유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 원발성 쥐 망막 신경절 세포의 풍부하고 균질한 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 노화 집단과 망막 퇴행성 질환 집단에서 시력 저하의 기저에 있는 메커니즘에 대한 망막 신경절 세포 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 농축된 1차 쥐 망막 신경절 세포의 분리를 위해 빠르고, 눈에 띄고, 재현 가능하며, 표준화된 프로토콜을 제공할 수 있다는 것입니다.

당시 제 연구실의 대학원생이자 이 연구의 제1저자였던 수마나 친탈라푸디(Sumana Chintalapudi)가 저널 클럽에서 크리슈나 머트헤돌(Krishna Murtheadol)의 2013년 논문을 발표했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 그들의 연구는 원래 불멸의 쥐 망막 신경절 세포주(mormortalized rat retinal ganglion cell line)로 생성된 망막 신경절 세포주(RGC five cell line)가 다음과 같다는 것을 명확하게 보여주었습니다. 더 이상 쥐 기원이 아니었고 RGC 표현형을 가지고 있지도 않았습니다. 이 문제로 인해 우리 연구실을 포함한 시력 연구 커뮤니티가 사용할 수 있는 자원에 큰 격차가 생긴다는 것이 명백해졌습니다. Sumana와 저는 Dr. Morales-Tirado 박사에게 연락을 취했고, 우리 셋은 함께 살아있는 고농축 망막절세포를 분리하는 새로운 방법을 개발했습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이 방법의 목표가 일차 세포로 배양되거나 세포주로 불멸화될 수 있는 살아있고 고도로 농축된 세포 집단을 분리하는 것이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 때문에 격리하려는 세포가 손상되지 않도록 매우 조심해야 합니다. 또한 세포 분류 방법의 매개변수는 분리하려는 특정 세포에 맞게 조정되어야 합니다.

두 방법 모두 특별한 기술이 필요합니다. 절차를 시연하는 사람은 Jablonski 박사 연구실의 연구원인 Xiang Di Wang 박사와 제 연구실의 박사 후보생인 Zach Goldsmith 씨입니다. 눈을 적출하려면 먼저 눈의 구체 아래에 집게를 삽입합니다.

시신경을 잡고 위로 당깁니다. 지구는 시신경이 손상되지 않은 상태로 적출됩니다. 얼음 위에 PBS 바이알에 눈을 넣고 다른 쪽 눈을 적출합니다.

모든 눈을 채취하면 해부 현미경으로 새 PBS가 담긴 페트리 접시에 한쪽 눈을 넣고 집게를 사용하여 시신경 기저부의 지구본을 조심스럽게 잡습니다. 날카로운 30게이지 바늘을 사용하여 각막에 구멍을 뚫어 수액이 배출되도록 하여 집게로 눈을 더 쉽게 잡을 수 있도록 합니다. 집게로 각막을 잡고 가위를 사용하여 각막 조직을 작게 절개하고 집게를 사용하여 각막과 공막을 부드럽게 벗겨냅니다.

지구본이 반쯤 벗겨지면 집게를 사용하여 망막과 수정체를 굴립니다. 생물 안전 캐비닛에 PBS와 1%FPS가 들어 있는 작은 40mm 페트리 접시에 망막을 놓고 새 PBS와 FBS로 망막을 세 번 세척합니다. 모든 눈을 씻은 후 PBS와 FBS를 적신 멸균 70미크론 나일론 여과기에 최대 12개의 망막을 놓고 원을 그리며 10ml 주사기 플런저의 뒤쪽 끝으로 망막을 부드럽게 침식합니다.

모든 세포가 해리되면 스트레이너를 폴리프로필렌 수집 튜브 위에 놓고 P1000 피펫을 사용하여 스트레이너를 통해 세포를 수집 튜브로 여과합니다. PBS와 FBS로 스트레이너를 헹구고 세척액을 수집 튜브에 모읍니다. 충분한 PBS와 FBS를 추가하여 최종 부피를 망막당 최대 1ml의 용액으로 가져오고 원심분리로 세포를 수집합니다.

그런 다음, 면역 표지를 즉시 수행해야 하는 경우 PBS plus FBS에 5개의 망막 농도당 1ml의 매체로 펠릿을 재현탁합니다. 또는 신경 세포 배지에 재현탁한 세포를 수평 위치에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 망막 세포를 면역 라벨링하려면 망막 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 팩스 튜브에 50마이크로리터의 새 PBS와 FBS에 재현탁합니다.

레이블이 지정되지 않은 음성 대조군을 위해 여섯 번째 셀까지 5 곱 10을 따로 둡니다. 다음으로, 실온에서 10분 동안 6번째 세포에 10회당 1마이크로리터의 항 마우스 CD 16 32 항체로 각 튜브의 비특이적 FC 수용체 결합을 차단합니다. 차단 배양이 끝나면 부드러운 피펫팅으로 관심 항체 칵테일을 세포에 첨가하여 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS와 FBS의 공식 리터 최종 부피로 세포를 두 번 세척합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 적절한 2차 항체로 세포를 라벨링한 다음 방금 시연한 대로 PBS와 FBS를 두 번 세척합니다. 세포 계수를 위해 펠릿을 새로운 PBS 및 FBS에 재현탁시킵니다.

보정을 조정하려면 폴리스티렌 마이크로스피어 3방울을 플로라당 하나의 멸균 팩스 튜브에 넣고 각 튜브에 각 플로라포 1마이크로그램을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 미세구를 배양합니다. 그런 다음 3ml의 PBS 및 FBS로 미세구를 세척하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

250마이크로리터의 PBS 및 FBS에 마이크로스피어 펠릿을 재현탁시키고 라벨링되지 않은 샘플 튜브를 유세포 분석기에 로드합니다. 유세포 분석기 소프트웨어에서 experiment, compensation setup 을 선택하고 compensation controls를 생성합니다. 표시된 목록에서 특정 컨트롤에 대한 식물을 추가하고 확인을 클릭합니다. 전방 산란광과 측면 산란광을 확인하고 초기 모집단을 게이트합니다.

그런 다음 음극 대조 튜브를 세포 분석기에 설치하고 로드를 클릭합니다. 관심 모집단 또는 P1이 표시되는지 확인하고 모집단을 선택합니다. P1 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보상 계산을 선택합니다.

그런 다음 데이터 기록을 클릭합니다. 녹음이 완료되면 unload를 클릭하여 튜브를 제거하고 다음 제어 튜브를 로드하여 보정 컨트롤을 조정합니다. 모든 대조군 샘플이 기록되면 첫 번째 실험 튜브에 대한 전방 대 측면 산점도를 생성하고 P1 모집단을 게이트합니다.

다음으로, side scatter height versus side scatter width pseudo color plot을 열고 단일 셀을 게이트합니다. 단일 셀을 사용하여 전방 산포 높이 대 전방 산포 너비 플롯을 만들고 게이트를 만들어 더블릿을 제외합니다. 그런 다음 CD48 대 CD90.2 의사 색상 플롯을 생성하고 CD90.2 양성 CD48 음성 세포를 게이트하여 단핵구를 제거한 다음 CD57 대 CD15 의사 색상 플롯을 사용하여 무축삭 세포 오염 물질을 제거합니다.

이제 sort layout 시트에서 샘플에 대해 수집할 모집단을 정의하고 셀을 정렬합니다. 분류가 끝나면 2.5 곱하기 10에서 네 번째 세포 분취량을 사용하여 분리된 세포 집단의 순도를 확인합니다. 세포 여과기에서 망막을 맞물린 후, 세포 분리 절차 중 축삭 절개술로 인해 망막 신경절 세포가 시그니처 형태를 잃었음에도 불구하고 여러 개의 내부 망막 세포를 시각화할 수 있습니다.

고전적인 dye one positive CD48 negative surface phenotype은 쥐 망막 신경절 세포를 식별하고 분리하는 데 충분하지 않은데, 이러한 세포는 무축삭, 뮬러, 양극성, 수평 광 수용체 및 망막 색소 상피 세포와 관련된 유전자를 발현하기 때문입니다. 분류된 세포는 또한 synuclein gamma, BRN3A, TUJ1 및 RBPMS와 같은 망막 신경절 세포와 관련된 세포 내 마커를 발현하며, 마커의 세포 내 국소화는 이미징 유세포 분석을 통해 추가로 확인됩니다. 분류된 세포 중 일부는 체외 세포 배양 후 망막 신경절 세포 형태를 나타내기 시작합니다.

또한, 고도로 농축된 분류된 세포 집단에 대한 정량적 PCR 분석은 망막 신경절 특이적 세포 내 마커를 코딩하는 유전자가 몇 배 증가했음을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 현탁액을 멸균 상태로 유지하고, 세포 현탁액에서 FC 수용체를 차단하고, 항체의 비특이적 결합을 피하고, 세포 분류 세부 사항 또는 전략을 세포 분류기 작업자와 논의하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 QPCR과 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 발현 프로파일링에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 세포 분류기와 같은 특수 장비를 작동하려면 고도로 전문화된 작업자가 필요하다는 것을 잊지 마십시오. 개발 후, 이 기술은 시력 분야의 연구자들이 망막 신경절 세포의 생존 및 사멸 메커니즘을 이해하는 데 도움을 주고 시력 보존을 위한 새로운 치료법을 개발할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후, 원발성 쥐 망막 신경절 세포의 농축된 균질한 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.