Name: 유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 성인 마우스 중추신경계 대식세포 아집단을 유동세포계측법으로 분석하는 방법입니다. CD11B, CD45, CX3CR1, Tmem119 마커를 이용하여 미세아교세포와 단핵세포 유래 대식세포를 식별할 수 있습니다.

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이 작품은 Agence Nationale Pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), 협회 France Alzheimer 및 Bpifrance의 교부금으로 지원되었습니다. 우리 연구소는 Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie 및 &quot;Investissements d&#39; avenir&quot;ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) 프로그램도 지원합니다. CELIS 세포 배양 핵심 시설의 도움에 감사드립니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 ICM 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 다윈 프랑스 동물 동물위원회의 승인을 받았으며 프로토콜 01407.02로 보호됩니다. 1. 준비 <ol><li> 각 마우스에 다음을 결합하여 1.5 ML 튜브에서 소화 칵테일을 준비하십시오 : 1 ML 인산염 완충 식염수 (PBS); 13 wunsch / mL (원액), 최종 농도 1.6 wunsch / mL에서 123 μL 소화 효소 (물질 표 참조); 및 100 mg / mL (원액), 최종 농도 0.5 mg / mL에서 5 μL DNase I (물질 표 참조). </li></ol> 2. 관류 및 해부 <ol><li> 치사량의 pentobarbital (400 μg / mL에서 100 μL)로 마우스를 안락사하십시오. </li><li> 동물을 앙와위에 놓고 70 % 에탄올로 몸을 적시십시오. </li><li> xyphoid 프로세스 바로 아래의 미세 가위로 복부 피부를 잘라 흉부 캐비닛을 노출시킵니다.와이. </li><li> 횡격막을 절개하고 가슴을 노출시키기 위해 주둥이 방향에서 꼬리 방향으로 미세한 가위로 늑골의 측면을 잘라냅니다 (다른 장기 절단을 피하십시오). 좌심실 (LV)과 우심방 (RA)을 확인하십시오. </li><li> LV 내부에 25G 바늘이 달린 나비 카테터를 삽입하십시오. 미세 가위로 RA를 절개하고 혈류가 시작될 때 혈관에서 세포와 혈액을 제거하기 위해 20 mL PBS로 LV를 통해 10 mL / 분 유속으로 관류를 시작하십시오. 성공적인 관류는 혈액이 옮겨지면서 폐와 간이 희석되어 나타납니다. </li><li> 중간 가위로 동물의 목을 베십시오. 척추의 해부학적인 측면에서 복부 근육 조직을 절제하고 꼬리의 기저부에서 척추를 절단하여 척추를 정밀한 가위로 해부하여 체내에서 분리합니다. </li><li> 요추 측면에 PBS와 마운트 200 μL 피펫 팁을 포함하는 10 ML 주사기를 삽입척수를 제거하고 척수를 자궁 경부에 플러시하십시오. 참고 : 200 μL 피펫 팁은 가장 넓은 끝 (약 1 cm)에서 가위로 자르고 이전에 PBS로 채워진 10 mL 주사기에 단단히 삽입됩니다. </li><li> 두개골 위의 피부를 제거하고 포셉을 사용하여 뇌를 노출시킵니다. 두개골 바닥에 가위 날을 넣고 화살 봉합 후 두개골을 자릅니다. 작은 포셉을 절단 부위에 넣고 부드럽게 두개골을 들어 올리십시오. 마우스 머리에서 두뇌를 해부하고 후각 구근과 소뇌를 제거합니다. </li><li> 소화 칵테일 (단계 1.1에서) 1.128 ML PBS를 포함 1.5 ML 튜브에 뇌와 척수를 수집합니다. </li></ol> 3. 세포 해리 <ol><li> 작은 가위 ( 그림 1 )로 1-2 밀리미터 3 조각으로 1.5 ML 튜브 (단계 2.9)에서 뇌와 척수를 미세하게 자르십시오. </li><li> 인큐베이터에서 30 분 동안 다진 조직이 들어있는 1.5 ML 튜브를 품어5 % CO2로 37 ° C에서 건조시킨다. 참고 :이 단계에서 밀도 그래디언트를 준비하십시오. </li><li> 효소 반응을 중지 1.5 ML 튜브에 20 μL 0.5 M EDTA (재고 솔루션), 최종 농도 10 MM을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 5 ML 피펫으로 위아래로 pipetting하여 세포 현탁액을 확인하십시오. </li><li> 10 ML 주사기의 플런저를 사용하여 50 ML 튜브에 나일론 메쉬 (70 μm의 기공 크기)를 통해 세포 현탁액을 전달하십시오. </li><li> 20 ML 5 % 태아 소 혈청 (FBS) -PBS와 나일론 메쉬를 씻으십시오. </li><li> 실온 (18 ° C)에서 7 분 (300 XG) 동안 원심 분리기. 흡인으로 상징액을 버리고 다음 단계로 진행하십시오. 뜨는 물을 제거 할 때 매우 조심하십시오. 흡인 피펫으로 쉽게 흡입 할 수있는 펠릿을 방해하지 마십시오. </li></ol> 4. 밀도 구배 <ol><li> 밀도 그래디언트 매체에 10x PBS의 적절한 금액을 추가하여 밀도 기울기 매체의 재고 솔루션을 준비합니다. 참고 : 한 부분의 10X PBS를 9 부분 밀도 그 레이디 언트 매체에 추가하십시오. </li><li> 표 1에 설명 된대로 다른 비율에 대한 1x PBS로 주식 밀도 그래디언트 매체를 희석하십시오. </li><li> 4 ML 30 % 밀도 그래디언트 매체와 펠렛 (3.7 단계에서)을 Resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 튜브의 바닥에 파스퇴르 피펫을 놓고 천천히 37 % 밀도 그라디언트 매체의 4 ML. </li><li> 위에서 설명한대로 70 % 밀도 그라디언트 매체 4 ML을 추가합니다. </li><li> 실온 (18 ° C)에서 40 분 (800 XG) 동안 그라디언트를 원심 분리하십시오. 계기가 방해받지 않도록 원심 분리기가 최소 또는 전혀 브레이크가 걸리지 않도록하십시오. 참고 : 튜브가 계층화되어 나타납니다. 70 % -37 % 밀도 구배 계면에서 적층 된 세포는 단일핵화 된 면역 세포 (소교 세포 및 대 식세포 하위 집단); 상위 수준은 세포 파편과 myelin입니다 ( 그림 2 ). </li><li&gt; 전송 피펫을 사용하여 myelin의 층을 부드럽게 제거하십시오. </li><li> 깨끗한 15 ML 튜브에 macrophage subpopulations 세포를 포함하는 70-37 % 밀도 그라디언트 interphase 3-4 ML을 수집합니다. </li><li> PBS 15ml의 총 볼륨으로 세포를 3x 씻으십시오. 세포가 들어있는 밀도 구배 매체가 PBS로 적어도 세 번 희석되었는지 확인하고 &quot;on&quot;브레이크로 7 분 (500 xg, 4 ° C) 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 세포 라벨 또는 다른 기능 assays 1 ML PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법을위한 세포 라벨링 <ol><li> 플로우 cytometry 튜브에 세포 (단계 4.10)를 전송합니다. </li><li> 단계 4.10에서 얻은 각 세포 샘플에 고칠 수있는 죽은 세포 얼룩 시약 1 μL를 추가합니다. 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 5 분 (300 XG, 4 ° C) 2 ML PBS와 원심 분리기로 한 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 제거하고 세포 펠렛을400 μL PBS 1 % BSA, 0.1 % 아 지드. </li><li> 1 μg CD16 / CD32 항체를 100 μL의 세포에 첨가하여 Fc 수용체를 차단하십시오. 얼음에서 10-15 분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 세포 내 얼룩에 대한 세포 permeabilization에 대한 PBS 1 % BSA, 0.1 % azide 또는 PBS 1 % BSA, 0.1 % azide, 0.25 % 사포닌의 기본 항체 믹스를 준비합니다. </li><li> 1 차 항체 100 μL를 넣고 (2 배) 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다. 참고 : 최적의 결과를 얻으려면 실험을 수행하기 전에 모든 항체를 적정해야합니다. </li><li> 5 분 (300 XG, 4 ° C) 2 ML PBS와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 이 단계를 세 번 반복하십시오. </li><li> 일차 항체가 fluorophore에 직접 접합되지 않은 경우 보조 항체 100 μL를 추가하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 품어 둡니다. </li><li> 4시 300 XG에서 5 분 2 ML PBS와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오 ° C). 이 단계를 세 번 반복하십시오. </li><li> 수정빛으로부터 보호 된 실온에서 15 분 동안 100 μL 1 % PFA가있는 세포. 참고 :주의 : PFA는 유독합니다. 흄 후드에 넣고 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 4시 300 XG에서 5 분 PBS 2 ML 및 원심 분리기와 세포를 씻으십시오 ° C. 이 단계를 세 번 반복하십시오. </li><li> 200 μL PBS로 세포 펠렛을 Resuspend 및 흐름 cytometry 수집 및 분석 진행합니다. 그림 3 의 게이팅 전략을 따른다. </li></ol>

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</ol>

저자는 아무 것도 공개하지 않는다.

microglia와 MDM은 중추 신경계에서 서로 다른 기능과 표현형을 가지고 있으며 따라서 대 식세포 subpopulation의 확인과 분석은 신경계 질환 9 , 18 , 25 를 더 잘 이해하기 위해 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 두 마커 (CD11b 및 CD45)를 사용하여 유동 세포 계측법 분석은 각 하위 집단 사이의 구별을 허용합니다 ( 그림 3C ). 이 전략은 이전에 MDM의 경우 CCR2, 소교 세포의 경우 CX3CR1과 같은 특정 마커를 사용하고 Tmem119에 대한 항체를 사용한 최근 개발 된 접근법 ( 그림 3E - 3G )을 사용하여 검증되었습니다. 우리는 <sup cla...

미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 실질 조직 내성 대 식세포입니다. 그들은 두 가지 중요한 기능적 역할을합니다 : 면역 방어와 CNS 항상성 유지. 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 계속적으로 재생되는 MDM과 달리, 소구 세포는 배아 발달 중 뇌를 식민지로 만든 난황낭 (YS)에서 기원하는 조혈 전구 세포와 구별된다. 설치류에서 전사 인자 Myb는 모든 골수 유래 단핵 세포와 대 식세포의 발달에 중요한 역할을하지만, YS 유도 된 미세 아교 세포에 대해서는이 인자가 필요없고 분화는 전사 인자 PU.14에 의존한다. 건강한 CNS에서, 미세 아교 세포는 끊임없이 그들의 환경을 채취하는 역동적 인 세포입니다. sca침입하는 병원체 또는 조직 손상에 대한 육안 검사 및 측량 5 . 이러한 신호의 검출은 상해를 해결하기위한 경로를 시작합니다. microglia 신속하게 ramified 형태에서 amoeboid 하나, 다음 phagocytosis 및 프로 또는 항 염증성 cytokines 등 다양한 중재자의 릴리스 스위치. 따라서, 그들의 microenvironment에 따라, 활성화 된 microglia는 스펙트럼의 별개 프라이밍 상태 6을 얻을 수 있습니다. microglia는 근본적으로 많은 신경 장애의 발달과 진행에 영향을 미칩니다. 알츠하이머 병 (AD) 7 , 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 8 , 다발성 경화증 (MS) 9 또는 파킨슨 병 (PD) 10 의 설치류 모델에서, 소아 글 리아는 해로운 신경 독성 또는 행동을 유도하는 이중 역할을하는 것으로 나타났다 신경 보호적인 방식으로,n 특정 질병, 병기 및 질병이 전신 면역 부 7 , 8 , 9 , 10 , 11의 영향을 받았는지 여부. 상기 언급 된 질병에서 관찰 된 대부분의 중추 신경계 병변은 실질 세포 미세 소견뿐만 아니라 혈관 주위 및 수막 상피 세포뿐만 아니라 중추 신경계 침윤성 MDM을 포함하는 골수 세포의 이종 집단을 포함한다. 이러한 세포 유형은 손상 및 수리와 관련된 병리학 적 기전에 차별적으로 기여할 수있다 ( 7 , 12 , 13 , 14 , 15) . 이러한 질병 모델을 연구하는 연구자가 현재 직면 한 문제는 말초 단핵 세포와 대 식세포가 CNS에 침투하는지 여부를 확인하는 것이고, 그렇다면 dist이 세포에서 상주 microglia를 잉태하십시오. 실제로, 소교 세포는 매우 플라스틱입니다. 그들이 활성화되면, microglia는 일반적으로 말초 monocytes 및 macrophages에 의해 표현되는 마커를 다시 표현합니다. 따라서이 문제는 상주 소아 글로불린과 침윤 단핵구 및 대 식세포를 구분할 수있는 마커를 확인하는 데 달려있다. 면역 조직 학적 적용에 의한 뇌 조각에 대한 이들 집단의 차별은 특이 항체가 부족하기 때문에 제한적이다. 그러나, 유동 세포 계측법 분석은 여러 마커의 발현을 평가하고 세포 집단 (예 : 림프구, 대 식세포 / MDM CD11b + CD45 high 및 microglia CD11b + CD45 med )을 구별하는 효율적인 기술이며 세포 아군 16 , 17 , 18 . 이 프로토콜은최적화 된 효소 조직 해리 및 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 신경계 질환 모델에서 마우스 CNS 유래의 단핵구; 뿐만 아니라, 유동 세포 계측법을 사용하여 중추 신경계에서 미 글로리아 및 MDM 모집단을 구별하는 방법을 제공한다. 또 다른 접근법은 특정 항체 19 , 20 , 21에 접합 된 ​​자기 구슬을 사용하여 미엘린을 제거하고 세포를 정제하는 것입니다. 안티 - myelin 자기 구슬을 사용하여 myelin 제거는 더 비싸며 분리 된 세포의 생존력과 수율에 영향을 미칩니다 22 . 이 단계와 microglia의 다음 immunomagnetic 분리는 특정 면역 세포 인구의 추가 연구를 제한 21 , 22 . 이 절차는 질병 발달에서 대 식세포 하위 집단을 연구하는 쉬운 방법을 제공하며,대 식세포 표현형 및 활성화 상태에 대한 약물 효과 또는 유전자 변형을 결정한다.

<table><tbody><tr><td>5개월 된 생쥐</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL 연구 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>소화 효소</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I 소 췌장에서 추출</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>세포 여과기 크기 70 &micro; m 나일론</td><td>코닝</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>피스톤 주사기 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(1x) Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(10x) Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo 제외 Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액 30%</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 32% 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-S</td><td>주의 -독성</td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 쥐 안티 마우스 CD11b (클론 M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG2b K 아이소타입 제어 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 쥐 안티 마우스 CD45 (클론 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 쥐 IgG2b, &kappa; Isotype Control RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Mouse Fc Block</td></tr><tr><td>Fixable Dead Cell Stain Kits</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>마우스 CCR2 APC-conjugated 항체</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IgG2B APC 활용 동형, 대조군</td><td>R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>마우스 CX3CR1 PE 결합 항체</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>염소 IgG PE 결합 항체</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 집게</td><td>FS T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 가위</td><td>FS T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 겸자</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

수많은 연구가 중추 신경계 (CNS) 병리학에서 면역 세포, 특히 대 식세포의 역할을 입증했다. 중추 신경계에 두 가지 주요 대 식세포 개체군이있다 : (i) 중추 신경계의 상주 대 식세포이며 배아 발생 과정에서 난황낭 전구 세포에서 유래 된 미세 아교 세포 및 (ii) 단핵구에서 유래 된 대 식세포 (MDM) 질병 중 중추 신경계는 골수 선조 세포에서 유래한다. 각 macrophage subpopulation의 역할은 연구중인 병리학에 따라 다릅니다. 또한, 이러한 macrophage subpopulation에 사용되는 histological 마커 또는 구분 기준에 대한 합의가 없습니다. 그러나, 유동 세포 계측법에 의한 CD11b 및 CD45 마커의 발현 프로파일의 분석은 우리가 MDM (CD11b + CD45 high )으로부터 미 글 리아 (CD11b + CD45 med )를 구별 할 수있게한다. 이 프로토콜에서는 밀도 구배 원심 분리유동 세포 계측법 분석은이 CNS 대식 세포 하위 집단을 특성화하고 최근에 출판 한 것처럼 이들 세포가 나타내는 여러 마커를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 따라서,이 기술은 신경 질환의 마우스 모델에서 대 식세포의 역할에 대한 우리의 이해를 더할 수 있으며, 또한 이들 세포에 대한 약물 효과를 평가하는데 사용될 수있다.

밀도 구배 원심 분리 및 항체 염색 후, 세포를 유동 세포 계측기 (flow cytometer)상에서 획득하고 형태 학적 게이팅 전략을 사용하여하기와 같이 분석 하였다. 첫 번째 게이트는 이중 세포 ( 그림 3A )에서 단일 세포를 구별하기 위해 전방 산란 영역 (FSC-A) 대 전방 산란 - 높이 (FSC-H)로 정의되었다. 그런 다음 단일 세포를 FSC-A 대 Side Scattered-Area (SSC-A) 도트 플롯에서 상대 세포 크기와 세포 세분성을 기준으로 세포 파편과 각질 세포를 제외시켰다 ( 그림 3B ). MDM은 CD11b 및 CD45 마커의 발현 수준에 기초하여 동정되었다 ( 도 3C , 3D ). 마지막으로, 다른 표현 마커는 ...

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

이 실험의 전반적인 목표는 중추신경계(CNS) 내 대식세포 하위 집단에서 발현되는 다양한 마커를 평가하는 것입니다. 이 방법은 중추신경계 내 대식세포의 정체와 이들의 표현형이 무엇인지와 같이 신경면역학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고도로 정제된 다량의 대식세포 하위 집단을 분리할 수 있다는 점과 대식세포 하위 집단 세포 마커의 정량이 가능하다는 점입니다.먼저 미세 가위를 사용하여 검상돌기 바로 아래의 복측 피부를 절개하여 흉강을 노출시킵니다. 횡격막을 절개하고, 갈비뼈의 외측면을 꼬리쪽에서 머리쪽 방향으로 절개하여 심장을 노출시킵니다. 좌심실과 우심방을 확인한 후, 25 gauge 바늘이 달린 버터플라이 카테터를 좌심실에 삽입합니다.우심방에 절개창을 내고, 혈액이 흐르기 시작하는 즉시 카테터를 통해 20 milliliters의 PBS를 분당 10 milliliters의 속도로 관류하기 시작합니다. 관류가 성공적으로 이루어지면 혈액이 밀려나면서 폐와 간이 창백해집니다. 다음으로, 미세 가위를 사용하여 척주를 절개합니다.척주 복측의 복벽 근육을 절제하고, 꼬리 기저부에서 척추를 절단하여 척수를 수확한 상태로 제거합니다. 수정된 200 µL 피펫 팁이 장착된 10 mL PBS 주사기를 척주의 요수 부위에 삽입합니다. 그 후 경수 부위로 척수를 세척합니다.두개골 위의 피부를 제거하고, 가위 끝 하나를 두개골 기저부에 삽입합니다. 시상 봉합선을 따라 두개골을 절개합니다. 그런 다음 절개 부위에 작은 핀셋을 넣어 두개골 상단을 조심스럽게 제거합니다.마우스 머리에서 뇌를 적출하고 후각구와 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 1.128 mL의 소화 칵테일이 들어 있는 1.5 mL 튜브에 뇌와 척수를 넣습니다. 세포를 해리시키기 위해 작은 가위를 사용하여 뇌와 척수를 1~2 mm³ 크기로 미세하게 자른 뒤, 해당 조각들을 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 둡니다.배양이 끝나면 0.5 M EDTA 20 µL를 가해 소화를 중단시킨 후, 5 mL 피펫으로 부드럽게 트라이튜레이션(trituration)합니다. 결과물인 세포 현탁액을 70 µm 메쉬 스트레이너를 통해 50 mL 원심분리관에 거르며, 이때 10 mL 주사기 플런저를 사용하여 남아있는 뇌 또는 척수 조직을 부드럽게 으깹니다. 스트레이너를 5% FBS 및 PBS 20 mL로 헹굽니다.원심분리를 통해 여과된 세포를 수집합니다. 그 다음, 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 세포의 밀도 구배 분리를 위해, 30% 밀도 구배 배지 4 mL로 펠릿을 현탁시킨 후, 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.37% 밀도 구배 매질 4mL를 조심스럽게 층을 쌓고, 그 위에 70% 밀도 구배 매질 4mL를 37% 밀도 구배 매질 아래로 겹쳐 넣습니다. 튜브를 벤치탑 원심분리기로 옮겨 세포를 분리합니다. 미세아교세포와 대식세포는 70%와 37% 밀도 구배 층의 경계면에 위치하게 됩니다.튜브 내 층분리가 나타납니다. 상층의 myelin 층을 조심스럽게 제거한 후, microglia macrophage 중간층 3~4 mL를 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음 15 mL의 PBS로 면역 세포를 세 번 원심분리하여 세척하고, 마지막 세척 후 펠릿을 1 mL의 PBS에 재부유시킵니다.대식세포 하위 집단 마커 발현을 평가하기 위해, 세포를 5 mL 유세포 분석 튜브로 옮긴 후 고정 가능한 사세포 염색 시약 1 µL를 첨가하십시오. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분간 방치한 후, 2 mL의 PBS로 시료를 세척하고, 실험 분석 튜브당 400 µL의 fax buffer로 펠릿을 재현탁하십시오. 세포를 적절한 수의 5 mL 유세포 분석 튜브에 나누어 담으십시오.그 다음, 세포 100 µL당 1 µg의 CD 16 CD 32 블로킹 항체 칵테일을 사용하여 비특이적 FC 수용체 결합을 차단하며, 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 10~15분 동안 배양합니다. 이어서, 적절한 1차 항체 100 µL를 사용하여 세포를 라벨링하고, 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 2 mL의 PBS로 세포를 4회 세척합니다.그 다음, 빛이 차단된 얼음 위에서 적절한 2차 항체 100 µL를 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후, 앞서 시연한 것과 동일하게 PBS로 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 빛이 차단된 상온에서 1% 파라포름알데히드 100 µL에 펠릿을 부드럽게 재현탁하여 15분 동안 둡니다. 그런 다음 세포를 PBS로 4회 세척합니다.최종 펠릿을 200 µL의 신선한 PBS에 다시 현탁하고, 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 뇌 및 척수 유래 미세아교세포와 단핵구 유래 대식세포는 CD 11 B 및 CD 45 발현을 기준으로 식별합니다. CD 11 B 양성 CD 45 medium 미세아교세포의 CX3CR1 및 Tmem119 발현을 통해, 이 세포군을 CD 11 C 양성 CD 45 high 단핵구 유래 대식세포와 추가로 구별할 수 있습니다. 단핵구 유래 대식세포는 앞선 두 마커는 발현하지 않지만, CCR2는 발현합니다.밀도 구배 분리 후, 세포의 85~95%가 여전히 생존해 있습니다. 밀도 구배 분리 과정을 거치지 않으면 비대식세포 및 미엘린 파편의 존재로 인해 전방 및 측방 산란도(forward bi-side scatter) 플롯에서 대식세포 하위 집단을 식별할 수 없습니다. anti-Tmem119 항체가 인식하는 에피토프는 세포 내에 존재하므로, 이 중요한 미세아교세포 마커를 표지하기 위해서는 투과화 과정이 필요합니다.투과화(permeabilization)는 세포 수축을 유발하여, 전방 산란(forward scatter) 대비 측방 산란(side scatter) 분석 시 대식세포 하위 집단이 더 작게 보일 수 있음에 유의하십시오. 숙련된 경우, 이 기법을 적절히 수행한다면 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행할 때, 밀도 구배(density gradient)를 매우 세심하게 설정하는 것이 중요합니다.본 절차 이후, 대식세포 하위 집단 신호 전달 경로에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 rt-PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 신경계 질환 마우스 모델에서 대식세포 하위 집단의 활성화를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 유세포 분석법을 통해 대식세포 하위 집단에 대한 테스트를 수행하거나 이러한 관례를 따르십시오.파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

이 동영상은 생쥐의 눈에서 유리체강내 전달 후 형광 생체 입자의 미세아교세포 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석을 보여줍니다. 유세포분석법은 CD11b를 발현하는 살아있는 세포를 검출하고 녹색 형광을 보이는 식세포 미세아교세포를 Ly6C 발현 단핵구 및 Ly6G 발현 호중구를 포함한 다른 골수성 세포와 구별합니다.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

손상된 척수에서 미세아교세포(MG)와 말초 침투 대식세포(Mø)를 식별하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석법(FCM)을 사용하여 각각 M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø 및 M2-like Mø를 식별했습니다. 이 기술은 MG와 Mø의 역할을 이해하기 위해 다른 중추 신경계 질환에도 적용될 수 있습니다.

유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인

여기에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 신경면역 상호 작용을 자세히 검사할 수 있으며 다른 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 적용할 수 있어 뇌졸중 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

배우세요 성인 마우스 중추신경계 대식세포 아집단을 유동세포계측법으로 분석하는 방법입니다. CD11B, CD45, CX3CR1, Tmem119 마커를 이용하여 미세아교세포와 단핵세포 유래 대식세포를 식별할 수 있습니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

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