임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

LC-MS/MS 분석과 결합된 이 소형 고체상 추출의 전반적인 목표는 임상 적용을 위해 인간 소변에서 유리 3-니트로티로신을 정확하게 정량화하는 것입니다. 유리 3-니트로티로신은 수율과 산화 스트레스에 대한 바이오마커에 도움이 됩니다. 그러나 불충분한 감도, 선택성 및 번거로운 시료 준비로 인해 임상 응용 분야에서 생물학적 응급 상황에서 3-니트로티로신을 정확하게 정량화하는 것은 여전히 특별한 과제로 남아 있습니다.

높게 과민한 LC-MS/MS 상호 작용에 있는 효과적인 단단한 단계 적출을 통합하는 이 기술은 헌법 및 2차원 LC.Though의 필요 없이 인간적인 소변에 있는 내인성 3-nitrotyrosine의 저수준의 급속하고, 특정하고, 정확한 결심을 허용한다 이 방법은 산화 긴장 수사로 통찰력을 제공할 수 있다, 또한 복잡한 선동적이고 neurodegenerative 무질서와 같은 다른 병리학적인 상태에 적용될 수 있다. 이 기술의 의미는 항산화 물질에 의해 3-니트로티로신 수치를 감소시킬 수 있기 때문에 항산화 치료의 효과를 모니터링하는 것으로 확장될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위해 Vortex는 이전에 소변 샘플, 표준물질 및 QC 샘플을 준비하고 해동했습니다.

볼텍싱(vortexing) 후 각 샘플과 표준물질 250마이크로리터를 깨끗한 2밀리리터 96웰 수집 플레이트의 32웰에 추가합니다. 이전에 준비된 내부 표준 작업 용액 50마이크로리터를 이중 블랭크 샘플 웰을 제외한 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 LC-MS 등급 물과 0.01 %의 포름산을 이중 블랭크 샘플 웰에 첨가합니다.

그런 다음 250 %의 포름산이 함유 된 LC-MS 등급의 물 0.1 마이크로 리터를 우물에 첨가합니다. 그런 다음 용액을 8채널 피펫으로 세 번 혼합하고 SPE가 로딩될 때까지 플레이트를 덮습니다. 다음으로, 혼합 모드 양이온 교환 96웰 추출 마이크로플레이트와 수집 저장소를 양압 프로세서에 배치합니다.

혼합 모드 양이온 교환 마이크로플레이트를 사용한 고체상 추출을 통해 한 번의 추출로 3-니트로티로신의 시료 세척 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 흡착제를 통해 200마이크로리터의 LC-MS 등급 메탄올을 흐르게 하여 추출 플레이트를 컨디셔닝합니다. 양압 프로세서의 압력 조절 손잡이를 돌려 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐를 수 있도록 낮은 양압을 설정하고 필요한 경우 압력을 조정합니다.

흡착제를 통해 200마이크로리터의 LC-MS 등급 물을 2% 포름산으로 흘려 평형을 이룹니다. 8채널 피펫을 사용하여 사전 혼합된 각 샘플의 전체 부피를 사전 컨디셔닝된 추출 플레이트에 조심스럽게 로드합니다. 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐르도록 양압 프로세서에 낮은 양압을 설정하고 필요에 따라 압력을 조정합니다.

그런 다음 흡착제를 통해 200%포름산이 함유된 200마이크로리터의 LC-MS 등급 물을 흘려 우물을 세척합니다. 200마이크로리터의 메탄올과 물로 세척한 후 우물을 건조시키기 위해 양압 프로세서를 고압으로 설정합니다. 웰이 마르면 저장소를 깨끗한 2밀리리터 96웰 수집 플레이트로 교체합니다.

이제 50마이크로리터의 25밀리몰 암모늄 아세테이트 용액을 도포하여 추출 플레이트에서 잔류 분석물과 내부 표준물질을 천천히 용리합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 LC-MS 등급 물에 5% 포름산을 첨가하여 용리액을 중화합니다. 3-니트로티로신의 용출을 위해 순한 아세트산 암모늄 용액을 적용하면 선택성과 감도가 크게 향상됩니다.

액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 분석을 준비하기 위해 시료를 8채널 피펫과 3회 혼합합니다. LC-MS/MS 기기를 설정한 후 LC 그래디언트 용리액으로 3-니트로티로신 LC-MS/MS 분석법을 10분 동안 평형을 이룹니다. 이 방법을 평형화하면 LC 그래디언트가 초기 그래디언트 용리와 평형을 이룰 수 있습니다.

자동 샘플러 온도는 섭씨 4도로 설정되고 오븐 온도는 섭씨 30도로 설정됩니다. 소변 샘플, 표준물질 및 QC 샘플을 포함하는 배치 목록을 만듭니다. 그런 다음 준비된 샘플을 주입하여 배치를 시작합니다.

모든 주입을 완료한 후 3-니트로티로신의 피크 면적 비율과 공칭 3-니트로티로신 농도 대비 내부 표준물질의 선형 회귀를 통해 3-니트로티로신 정량화를 위해 10-2, 밀리리터당 500피코그램 범위의 표준 곡선을 설정합니다. 마지막으로, 설정된 표준 곡선을 사용하여 다른 모든 샘플을 정량화하고 QC 샘플이 설정된 범위 내에 있는지 확인합니다. 인간 소변 샘플의 LC 데이터는 3-니트로티로신이 최적화된 조건에서 구조적으로 유사한 다른 티로신 유사체와 크로마토그래피적으로 분리되어 이러한 매우 과도한 화합물로 인한 동시 용리 간섭을 제거하고 결과적으로 분석 선택성의 정도를 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

이중 블랭크 샘플의 다중 반응 모니터링 크로마토그램에서 3-니트로티로신 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 전체 공정 동안 3-니트로티로신이 형성되지 않았음을 나타냅니다. 건강한 개인을 위한 3-니트로티로신의 대표적인 다중 반응 모니터링 크로마토그램과 내부 표준물질이 여기에 나와 있습니다. 3-니트로티로신의 머무름 시간과 내부 표준물질에서 간섭 신호가 관찰되지 않았습니다.

대표적인 표준 곡선이 여기에 표시되어 있습니다. 신호 대 잡음비가 3보다 큰 가장 낮은 농도로 정의된 검출 한계는 밀리리터당 2피코그램으로 결정되었습니다. 정량화의 하한은 밀리리터당 10피코그램으로 결정되었으며, 신호 대 잡음비가 10 이상인 부정확성 및 정확도가 20% 이내의 최저 농도로 정의되었습니다.

미세 조정된 통합 분석은 기질 효과, 흡착제 사용 및 폐기물 처리를 줄여 특이성, 감도 및 처리량을 크게 개선합니다. 이 간단하고 신속한 분석을 통해 소변 샘플을 24시간 이내에 처리할 수 있습니다. 비침습적이고 저렴한 소변 검체를 고려하십시오.

이 현저하게 개선된 방법은 전임상 및 임상 연구에서 산화 스트레스 바이오마커로서 3-니트로티로신의 역할을 평가하는 데 매우 적합합니다.