유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

이 실험의 전반적인 목표는 중추신경계 또는 CNS 내에서 대식세포 하위 집단에 의해 발현되는 다양한 마커를 평가하는 것입니다. 이 방법은 신경면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는데, 예를 들어 어지러움을 일으키는 중추신경계(CNS)를 시도하는 대식세포(duperry macrophage)와 대식세포에서 중추신경계(CNS)의 표현형은 무엇인지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대식세포 하위 집단의 많은 수의 분리와 대식 세포 하위 집단 세포 마커의 contification입니다.

먼저 가는 가위를 사용하여 xiphoid 돌기 바로 아래의 복부 피부를 잘라 흉강을 노출시키는 것으로 시작합니다. 횡격막을 절개하고 흉곽의 측면을 꼬리에서 꼬리 방향으로 잘라 심장을 노출시킵니다. 좌심실과 우심방을 확인한 후 25 가우지 바늘로 나비 카테터를 좌심실에 삽입합니다.

우심방을 절개하고 혈액이 흐르기 시작하자마자 분당 10ml의 속도로 카테터를 통해 20ml의 PBS를 분출하기 시작합니다. 성공적인 풍력은 혈액이 변위됨에 따라 폐와 간이 희어지는 것으로 나타낼 것입니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 척추를 절개합니다.

척추의 복부 쪽에 있는 복벽 근육 조직을 절제하고, 꼬리 기저부의 척추를 절단하여 척추를 채취하여 척추를 제거합니다. 변형된 200마이크로리터 피펫 팁이 장착된 PBS 10ml 주사기를 척추의 요추 쪽에 삽입합니다. 그런 다음 경추 쪽의 척수를 씻어냅니다.

두개골 위의 피부를 제거하고 가위 끝을 두개골 바닥에 삽입합니다. 시상 봉합사를 따라 두개골을 자릅니다. 그런 다음 작은 집게를 상처에 삽입하고 두개골 상단을 부드럽게 제거합니다.

쥐의 머리에서 뇌를 해부하고 후각구와 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 뇌와 척수를 1 포인트 1 2 2 8 밀리리터의 소화 칵테일이 들어있는 1 포인트 5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 세포를 해리하려면 작은 가위를 사용하여 뇌와 척수를 1-2입방밀리미터 조각으로 잘게 자르고 그 조각을 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 30분 동안 놓습니다.

배양이 끝나면 20 마이크로 리터의 영점 5 몰 EDTA로 소화를 중지 한 다음 5 밀리리터 피펫으로 부드럽게 분쇄합니다. 10ml 주사기의 플런저를 사용하여 70미크론 메쉬 스트레이너를 통해 생성된 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 필터링하여 남아 있는 뇌 또는 척수 조직을 부드럽게 침식합니다. 스트레이너를 5% FBS 및 PBS 20ml로 헹굽니다.

그리고 여과된 세포를 원심분리로 수집합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 세포의 밀도 구배 분리를 위해 펠릿을 30% 밀도 구배 배지 4ml로 현탁하고 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮겼습니다.

37% 밀도 구배 매체 4밀리리터 아래에 부드럽게 깔고, 37% 밀도 구배 매체 아래에 70% 밀도 구배 매체 4밀리리터를 놓습니다. 튜브를 벤치탑 원심분리기로 옮겨 세포를 분리합니다. 미세아교세포와 대식세포 세포는 70% 및 37% 밀도 구배층의 계면에 있을 것입니다.

튜브가 층화되어 나타납니다. 미엘린의 상층을 조심스럽게 제거한 후, 3-4 밀리리터의 미세아교세포(microglia macrophage) 계면층을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 15ml의 PBS에 3개의 원심분리기로 면역 세포를 세척하고 최종 세척 후 1ml의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

대식세포 하위 집단 마커 발현을 평가하기 위해 세포를 5ml 유세포 분석 튜브로 옮긴 다음 1마이크로리터의 고정 가능한 사세포 염색 시약을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 후 샘플을 2밀리리터의 PBS로 세척하고 실험 분석 튜브당 400마이크로리터의 팩스 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포를 적절한 수의 5ml 유세포 분석 튜브로 분할합니다.

그런 다음 세포 100 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램의 CD 16 CD 32 차단 항체 칵테일로 비 특이적 FC 수용체 결합을 차단하여 빛으로부터 보호 된 얼음에서 10-15 분 동안 배양합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 적절한 1차 항체로 세포에 라벨을 부착하여 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS 2ml로 세포를 4회 세척합니다.

그런 다음 100마이크로리터의 적절한 2차 항체를 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 첨가한 다음 방금 시연한 대로 PBS를 4회 세척합니다. 마지막 세척 후 펠릿을 100% 파라포름알데히드 1마이크로리터에 넣고 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 부드럽게 다시 매달립니다. 그런 다음 PBS에서 세포를 네 번 씻습니다.

200마이크로리터의 새로운 PBS에 최종 펠릿을 다시 현탁시키고 유세포 분석으로 세포를 분석합니다. 뇌 및 척수 유래 미세아교세포와 단핵구 유래 대식세포는 CD 11 B 및 CD 45 발현을 기반으로 식별됩니다. CD 11 B positive CD 45 medium microglial cell에 의한 CX3CR1 및 Tmem119의 발현은 이 세포 집단을 이러한 marker 중 어느 것도 발현하지 않지만 CCR2를 발현하는 CD 11 C positive CD 45 high monocyte-derived macrophage와 더욱 구별할 수 있게 합니다.

밀도 구배 분리 후에도 세포의 85-95%가 여전히 생존할 수 있습니다. 밀도 구배 분리가 없는 경우, 대식세포 하위 집단은 비대식세포 세포와 미엘린 파편이 존재하기 때문에 전방 양면 산점도에서 식별할 수 없습니다. 항-Tmem119 항체에 의해 인식되는 항원결정기는 세포 내이기 때문에 이 중요한 미세아교세포 마커의 표지를 위해 투과화가 필요합니다.

그러나 투과화는 세포 축소를 유도하여 대식세포 하위 모집단이 전방 산란 분석과 측면 산란 분석에서 더 작게 나타나게 합니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도했지만 밀도 그라디언스를 매우 신중하게 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 정량적 rt-PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 대식세포 하위 집단 신호 경로에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 신경 질환의 마우스 모델에서 대식세포 하위 개체군의 활성화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 검사를 수행하거나 유세포 분석을 통해 대식세포 하위 집단으로 이 전통을 따라야 합니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.