동안 어닐링 프로그램을 실행한 다음 분당 섭씨 1도 감소로 섭씨 95도에서 20도로 냉각합니다. 어닐링 후 즉시 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에서 어닐링된 생성물을 RNase free water, T-7 transcription buffer, NTP 혼합물, 재조합 RNase 억제제 및 T-7 RNase 중합효소와 결합하여 transcription을 수행합니다.

하룻밤 동안 섭씨 37도의 수조에서 반응을 배양합니다. 다음 날, RNA 세척 및 농축 키트를 사용하여 전사된 RNA를 정제합니다. UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화합니다.

그런 다음 RNA를 10마이크로몰의 농도로 희석합니다. 샘플을 즉시 사용하지 않는 경우 섭씨 80도에서 보관하십시오. C-Brick 부품의 시공은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다.

비디오의 이 섹션에서는 3개의 염색단백질 카세트, cjBlue, eforRed 및 amilGFP를 seamless assembly 방법을 사용하여 조립합니다. 먼저 염색단백질 카세트의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드를 설계하고 주문합니다. 올리고뉴클레오티드가 도착하면 10마이크로몰 농도의 초순수에 다시 현탁시킵니다.

다음으로, PCR 반응을 설정하려면 얼음 위에 0.2mL PCR 튜브를 놓습니다. 초순수, 2개의 XPCR 완충액, DNTP, 정방향 및 역방향 프라이머, 염색단백질 템플릿 및 고충실도 DNA 중합효소를 추가합니다. 튜브를 써모사이클러에 직접 넣고 프로그램을 실행합니다.

샘플을 즉시 사용하거나 얼려 섭씨 20도에서 보관하십시오. 증폭 후 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 다음으로, BamH1으로 C-Brick 표준 벡터를 분해하기 위해 초순수, 플라스미드, 10x 완충액 및 BamH1을 튜브에 추가합니다.

수조에서 섭씨 37도에서 최대 2시간 동안 배양합니다. gel cleanup kit를 사용하여 선형화된 벡터를 정제합니다. 세척 후 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 이음매 없는 조립 키트의 선형화된 벡터, PCR 산물, 5x 심리스 어셈블리 버퍼 및 심리스 어셈블리 효소를 결합합니다.

총 부피가 10마이크로리터인지 확인하십시오. 이것을 섭씨 37도의 수조에 30분 동안 두십시오. 배양 후에는 샘플을 즉시 사용하거나 얼음에 얼려 섭씨 20도에서 보관하십시오.

90 마이크로 리터의 대장균 DH10B에 10 마이크로 리터의 구성물을 추가합니다. 화학적 변형을 수행합니다. 그런 다음 형질전환된 세포를 LB 플레이트에 펴고 섭씨 37도에서 배양합니다.

다음 날, 5ml 액체 LB 튜브에서 배양할 클론 몇 개를 선택하고 섭씨 37도의 셰이커에서 220rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다. plasmid preparation kit를 사용하여 plasmid를 추출합니다. 그런 다음 Sanger 염기서열분석을 통해 올바른 클론을 식별합니다.

C-Brick path의 구축은 반응성 PCI 애플리케이션 또는 T4 DNA 리가제 배지의 접합에 대한 즉각적인 분해의 제한에 의해서도 수행될 수 있습니다. 다음으로, C-Brick 벡터를 Cpf1으로 분해하려면 RNase 자유수, 10x Cpf1 완충액, 플라스미드, 재조합 RNase 억제제 및 Cpf1을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다. T1 및 T2 부위에 외래 DNA 단편을 삽입하려면 1마이크로리터의 crRNA T2를 첨가하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 튜브를 수조에 보관하고 1마이크로리터의 crRNA T1, 1마이크로리터의 Cpf1을 추가하고 30분 더 배양합니다. 두 인식 부위가 벡터 DNA에서 더 가깝기 때문에 crRNA T2가 먼저 추가됩니다. T1 부위에 대한 Cpf1 결합은 T2 부위의 침구에 영향을 미칠 수 있습니다.

또한, T2'site가 T2 site를 대체하는 경우, crRNA T1이 먼저 추가되면 T2'site가 파괴될 것입니다. 1마이크로리터의 감열성 알칼리성 인산가수분해효소를 첨가하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 한 시간 더 배양합니다. 아가로스 젤 전기영동을 수행하고 겔 cleanup 시스템 키트를 사용하여 벡터를 정제합니다.

샘플을 즉시 사용하거나 얼려 섭씨 20도에서 보관하십시오. Cpf1으로 관심 DNA 단편을 분해하려면 RNase free water, 10x Cpf1 buffer, plasmid, recombinant RNase inhibitor 및 Cpf1을 1.5ml microcentrifuge tube에 결합하십시오. T1 및 T2 부위에 외래 DNA 단편을 삽입하려면 1마이크로리터의 crRNA T1과 1마이크로리터의 crRNA T3를 튜브에 넣고 섭씨 37도의 수조에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 아가로스 젤 전기영동을 수행하고 겔 클린업 키트를 사용하여 단편을 정제합니다. 샘플을 즉시 사용하거나 얼려 섭씨 20도에서 보관하십시오. 다음으로, C-Brick 벡터에서 외부 DNA 단편을 접합하기 위해 선형화된 벡터와 DNA 단편을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 결합합니다.

10x T4 DNA 리가아제 완충액 및 T4 DNA 리가아제를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 22도에서 2시간 동안 배양합니다. 샘플을 즉시 사용하거나 얼려 섭씨 20도에서 보관하십시오.

10마이크로리터의 결찰 산물을 대장균 DH10B 수용 세포에 첨가하고 화학적 변형을 수행합니다. 그런 다음 변형된 대장균을 LB 플레이트에 펴고 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 날, 5 밀리리터 액체 LB 튜브에 여러 클론을 추가하고 220 rpm 및 37 섭씨 온도의 셰이커에서 밤새 배양합니다.

plasmid preparation kit를 사용하여 plasmid를 추출합니다. 그런 다음 Sanger 염기서열분석을 통해 올바른 클론을 식별합니다. C-Brick 어셈블리를 새로 수행합니다.

샘플을 사용하여 소위 크랙 클론을 추가 C-Brick 반복 어셈블리를 위한 새로운 C-Brick 벡터 또는 DNA 조각으로 사용할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 대로 3개의 염색단백질 카세트, cjBlue, eforRed 및 amilGFP를 조립했습니다. 3개의 염색단백질이 판에서 자란 대장균에서 발현되었습니다.

염색단백질이 없는 음성 대조 박테리아는 네 번째 플레이트에 표시됩니다. 그 후, 더 많은 색상을 만들기 위해 두 개의 색상 표현 카세트가 C-Brick 표준으로 추가로 조립되었습니다. 3개의 염색단백질과 3개의 조립된 이중 염색단백질이 액체 LB 배지에서 성장한 대장균에서 발현되었습니다.

1 내지 6에서, 발현된 구성물은 eforRed, 1, amilGFP, 2, cjBlue, 3, amilGFP 더하기 eforRed, 4, eforRed 더하기 cjBlue, 5, 및 amilGFP 더하기 cjBlue, 6이다. 단일 플레이트 또는 단일 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 다채로운 박테리아를 단일 염기서열 검증 클론에서 배양했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 siRNA 준비 및 Cpf1 clearancing을 위해 모든 재료에 RNase가 없어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 저는 여전히 이 전략이 합성생물학 분야의 연구자들이 대사 경로의 유전적 쇼케이스를 구축하는 데 도움이 되었다고 생각합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 C-Brick 표준을 사용하여 DNA 경로를 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.