Name: 임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 인간 소변에서 3-nitrotyrosine을 정량 분석하는 소형 고체상 추출 및 LC-MS/MS 방법을 활용한 산화 스트레스 바이오마커 연구. 이 기술은 임상 적용 및 항산화 치료 효과 모니터링에 활용됩니다.

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저자는 Scott Haard와 Abigail Marinack에게이 작업에 대한 일반적인 지원과 조정에 대해 인정할 것입니다.

인간의 소변 샘플을 포함한 모든 연구는 Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB)의 승인 절차를 거쳤습니다. 1. 소변 채취 및 크레아티닌 (Cr) 측정 <ol><li> 다음 아침 소변 샘플 5 mL를 ca. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 방부제 및 저장액으로 3 N HCl 250 μL를 함유하는 5 mL 수송 튜브 A에서 10 시간 하룻밤 동안 단식. </li><li> 해동과 소용돌이 5 mL 수송 뇨 튜브와 원심 분리기 ( 예 : Sorvall) (2297 xg, 10 분)에서 원심 분리하십시오. </li><li> 소변 1 mL를 5 mL 수송 튜브 A에서 두 번 두 번. </li><li> 비뇨기 creatinine 방법으로 크롬을 결정하십시오 26 . </li></ol> 2. 표준, IS 및 품질 관리 (QC) 샘플 준비 <ol><li> 0.01 % HCOOH 이동상 A (MA)가 함유 된 물에서 100 μg / mL의 3-NT의 스톡 용액을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 하다MA로 100 μg / mL 3-NT 저장 용액을 희석하여 100 ng / mL의 농도로 3-NT 작업 표준 용액을 만듭니다. </li><li> 100 ng / mL 작업 표준의 희석으로 5에서 2500 pg / mL 범위의 표준을 생성하고 0.15 M HCl 산성화 된 3-NT 공시 뇨와 공시험 시료 및 이중 여백 시료를 사용하십시오. </li><li> -20 ℃에서 13 C IS MA 물에 100 ㎍ / ㎖의에 9 -3- NT 및 저장소의 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 100 ㎍ / ㎖의 13 C 9 -3- NT 희석하여 500 pg / ml이다에서 작동 용액을 제조는 MA와 원액이다. </li><li> 산성화 된 공백 소변에서 3-NT 작업 표준을 희석하여 LLOQ, 저, 중 및 고 수준 ( 즉 , 10, 25, 100, 500 및 1,250 pg / mL)을 포함하는 5 가지 수준의 QC 시료를 만듭니다. </li></ol> 3. 고체상 추출 과정 <ol><li> 해동 및 소용돌이 샘플, 표준 및 QC 샘플. </li><li> 소변 샘플, 표준 및 QC samp 추가les (각각 250 μL)을 깨끗한 2 mL 96- 웰 수집 플레이트 32 웰로 옮겼습니다. </li><li> 이중 빈 샘플 웰을 제외한 각 웰에 500 pg / mL IS 작동 용액 (50 μL)을 주입하십시오. 이중 빈 샘플 우물에 0.01 % HCOOH (50 μL)를 첨가한다. </li><li> 0.1 % HCOOH (250 μL)가 첨가 된 LC-MS / MS 물을 넣는다. </li><li> 위의 혼합물을 8 채널 피펫으로 3 번 섞는다. </li><li> SPE 로딩 될 때까지 플레이트를 덮으십시오. </li><li> MCX 96-well 추출 플레이트와 수집 저장소를 양압 프로세서에 놓습니다. </li><li> 흡착제를 통해 MeOH (200 μL)를 흐르게하여 추출 플레이트를 컨디셔닝한다. </li><li> 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흐르게하여 평형을 이룬다. </li><li> 8 채널 피펫을 사용하여 미리 혼합 된 각 샘플의 전체 부피를 신중하게 사전 조건화 된 추출 플레이트에로드하십시오. </li><li> 혼합물이 흐를 수 있도록 양압 프로세서에서 낮은 양의 압력 ( 예 : 3 psi)을 설정하십시오흡착제를 천천히 가볍게 두드려서 필요하면 압력을 조절하십시오. </li><li> 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흘려 우물을 씻으십시오. </li><li> 흡착제에 메탄올 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오. </li><li> 흡착제에 물 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오. </li><li> 양압 프로세서에서 높은 양압 설정 ( 예 : 40 psi)으로 웰을 완전히 말립니다. </li><li> Reservoir를 깨끗한 2 mL 96-well collection plate로 교체하십시오. </li><li> 추출 플레이트에서 보존 된 분석 물 및 IS를 용리시키기 위해 pH 9 (50 μL)에서 25 mM NH 4 OAc를 적용한다. </li><li> 용리액을 중화하기 위해 5 % HCOOH (50 μL)가 함유 된 LC-MS 물을 피펫에 넣습니다. </li><li> 8 채널 피펫으로 3 번 혼합하고 분석을 위해 LC-MS / MS 스테이션에 제출하십시오. </li></ol> 4. LC-MS / MS 분석 <ol><li> 눈금이 매겨진 실린더로 2,000 mL의 LC-MS 물을 정확하게 측정하고 2 L 병으로 옮깁니다. </li><li> 피LC - MS 물이 담긴 위의 병에 200 μL 순수 HCOOH를 넣으십시오. </li><li> 철저하게 혼합하고 이동상 A (MA)로 표시하십시오. 이니셜, 준비 날짜 및 만료 날짜를 포함하십시오. </li><li> LC-MS 메탄올 2 L 병을 가져 와서 시작 날짜와 만기 날짜가있는 이동상 B (MB)로 표시하십시오. </li><li> 자동 샘플러의 온도를 4 ° C로 설정하십시오. </li><li> 준비 샘플과 함께 수집 판을 오토 샘플러에 놓습니다. </li><li> 오븐에 PFP 컬럼 (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm)과 보호 컬럼을 놓습니다. </li><li> 오븐 온도를 30 ° C로 설정하십시오. </li><li> 표 1에 표시된대로 LC 그라디언트 용리로 획득 방법을 사용하여 10 분간 평형을 이룬다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시간 (분) </td><td> 기준 치수 </td><td> 이벤트 </td><td> 매개 변수 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> 슬리퍼 </td><td> 펌프 B Conc. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 제어 장치 </td><td> 중지 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 : 액체 크로마토 그라데이션 용출 조건 <ol start="10"><li> 다음을 포함하는 일괄 처리 목록 만들기표준, 품질 관리 및 소변 샘플. </li><li> 준비 샘플 (12 μL)의 주사에 의해 배치를 시작합니다. </li></ol> 5. 피크 식별, 통합 및 데이터 프로세스 <ol><li> 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 처리를 제어합니다. </li><li> 모든 샘플에 대해 3-NT 및 IS 피크를 확인하고 통합하십시오. </li><li> 1-x의 가중치 인자로 3-NT와 IS의 피크 면적비와 명목상 3-NT 농도의 선형 회귀에 의한 3-NT 정량을위한 10-2,500 pg / mL 범위의 표준 곡선을 확립하십시오. </li><li> 표준 곡선을 사용하여 모든 샘플을 정량화하십시오. </li><li> QC 샘플이 설정된 범위에 속하는지 확인하십시오. </li><li> 검출 된 소변 샘플의 농도를 nM 또는 nmol / mmol Cr 단위로 최종 결과로 변환하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

인간 소변 샘플의 내인성 자유 3-NT에 대한 문헌에서 이전에보고 된 농도의 상당한 변화는 이용 가능한 분석 8 , 9 , 10 , 11 과 관련된 방법 론적 문제점을 나타낸다. 인간 소변에서 3-NT의 낮은 기본 수준을 정확하게 결정하는 것은 시료 준비 및 LC-MS / MS 분석을위한 특별한 예방 조치가 필요한 까다로운 과제로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량으로 요중 3-NT의 특정하고 민감한 결정을 허용 선택적 LC-MS / MS 감지와 결합 된 새로운 SPE 절차를 설명합니다. MRM 매개 변수를 신중하게 선택하면 3-NT 검출에 대한 선택성이 향상되었습니다. NT-3에 대한 IS의 236.0&gt; 96.0 MRM 전이 m / z...

최근 임상 연구에서 산화 스트레스의 영향이 최전방으로 치닫고 있습니다 1 . 연구되는 바이오 마커 중 하나는 반응성 질소 종 (RNS)이 티로신 (catecholamine neurotransmitter precursor)과 상호 작용할 때 형성된 안정한 제품인 3- 니트로 티로신 (3-NT)입니다. 3-NT는 생체 내 RNS의 바이오 마커로서 임상 적 가치를 가질 수 있지만 , 티로신의 성질과 기능의 실질적인 변화는 해당 단백질과 세포 기능에 악영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 . 신생 연구는 3-NT가 염증성 질환 3 , 신경 퇴행성 질환 4 , 5 , 심혈관 질환 6 및 당뇨병 7 뿐만 아니라 산화 스트레스와 관련된 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했다. 그러나, 이러한 obse민감도 및 / 또는 선택성이 결여 된 방법론 8 , 9 , 10 , 11의 결과에 근거합니다. 이전에 문헌에보고 된 생물학적 시료에 대한 거대한 3-NT 농도 범위는 심각한 분석 문제가 이러한 분석법과 관련되어 있으며 3-NT 수준을 정확하게 계량화하고 이러한 병리 현상에서의 역할을 확인하기위한 기술적 개선이 필요함을 보여줍니다 . 생물학적 기질에서 유리 3-NT의 정량은 사람과 도구 8 , 9 , 10 , 11에 특별한 도전이됩니다. 첫째, 내인성 3-NT의 추적 수준은 매우 민감한 탐지를 요구합니다. 둘째로 구조적으로 유사한 많은 유사체, 특히 티로신이 존재한다.광대 한 과잉은, 높은 선택성을 요구한다; 셋째, 유비쿼터스 질산염과 아질산염으로 티로신 니트로 화에 의한 3-NT의 인공 생성물은 3-NT의 잘못된 과대 평가를 피하기 위해 시료 준비 중에 특별한 고려가 필요하다. 3-NT를 측정하기 위해 사용 된 다양한 방법론 중에서 MS / MS는 탁월한 감도 및 선택성 11 , 12 , 13 , 14 로 인해 금 표준 방법으로 간주되었습니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 결합 MS / MS가 가장 우수한 감도를 제공하지만 필수적인 유도체 화 단계는 임상 유틸리티 15 , 16에 비해 너무 지루하고 시간 소모적입니다. LC-MS / MS는 복잡한 표본 유도체 화를 필요로하지 않으므로 더 유망한 옵션입니다. 그럼에도 불구하고 se와 같은 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다.낮은 농도의 3-NT 7 , 17 , 18 의 측정을 위해서는 문헌에보고 된 LC-MS / MS 방법의 사용성이 향상되어야하고 고 처리량 응용 12 , 13 , 17 , 19에 대해서는 상대적으로 긴 처리 시간을 단축해야합니다 . 또한, 임상 적용을 고려할 때, 사용 된 생물학적 기질이 중요한 역할을한다. 가능한 경우 쉽고 저렴해야하며 가능한 경우 비 침습적이어야합니다 20 , 21 , 22 . 문헌에서 전통적으로 사용 된 혈장은 임상 적으로 바람직한 매트릭스가 아니므로, 비 침습적이고 비용 효과가있는 소변을 이용하는 방법론이 필요하다. rel 개발을위한 몇 가지 시도iable 및 특정 LC-MS / MS 방법은 소변 9 , 10 , 11을 사용하여 이루어졌습니다. 그러나, 그들은 모두 임상 적 사용을 위해 선택적이고, 신뢰할 만하 며, 효율적이지 못하다. 3 NT 분석을위한 샘플 정리 등과 같은 전통적인 역상 카트리지 (C18 타입)를 사용하여 지배적 인 SPE의 효과는 의문을 제기하고 강력한 양이온 교환의 순차적 인 SPE (SCX)와 역상 C18-OH 6 제안되었다되었습니다 7 , 19 . 한 최근 개발 된 LC-MS / MS 방법 3- NT (23)의 분석을위한 설명서 C18 SPE, 예비 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 온라인 SPE의 다단계 정제 공정을 이용했다. 이 방법은 0.041 nM의 LLOQ로 임상 목적에 충분히 민감했지만, 정화 과정은 집중적이고 지루하고 requi적색 3 mL의 소변. 높은 처리량에 대한 가능성을 제한합니다. 분자 임프린트 폴리머 정리 프로세스 (14)의 효율을 개선하기 위해 SPE 흡착제로서 사용되었지만, 생성 된 LLOQ (0.7 ㎍ / mL)의 임상 검체 충분히 낮은 아니었다. 또 다른 방법은 0.022 nM 24 의 검출 한계 (LOD)를 달성하기 위해 샘플 정화를 위해 2 차원 (2D) LC-MS / MS 및 면역 친화 크로마토 그래피가 필요했습니다. 이러한 모든 방법들이 3-NT의 평가에서 진전을 보였지만 임상 적용에 필요한 민감성, 신뢰성 및 효율성을 달성 한 것은 없습니다. 무료 3-NT의 병리 및 임상 설정에서 산화 스트레스의 바이오 마커의 역할을 조사하기 위해, 우리는 높은 처리량 임상 적용 25 수 있도록, 간단하고 효율적 정확하고 정밀한하는 방법을 개발했다. 소형화 된 혼합 모드 양이온 엑시드유도체 화, 증발 및 2D-LC를 필요로하는 기존 방법에서 나타나는 단점을 우회하여 단일 추출에서 3-NT의 간단하고 효과적인 시료 정화 및 농축을 달성하기 위해 hange (MCX) 96-well 추출 마이크로 플레이트가 구현되었습니다. 0.01 % HCOOH가 첨가 된 액체 크로마토 그래피는 신속한 사이클 시간으로 향상된 신호 응답을 제공합니다. 선택성은 3-NT의 선택적 용리 및 3-NT 및 내부 표준 (IS) 모두에 대한 MRM 전이의 사용을위한 약한 NH 4 OAc 용출 용액의 적용을 통해 더욱 향상되었다. 기질 효과는 정량화를 위해 선호되는 13 C- 동위 원소 IS의 감소 된 양을 사용함으로써 보상되었다. 이 방법론의 출현과 함께 연구원 및 임상의는 임상 적 상태에서 3-NT의 역할을 검증하고 산화 스트레스의 영향을 더 탐구 할 수있을 것이다.

<table><tbody><tr><td>3-니트로-L-티로신</td><td>시그마</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-니트로-L-티로신-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기 금 소변</td><td>골든 웨스트 생물학적</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>오아시스 MCX 96-웰 &마이크로; 용출 플레이트</td><td>Waters</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 웰 수집 플레이트</td><td>Phenomenex&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 양극 프로세서</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS 울트라 CHROMASOLV 메탄올&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV 물</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석용 포름산</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>수산화 암모늄 용액</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP 프로필 컬럼</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple Quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>자세한 내용은 제조업체에 문의하십시오</td></tr>. <tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>자세한 내용은 제조업체에 문의하십시오</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td><td>/</td><td>비뇨기 크레아티닌 Jaff&eacute; Gen 2 method</td></tr><tr><td>LCMS 인증 12 x 32 mm 스크류 넥 바이알</td><td>Waters</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC 인증 12 x 32 mm 스크류 넥 총 회수 바이알</td><td>Waters</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 수송관</td><td>Phoenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine 전자 피펫</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS 밸런스&nbsp; &nbsp;</td><td>케네디 스케일스, Inc.</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서&nbsp;</td><td>번스테드 써몰린</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 lc-ms / ms 검출의 통합

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Free 3- nitrotyrosine (3-NT)은 산화 스트레스에 대한 가능한 바이오 마커로 광범위하게 사용되어 왔습니다. 3-NT의 증가 된 수준은 다양한 병리학 적 조건에서보고되었다. 그러나 기존의 방법은 3-NT의 낮은 내인성 수준을 안정적으로 측정하는 데 필요한 충분한 감도 및 / 또는 특이성이 결여되어 있으며 임상 적용에 너무 복잡합니다. 따라서, 3-NT의 수준을 정확히 정량화하고 병리학 적 조건에서 3-NT의 역할을 검증하기 위해서는 분석적 개선이 시급히 필요하다. 이 프로토콜은 비 침습성 바이오 마커로서 인간의 소변에서 3-NT의 신속하고 정확한 측정을위한 소형 고체상 추출 (SPE)과 결합 된 새로운 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS) 검출의 개발을 제시합니다 산화 스트레스. SPE는 96- 웰 플레이트를 사용하여 지루한 유도체 화 및 증발 단계없이 샘플 클린업 및 분석 물 농축을 결합함으로써 공정을 현저히 단순화시켰다, 용매 소비, 폐기물 처리, 오염 위험 및 전반적인 처리 시간 감소. SPE 용출 용액으로서 pH 9에서 25 mM 암모늄 아세테이트 (NH 4 OAc)를 사용함으로써 선택성이 실질적으로 향상되었다. 질량 분석법 신호 응답은 다중 반응 모니터링 (MRM) 전환의 조정을 통해 향상되었습니다. 펜타 플루오로 페닐 (PFP) 컬럼 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm)에서 첨가제로 0.01 % HCOOH를 사용하면 신호 응답이 2.5 배 향상되었고 전체 실행 시간이 7 분으로 단축되었습니다. 10 pg / mL (0.044 nM)의 정량 하한 (LLOQ)이 달성되어보고 된 분석법에 비해 현저한 민감도 향상을 나타냅니다. 이 간단하고 신속한 선택적이고 민감한 방법으로 24 시간 동안 2 장의 소변 샘플 (n = 192)을 처리 할 수 ​​있습니다. 현저하게 개선 된 분석 성능과 비 침습성 및 저렴한 소변 샘플링을 고려하면, 제안 된 분석법은 전임상 및 임상연구.

그림 1 은 3-NT가 최적화 된 LC 조건 하에서 구조적으로 유사한 다른 티로신 유사체로부터 완전히 크로마토 그래피 적으로 분리되어있어 이러한 과도한 화합물로 인한 용출 간섭을 제거하여 결과적으로 분석 선택도를 향상 시킨다는 것을 보여줍니다. 또한 MA 및 메탄올의 첨가제 인 0.01 % HCOOH를 유속 0.45 mL / min로 사용하는 구배 용출은 3-NT ( 즉 , 7 분의 처리 시간으로 3 분)의 신속한 용출을 가능하게합니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55778/55778fig1.jpg" /> 그림 1 : 표준 용액에서 다른 티로신 유사체로부터의 3-NT의...

혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

소형화된 고상 추출 및 LC-MS/MS 결합 분석법의 전반적인 목표는 임상 적용을 위해 인간 소변 내의 유리 3-nitrotyrosine을 정확하게 정량하는 것입니다. 유리 3-nitrotyrosine은 생성량 및 산화 스트레스의 바이오마커 역할을 합니다. 하지만 낮은 민감도와 선택성, 그리고 번거로운 시료 전처리 과정으로 인해 임상 적용을 위한 생물학적 응급 상황에서 3-nitrotyrosine을 정확하게 정량하는 것은 여전히 특별한 과제로 남아 있습니다.고감도 LC-MS/MS 상호작용 내에 효과적인 고상 추출을 통합한 이 기술을 통해, 구성 및 2차원 LC 없이도 인간 소변 내 낮은 농도의 내인성 3-nitrotyrosine을 신속, 특이적 및 정확하게 정량할 수 있습니다. 이 방법은 산화 스트레스 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 복합 염증 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다른 병리적 상태에도 적용될 수 있습니다. 3-nitrotyrosine 수치는 항산화제에 의해 감소될 수 있으므로, 이 기술의 응용 범위는 항산화 치료의 효과를 모니터링하는 것까지 확장될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 이전에 준비하여 해동한 소변 샘플, 표준 물질 및 QC 샘플을 볼텍싱하십시오.볼텍싱 후, 깨끗한 2 mL 96-웰 수집 플레이트의 32개 웰에 각 샘플과 표준물질을 250 µL씩 첨가합니다. 더블 블랭크 샘플 웰을 제외한 각 웰에 미리 준비한 내부 표준물질 작업 용액 50 µL를 첨가합니다. 그런 다음 더블 블랭크 샘플 웰에 0.01% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 50 µL를 첨가합니다.그 후, 0.1% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 250 µL를 웰에 추가합니다. 그런 다음 8채널 피펫을 사용하여 용액을 세 번 혼합하고 SPE 로딩 전까지 플레이트를 덮어둡니다. 다음으로, 혼합 모드 양이온 교환 96-웰 추출 마이크로플레이트와 수집 리저버를 양압 프로세서에 배치합니다.혼합 모드 양이온 교환 마이크로플레이트를 이용한 고상 추출을 통해 단일 추출 과정에서 3-nitrotyrosine의 시료 정제와 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 흡착제에 LC-MS 등급의 메탄올 200 µL를 흘려 추출 플레이트를 컨디셔닝합니다. 양압 프로세서의 압력 조절 노브를 돌려 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐르도록 낮은 양압을 설정하고, 필요에 따라 압력을 조절합니다.2% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 200 microliters를 흡착제에 흘려 평형화합니다. 8채널 파이펫을 사용하여, 미리 혼합된 각 시료의 전체 부피를 전처리된 추출 플레이트에 조심스럽게 로딩합니다. 양압 프로세서의 양압을 낮게 설정하여 혼합물이 흡착제를 통해 천천히 흐르도록 하며, 필요에 따라 압력을 조절합니다.그 다음, 2% formic acid가 포함된 LC-MS 등급의 물 200 µL를 흡착제에 흘려 웰을 세척합니다. 200 µL의 methanol과 물로 세척한 후, 양압 프로세서를 고압으로 설정하여 웰을 건조합니다. 웰이 건조되면 리저버를 깨끗한 2 mL 96-웰 수집 플레이트로 교체합니다.이제 25 mM 암모늄 아세테이트 솔루션 50 µL를 적용하여 추출 플레이트에서 잔류 분석물과 내부 표준물질을 천천히 용출시키십시오. 그 다음 5% 포름산이 포함된 LC-MS 등급의 물 50 µL를 추가하여 용출액을 중화하십시오. 3-nitrotyrosine의 용출을 위해 약한 암모늄 아세테이트 솔루션을 적용하면 선택성과 민감도를 상당히 향상시킬 수 있습니다.액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석을 준비하기 위해 8채널 피펫으로 샘플을 3회 혼합합니다. LC-MS/MS 장비를 설정한 후, LC 기울기 용리(gradient elution)를 통해 3-nitrotyrosine LC-MS/MS 분석법을 10분 동안 평형화합니다. 분석법을 평형화함으로써 LC 기울기가 초기 기울기 용리 상태로 평형을 이루게 됩니다.자동 시료 분취기의 온도는 4 °C로, 오븐 온도는 30 °C로 설정합니다. 소변 시료, 표준 물질 및 QC 시료를 포함하는 배치 리스트를 작성합니다. 그 후 준비된 시료를 주입하여 배치를 시작합니다.모든 주입을 완료한 후, 3-nitrotyrosine의 명목 농도 대비 3-nitrotyrosine과 내부 표준물질의 피크 면적 비율에 대한 선형 회귀 분석을 통해 10에서 2,500 pg/mL 범위의 표준 곡선을 작성하여 3-nitrotyrosine을 정량합니다. 마지막으로, 작성된 표준 곡선을 사용하여 나머지 모든 시료를 정량하고 QC 시료가 설정된 범위 내에 있는지 확인합니다. 인간 소변 시료의 LC 데이터는 최적화된 조건에서 3-nitrotyrosine이 구조적으로 유사한 다른 tyrosine 유사체들과 크로마토그래피적으로 분리됨을 보여주며, 이는 과량으로 존재하는 이러한 화합물들로 인한 공동 용출 간섭을 제거하여 결과적으로 분석의 선택성을 향상시킵니다.이중 공시료(double blank sample)의 다중 반응 모니터링 크로마토그램에서는 3-nitrotyrosine 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 전체 과정 동안 3-nitrotyrosine이 생성되지 않았음을 나타냅니다. 여기에는 건강한 개인의 3-nitrotyrosine 및 내부 표준물질에 대한 대표적인 다중 반응 모니터링 크로마토그램이 표시되어 있습니다. 3-nitrotyrosine 및 내부 표준물질의 머무름 시간에서 간섭 신호는 관찰되지 않았습니다.여기에 대표적인 표준 곡선이 나와 있습니다. 신호 대 잡음비가 3보다 큰 가장 낮은 농도로 정의된 검출 한계는 2 pg/mL로 결정되었습니다. 정량 한계 하한은 10 pg/mL로 결정되었으며, 이는 신호 대 잡음비가 10보다 크고 정밀도 및 정확도의 오차가 20% 이내인 가장 낮은 농도로 정의됩니다.미세 조정된 통합 분석법은 매트릭스 효과, 흡착제 사용량 및 폐기물 처리를 줄이면서 특이도, 민감도 및 처리량을 크게 향상시킵니다. 이 간단하고 신속한 분석법을 통해 소변 시료를 24시간 이내에 처리할 수 있습니다. 비침습적이고 저렴한 소변 채취의 장점을 고려하십시오.이 획기적으로 개선된 방법은 전임상 및 임상 연구에서 산화 스트레스 바이오마커로서 3-nitrotyrosine의 역할을 평가하는 데 매우 적합합니다.

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

향후 임상 응용을위한 타액 표본 추출을 고려 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브는 인간의 구강에 맞게 가공되었다. NanoLC-LTQ 질량 분석법에 의한 소화되지 않은 타액의 직접적인 분석은 큰 단백질과 높은 풍부한 단백질을 제거하고 낮은 풍부한 펩티드 더 감지하게 LLUF 프로브의 능력을 보여주었다.

롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

우리는 6 mm 직경 라운드-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 공기 샘플러 prefilters에서 잘라와 대기 단백질의 화학 수정 3-nitrotyrosine를 검색 하는 방법을 제시.

3-Nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

티로신 질산 단백질의 프로테오믹 프로파일링은 3-니트로티로신 변형의 낮은 풍부성으로 인해 도전적인 기술이었습니다. 여기에서 우리는 모델로 안지오텐신 II를 사용하여 니트로 펩티드 농축 및 프로파일링에 대한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 다른 시험관 내 또는 생체 내 시스템에 대해 확장될 수 있다.

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암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

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인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

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휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

배우세요 인간 소변에서 3-nitrotyrosine을 정량 분석하는 소형 고체상 추출 및 LC-MS/MS 방법을 활용한 산화 스트레스 바이오마커 연구. 이 기술은 임상 적용 및 항산화 치료 효과 모니터링에 활용됩니다.

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

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