임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

소형화된 고상 추출 및 LC-MS/MS 결합 분석법의 전반적인 목표는 임상 적용을 위해 인간 소변 내의 유리 3-nitrotyrosine을 정확하게 정량하는 것입니다. 유리 3-nitrotyrosine은 생성량 및 산화 스트레스의 바이오마커 역할을 합니다. 하지만 낮은 민감도와 선택성, 그리고 번거로운 시료 전처리 과정으로 인해 임상 적용을 위한 생물학적 응급 상황에서 3-nitrotyrosine을 정확하게 정량하는 것은 여전히 특별한 과제로 남아 있습니다.

고감도 LC-MS/MS 상호작용 내에 효과적인 고상 추출을 통합한 이 기술을 통해, 구성 및 2차원 LC 없이도 인간 소변 내 낮은 농도의 내인성 3-nitrotyrosine을 신속, 특이적 및 정확하게 정량할 수 있습니다. 이 방법은 산화 스트레스 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 복합 염증 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다른 병리적 상태에도 적용될 수 있습니다. 3-nitrotyrosine 수치는 항산화제에 의해 감소될 수 있으므로, 이 기술의 응용 범위는 항산화 치료의 효과를 모니터링하는 것까지 확장될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 이전에 준비하여 해동한 소변 샘플, 표준 물질 및 QC 샘플을 볼텍싱하십시오.

볼텍싱 후, 깨끗한 2 mL 96-웰 수집 플레이트의 32개 웰에 각 샘플과 표준물질을 250 µL씩 첨가합니다. 더블 블랭크 샘플 웰을 제외한 각 웰에 미리 준비한 내부 표준물질 작업 용액 50 µL를 첨가합니다. 그런 다음 더블 블랭크 샘플 웰에 0.01% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 50 µL를 첨가합니다.

그 후, 0.1% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 250 µL를 웰에 추가합니다. 그런 다음 8채널 피펫을 사용하여 용액을 세 번 혼합하고 SPE 로딩 전까지 플레이트를 덮어둡니다. 다음으로, 혼합 모드 양이온 교환 96-웰 추출 마이크로플레이트와 수집 리저버를 양압 프로세서에 배치합니다.

혼합 모드 양이온 교환 마이크로플레이트를 이용한 고상 추출을 통해 단일 추출 과정에서 3-nitrotyrosine의 시료 정제와 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 흡착제에 LC-MS 등급의 메탄올 200 µL를 흘려 추출 플레이트를 컨디셔닝합니다. 양압 프로세서의 압력 조절 노브를 돌려 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐르도록 낮은 양압을 설정하고, 필요에 따라 압력을 조절합니다.

2% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 200 microliters를 흡착제에 흘려 평형화합니다. 8채널 파이펫을 사용하여, 미리 혼합된 각 시료의 전체 부피를 전처리된 추출 플레이트에 조심스럽게 로딩합니다. 양압 프로세서의 양압을 낮게 설정하여 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐르도록 하며, 필요에 따라 압력을 조절합니다.

그 다음, 2% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 200 µL를 흡착제에 흘려 웰을 세척합니다. 200 µL의 methanol과 물로 세척한 후, 양압 프로세서를 고압으로 설정하여 웰을 건조합니다. 웰이 건조되면 리저버를 깨끗한 2 mL 96-웰 수집 플레이트로 교체합니다.

이제 25 mM 암모늄 아세테이트 솔루션 50 µL를 적용하여 추출 플레이트에서 잔류 분석물과 내부 표준물질을 천천히 용출시키십시오. 그 다음 5% 포름산이 포함된 LC-MS 등급의 물 50 µL를 추가하여 용출액을 중화하십시오. 3-nitrotyrosine의 용출을 위해 약한 암모늄 아세테이트 솔루션을 적용하면 선택성과 민감도를 상당히 향상시킬 수 있습니다.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석을 준비하기 위해 8채널 피펫으로 샘플을 3회 혼합합니다. LC-MS/MS 장비를 설정한 후, LC 기울기 용리(gradient elution)를 통해 3-nitrotyrosine LC-MS/MS 분석법을 10분 동안 평형화합니다. 분석법을 평형화함으로써 LC 기울기가 초기 기울기 용리 상태로 평형을 이루게 됩니다.

자동 시료 분취기의 온도는 4 °C로, 오븐 온도는 30 °C로 설정합니다. 소변 시료, 표준 물질 및 QC 시료를 포함하는 배치 리스트를 작성합니다. 그 후 준비된 시료를 주입하여 배치를 시작합니다.

모든 주입을 완료한 후, 3-nitrotyrosine의 명목 농도 대비 3-nitrotyrosine과 내부 표준물질의 피크 면적 비율에 대한 선형 회귀 분석을 통해 10에서 2,500 pg/mL 범위의 표준 곡선을 작성하여 3-nitrotyrosine을 정량합니다. 마지막으로, 작성된 표준 곡선을 사용하여 나머지 모든 시료를 정량하고 QC 시료가 설정된 범위 내에 있는지 확인합니다. 인간 소변 시료의 LC 데이터는 최적화된 조건에서 3-nitrotyrosine이 구조적으로 유사한 다른 tyrosine 유사체들과 크로마토그래피적으로 분리됨을 보여주며, 이는 과량으로 존재하는 이러한 화합물들로 인한 공동 용출 간섭을 제거하여 결과적으로 분석의 선택성을 향상시킵니다.

이중 공시료(double blank sample)의 다중 반응 모니터링 크로마토그램에서는 3-nitrotyrosine 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 전체 과정 동안 3-nitrotyrosine이 생성되지 않았음을 나타냅니다. 여기에는 건강한 개인의 3-nitrotyrosine 및 내부 표준물질에 대한 대표적인 다중 반응 모니터링 크로마토그램이 표시되어 있습니다. 3-nitrotyrosine 및 내부 표준물질의 머무름 시간에서 간섭 신호는 관찰되지 않았습니다.

여기에 대표적인 표준 곡선이 나와 있습니다. 신호 대 잡음비가 3보다 큰 가장 낮은 농도로 정의된 검출 한계는 2 pg/mL로 결정되었습니다. 정량 한계 하한은 10 pg/mL로 결정되었으며, 이는 신호 대 잡음비가 10보다 크고 정밀도 및 정확도의 오차가 20% 이내인 가장 낮은 농도로 정의됩니다.

미세 조정된 통합 분석법은 매트릭스 효과, 흡착제 사용량 및 폐기물 처리를 줄이면서 특이도, 민감도 및 처리량을 크게 향상시킵니다. 이 간단하고 신속한 분석법을 통해 소변 시료를 24시간 이내에 처리할 수 있습니다. 비침습적이고 저렴한 소변 채취의 장점을 고려하십시오.

이 획기적으로 개선된 방법은 전임상 및 임상 연구에서 산화 스트레스 바이오마커로서 3-nitrotyrosine의 역할을 평가하는 데 매우 적합합니다.