Name: 유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 유동 세포 계측법을 이용한 일차 쥐 망막 신경절 세포(RGCs) 분리 방법으로, 시력 퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 표준화된 기술입니다.

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저자는 기술 비디오 지원을 위해 미생물학, 미생물학 및 생화학 분야의 선임 일러스트 레이터 Tim Higgins 씨에게 감사드립니다. Matthew W. Wilson 박사와 Jablonski 및 Morales-Tirado 연구소의 토론에 도움을 주셨습니다. 이 작품은 Alcon Research Institute의 Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T)의 지원을 받았다. Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), 국방부 육군 의학 연구 및 재료 명령 (VMM-T), 실명 예방을위한 연구로부터의 무제한 보조금.

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

FACS는 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 다른 단리 방법으로는 면역 주사, 자성 비드 및 보체 고정 고갈이 있습니다. 이러한 다른 방법론에 비해 FACS의 장점은 다양한 강도의 강도를 가진 세포 표면 마커의 동시 식별에 기반합니다. 분자의 형광 강도는 단백질 발현 양에 비례합니다. 지금까지 RGC의 분리는 사용 된 격리 방법에 관계없이 Thy1 (CD90) 양성 및 CD48 음성성 15 , 16 , 22 , 34 에 단독으로 기초를 두었습니다. 최근에 Thy1 + CD48 neg 표현형이 RGC 세포 내 마커를 발현하는 세포의 균질 집단을 분리하는데 충분하지 않음이 밝혀졌습니다 23 . RGC 개체의 확인은 격리에 ...

RGC는 말단 분화 된 뉴런이므로 일차 세포가 실험에 필요합니다. 일차 생쥐 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리 및 농축을위한 프로토콜의 개발은 시험 관내에서 RGC 건강 및 변성의 기전을 밝히는 데있어 기본적이다. 이것은 RGC 기능을 촉진하고 사망을 최소화 할 수있는 잠재적 인 치료법을 개발하려는 연구에 특히 중요합니다. RGC의 퇴행은 녹내장, 당뇨 망막 병증 및 정상 노화와 같은 망막 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. RGC 소실의 원인이되는 특정 세포 기전이 불분명하지만 일련의 위험 요소가 확인되었습니다. 시신경 머리 1 , 2 , 3 에서 산소가 부족하면 RGC가 사망하고 4 , 흥분제와 i의 활성화 사이의 항상성의 교란으로 작용합니다개별 RGC 5,6 내의 억제 수용체. 일련의 과제는 심층 연구를 위해 이러한 세포의 사용에 대한 진전을 방해합니다. 첫째, 쥐 망막에 존재하는 RGC의 수가 적습니다. RGCs는 총 망막 세포 7 , 8 , 9 의 1 % 미만을 차지합니다. 둘째, 대부분의 RGC 특이적인 마커는 세포 내 단백질 10 , 11 , 12 입니다. 이러한 마커를 기반으로 한 선택은 세포를 비 생존 가능 상태로 남겨 두어 다운 스트림 기능 분석을 배제합니다. 마지막으로, 현재 사용 가능한 프로토콜은 길고 표준화가 부족합니다 13 , 14 . 조기 RGC 격리 프로토콜은 면역 주사 방법에 기반을 두었습니다. Barres et al. 15 명 고전적인 면역 반응을 적응시켰다.anning 기술을 사용하여 세포 표면 마커 인 항 - 흉선 세포 항원 (Thy1)에 면역 반응을 일으키는 양성 선별 이전에 망막 세포에서 단구 및 내피 세포를 배제한 두 번째 단계를 추가했다. 몇 년 후, 홍 외 ( Hong et al. 셀 구분 전략과 결합 된 자기 비드 분리 기술을 통해 고순도의 RGCs를 분리합니다. 자성 비드의 사용은 여전히 ​​많은 과학적 응용 분야에서 사용되고 있습니다. 함께, 자기 구슬 및 유동 세포 계측법 프로토콜은 분리 된 세포의 순도를 향상시켰다. 그러나, 이러한 정제 시스템은 해리 된 망막으로부터 쥐 RGC를 단리하기 위해 아직 표준화되지 않았다. 유동 세포 계측법은 세포 현탁액의 광학 및 형광 특성을 측정하는 강력한 분석 방법입니다. 세포는 높은 수준의 감도로 정량적으로 및 질적으로 분석되어 세포 집단에 대한 다차원 분석을 제공한다ation. 세포 분별은 두 가지 주요 물리적 특성, 즉 세포 크기 또는 표면적 및 입상 성 또는 내부 복잡성에 기초합니다. 유사한 여기 파장 및 상이한 방출을 갖는 형광색으로 표지 된 항체를 조합함으로써 다차원 분석을 수행 할 수있다. 유세포 분석은 빠르고, 재현성 있고, 민감합니다. Multitpe 레이저는 유동 세포 계측법에 의한 단일 세포의 다차원 분석을 훨씬 더 허용합니다. 따라서, 그것은 세포 표본의 연구를위한 매력적인 방법론입니다. Fluorescence activated cell sorting (FACS)은 유동 세포 계측법으로 확인 된 다차원 적 표현형 차이를 이용하여 개개의 세포를 별개의 하위 집단으로 분류합니다. 지난 10 년 동안 다중 표면 및 세포 내 단백질이 뉴런을 포함한 세포 선택을위한 잠재적 바이오 마커로 확인되었습니다. 쥐에서 RGC를 분리하려고했던 초기 연구는 Thy1을 신경절 세포로 사용했습니다마커. 불행히도 Thy1은 CD90으로, 다른 설치류 종 18 , 19 , 20에 여러 개의 isoform을 가지고 있으며 여러 망막 세포 유형 19 , 20에 의해 발현되어 RGC의 비 특이성 마커가됩니다. 또 다른 표면 마커 인 CD48은 대 식세포와 소교암을 포함하여 망막의 단핵 세포 집단에서 발견됩니다. 이 두 가지 표면 마커를 사용하여 변형 된 RGC 시그니처 Thy1 + 및 CD48 네거티브 세포가 개발되었습니다 ( 15 , 16 , 21 , 22) . 불행하게도,이 두 가지 선택 기준은 고도로 농축 된 RGC 개체군을 선택하기에 충분하지 않습니다. 이러한 충족되지 못한 요구를 해결하기 위해 다층 양성 및 음성 선택 기준에 기반한 유동 세포 계측 프로토콜이 개발되었습니다1 차 쥐 RGC를 풍부하게하고 정제하기 위해 알려진 세포 표면 마커.

<table><tbody><tr><td>안티 마우스 CD15 PE</td>, <td>BioLegend</td><td>125606</td><td>클론, MC-480</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD48, PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>클론 HM48-1</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD57</td><td>시그마 알드리치</td><td>C6680-100TST</td><td>클론 VC1.1</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>클론 30-H12</td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 421 염소 안티 마우스 IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>클론 Poly4053</td></tr><tr><td>정제된 안티-마우스 CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III 블록, 클론 93</td></tr><tr><td>좀비 아쿠아&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Live cell/ Dead cell discrimination</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>U.S. origin</td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Multi-species Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>배양 전에 배지에 혈청을 첨가하십시오.</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10010049 식염수 해</td></tr><tr><td>부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ-PT 모델</td><td>스테레오 현미경</td></tr><tr><td>Sorvall 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>모든 원심분리 RT Base Plate &ndash</td></tr><tr><td>; Dissection Pan</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>왁스 플레이트도 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>집게</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; 인치</td></tr><tr><td>아이리스 가위, 직선</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; 인치</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>폴리프로필렌 튜브</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>폴리 프로필렌 튜브</td></tr><tr><td>BD FACS 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>폴리 프로필렌 튜브</td></tr><tr><td>40mm 접시</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>조직 배양 처리</td></tr><tr><td>70 &mu; m 나일론 스트레이너</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>멸균</td></tr><tr><td>40 &mu; m 나일론 여과기</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>멸균</td></tr><tr><td>&nbsp; BD 10 mL 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>일회용 주사기 (바늘 없는</td></tr> 유<tr><td>봉</td>) <td>MidSci</td><td>PEST</td><td>멸균</td></tr><tr><td>Wheaton 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>라이너 없음</td></tr><tr><td>BD 30 G 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1인치</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line 유리 계수 챔버</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>혈액계</td></tr><tr><td>Gibco Trypan blue 0.4% 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>15250061 생존력 염료</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS 플로이드 세포 이미징</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>447113 20X 대물렌즈를 사용한 형광 이미징</td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>70% 에탄올을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS 피펫</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS 피펫</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS 피펫</td></tr><tr><td>랙 LTS 1000 mL &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Blue Rack 멸균 팁</td></tr><tr><td>랙 LTS 250 mL &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Green Rack 멸균 팁</td></tr><tr><td>랙 LTS 20 mL &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>레드 랙 멸균 팁</td></tr><tr><td>FACSAria II 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>LSR II Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>망막 색소 상피 세포</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>House keeping gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>광수용체</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm01219406_m1 Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>양극성, 무축삭</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>망막 신경절 세포</td></tr><tr><td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>무축삭</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm02343791_m1 망막 신경절 세포</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>광수용체</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm00504133_m1 망막 색소 상피 세포</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm00433662_m1 Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Retinal Ganglion Cells</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Retinal Ganglion Cells</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr>, <tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td>, <td>qPCR 시약</td></tr><tr><td>miRNeasy 미니 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA Isolation</td></tr><tr><td>, SuperScript, VILO cDNA 합성 키트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA 합성</td></tr>, <tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>사전 증폭 단계</td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>고정 / 투과 화 완충액</td></tr><tr><td>BD Perm / Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>투과 용액</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>세포 내 항체</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>세포 내 항체</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>세포내 항체</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>세포 내 항체</td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (rgcs)의 분리

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

신경 퇴행성 질환은 종종 영향을받는 사람들에게 치명적인 영향을 미칩니다. 망막 신경절 세포 (RGC)의 소실은 정상적인 노화뿐만 아니라 당뇨 망막 병증 및 녹내장을 비롯한 여러 질병에 영향을 미친다. RGC의 중요성에도 불구하고 RGC는 지금까지 부분적으로 망막의 다양한 세포 중 일부만으로 구성되어 있기 때문에 지금까지 연구하기가 극도로 어려웠습니다. 또한, 현재의 분리 방법은 세포 내 마커를 사용하여 비 생존 세포를 생성하는 RGC를 확인합니다. 또한 이러한 기술에는 긴 격리 프로토콜이 필요하므로 RGC를 얻고 분리하기위한 실용적이고 표준화 된 신뢰할 수있는 방법이 부족합니다. 이 연구는 양성 및 음성 선택 기준 모두에 근거한 프로토콜을 사용하여 생쥐 망막에서 주요 RGC를 분리하는 효율적이고 포괄적이며 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 장래의 RGC에 대한 연구를 허용하며,신경 퇴행성 질환에서 기능성 RGC의 손실로 인한 시력 감소.

<html> RGC에 대한 심층적 인 연구는 저주파수와 격리를위한 강력하고 표준화 된 방법론의 부족을 비롯한 여러 요인으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 그림 1 은 망막 격리에 사용 된 방법을 보여줍니다. 탈핵 절차의 변형은 탈핵이 생체 실험 27의 일부인 경우와 같은 분석 유형을 기반으로합니다. 이 프로토콜에서 핵 제거는 안락사 마우스에서 수행됩니다. 그림 1A - B 에서 볼 수 있듯이, 겸자는 눈 아래에 배치하고 최소한의 출혈을 일으키고 손상되지 않은 시신경을 가진 안구를 제거하기 위해 위로 잡아 당깁니다. 다른 마우스 쥐에서 RGC의 수에 차이가 있으며, 특히...

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

이 절차의 전반적인 목표는 농축된 균질한 일차 생쥐 망막 신경절 세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 고령 인구 및 망막 퇴행성 질환 인구에서 시력 저하의 기저 메커니즘에 관한 망막 신경절 세포 분야의 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 농축된 일차 생쥐 망막 신경절 세포 분리를 위한 빠르고, 시각적이며, 재현 가능하고 표준화된 프로토콜을 제공할 수 있다는 점입니다.당시 제 실험실의 대학원생이자 이 연구의 제1 저자인 Sumana Chintalapudi가 저널 클럽에서 Krishna Murtheadol의 2013년 논문을 발표했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 해당 연구에서는 불멸화된 쥐 망막 신경절 세포주로 처음 생성된 RGC five 세포주가 더 이상 쥐 유래가 아니며 RGC 표현형도 가지고 있지 않음을 명확히 보여주었습니다. 저희는 이러한 문제가 저희 실험실을 포함하여 시각 연구 커뮤니티에서 사용할 수 있는 리소스에 큰 공백을 남겼다는 점을 알게 되었습니다. Sumana와 저는 Morales-Tirado 박사에게 연락했고, 세 사람이 함께 살아있는 고순도의 RGC를 분리하는 새로운 방법을 개발했습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 본 방법의 목적이 일차 세포로 배양하거나 세포주로 불멸화할 수 있는, 생존력이 높고 고도로 농축된 세포군을 분리하는 것이기 때문입니다. 따라서 분리하고자 하는 세포가 손상되지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 또한, 세포 분리 방법의 파라미터는 분리하려는 특정 세포에 맞게 최적화되어야 합니다.두 방법 모두 특수한 기술이 필요합니다. 절차 시연은 Jablonski 박사 연구실의 연구원인 Xiang Di Wang 박사와 본인 연구실의 박사 과정생인 Zach Goldsmith 씨가 맡아줄 것입니다. 안구를 적출하려면, 먼저 포셉을 안구 하단으로 삽입하십시오.시신경을 잡고 위로 당깁니다. 시신경이 손상되지 않은 상태로 안구가 적출될 것입니다. 적출한 눈을 얼음 위에 놓인 PBS가 든 바이알에 넣고, 반대쪽 눈도 적출합니다.모든 안구를 수집한 후, 해부 현미경 하에서 신선한 PBS가 담긴 페트리 접시에 안구 하나를 놓고, 핀셋을 사용하여 시신경 기저부의 안구를 조심스럽게 잡습니다. 날카로운 30 gauge 바늘을 사용하여 각막을 천자하여 방수를 배출시키면 핀셋으로 안구를 잡기가 더 수월해집니다. 핀셋으로 각막을 잡은 상태에서 가위로 각막 조직에 작은 절개창을 내고, 핀셋을 이용하여 각막과 공막을 부드럽게 박리합니다.안구를 절반 정도 벗겨낸 후, 핀셋을 사용하여 망막과 수정체를 굴려 꺼냅니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 PBS와 1% FBS가 담긴 작은 40 millimeter 페트리 접시에 망막을 넣고, 매 세척 시마다 신선한 PBS와 FBS 혼합액으로 망막을 3회 세척합니다. 모든 안구의 세척이 완료되면, PBS와 FBS로 적신 멸균 70 micron 나일론 스트레이너 위에 망막을 최대 12개까지 올리고, 10 milliliter 주사기 플런저의 뒷부분을 사용하여 원을 그리듯 부드럽게 망막을 으깹니다.모든 세포가 해리되면 거름망을 폴리프로필렌 수집 튜브 위에 놓고 P1000 피펫을 사용하여 세포를 거름망을 통해 수집 튜브로 여과합니다. 거름망을 PBS와 FBS로 헹구어 세척액을 수집 튜브에 모두 모읍니다. 망막당 용액의 최종 부피가 1 mL가 되도록 PBS와 FBS를 충분히 추가하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다.그 후, 면역 표지를 즉시 수행할 예정이라면 펠렛을 망막 5개당 배지 1mL 농도의 PBS 및 FBS 혼합액에 재현탁합니다. 또는 신경 세포 배지에 재현탁한 세포를 4°C에서 수평 상태로 하룻밤 동안 배양합니다. 망막 세포의 면역 표지를 위해, 망막 세포 현탁액을 원심 분리한 후 펠렛을 fax 튜브에 담긴 50 µL의 신선한 PBS 및 FBS 혼합액에 재현탁합니다.라벨링하지 않은 음성 대조군을 위해 5 × 10⁶개의 세포를 따로 떼어둡니다. 다음으로, 1 × 10⁶개의 세포당 1 µL의 anti mouse CD 16 32 항체를 사용하여 각 튜브의 비특이적 FC 수용체 결합을 실온에서 10분 동안 차단합니다. 차단 배양 후, 원하는 항체 칵테일을 세포에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 빛이 차단된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.그 다음 PBS와 FBS 혼합액으로 세포를 두 번 세척합니다. 빛이 차단된 얼음 위에서 적절한 2차 항체를 이용하여 세포를 30분 동안 추가로 라벨링한 후, 앞서 시연한 것과 같이 PBS와 FBS 혼합액으로 두 번 세척합니다. 세포 수를 측정하기 위해 펠릿을 신선한 PBS와 FBS에 재부유시킵니다.보정을 조정하려면 각 florafor당 하나의 멸균 fax 튜브에 폴리스티렌 미세구체 세 방울과 해당 florafor 1 µg을 각각 추가합니다. 빛이 차단된 실온에서 미세구체를 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 3 mL의 PBS 및 FBS로 미세구체를 세척하고 상청액을 조심스럽게 제거합니다.마이크로스피어 펠릿을 250 µL의 PBS 및 FBS에 재현탁하고, 라벨링되지 않은 샘플 튜브를 유세포 분석기에 로드합니다. 유세포 분석기 소프트웨어에서 experiment, compensation set up을 선택하고 compensation controls를 생성합니다. 표시된 목록에서 florafor 특정 컨트롤을 추가하고 OK를 클릭합니다. 전방 산란광(forward scattered light)과 측방 산란광(side scattered light)을 확인하고, 초기 세포군을 게이팅(gate)합니다.그런 다음 음성 대조군 튜브를 사이토미터에 설치하고 load를 클릭합니다. 관심 세포군 또는 P1이 표시되는지 확인하고 해당 세포군을 선택합니다. P1 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보정 계산(calculate compensation)을 선택합니다.그런 다음 데이터 기록(record data)을 클릭하십시오. 기록이 완료되면 언로드(unload)를 클릭하여 튜브를 제거하고, 보정 컨트롤을 조정하기 위해 다음 컨트롤 튜브를 로드하십시오. 모든 컨트롤 샘플의 기록이 완료되면, 첫 번째 실험 튜브에 대한 전방 산란(forward scatter) 대 측방 산란(side scatter) 플롯을 생성하고 P1 집단을 게이팅(gate)하십시오.다음으로, side scatter height 대 side scatter width 의 pseudo color plot을 열고 단일 세포(single cells)를 게이팅합니다. 단일 세포를 이용하여 forward scatter height 대 forward scatter width plot을 생성하고, 더블렛(doublets)을 제외하도록 게이팅합니다. 그런 다음 CD48 대 CD90.2 pseudo color plot을 생성하여 CD90.2 양성 및 CD48 음성 세포를 게이팅함으로써 단핵구(monocytes)를 제거하고, 이어서 CD57 대 CD15 pseudo color plot을 통해 아마크린 세포(amacrine cell) 오염물을 제거합니다.이제 정렬 레이아웃 시트에서 샘플로 수집할 세포군을 정의하고 세포를 정렬하십시오. 정렬이 끝나면, 분리된 세포군의 순도를 확인하기 위해 2.5 × 10⁴ 개의 세포 분획을 사용하십시오. 세포 여과기로 망막을 분쇄한 후 여러 개의 망막 내측 세포를 시각화할 수 있으나, 세포 분리 과정 중의 축삭 절단으로 인해 망막 신경절 세포의 고유한 형태는 소실되었을 수 있습니다.전형적인 dye one 양성 CD48 음성 표면 표현형만으로는 마우스 망막 신경절 세포를 식별하고 분리하기에 충분하지 않은데, 이는 해당 세포들이 아마크린 세포, 뮬러 세포, 양극 세포, 수평 광수용체 및 망막 색소 상피 세포와 관련된 유전자들을 발현하기 때문입니다. 분리된 세포들은 synuclein gamma, BRN3A, TUJ1 및 RBPMS와 같은 망막 신경절 세포 관련 세포 내 마커 또한 발현하며, 이러한 마커들의 세포 내 위치는 이미징 유세포 분석을 통해 추가로 확인되었습니다. 분리된 세포 중 일부는 인비트로(in vitro) 세포 배양 후 망막 신경절 세포의 형태를 나타내기 시작하기도 합니다.또한, 고도로 농축된 분리 세포 집단에 대한 정량적 PCR 분석 결과, 망막 신경절 세포 특이적 세포 내 마커를 코딩하는 유전자가 수 배 증가한 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 세포 현탁액의 무균 상태를 유지하고, 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 세포 현탁액의 FC 수용체를 차단하며, 세포 분리 세부 사항이나 전략을 세포 분리 장비 운영자와 상의하는 것이 중요합니다.이 절차 이후, 유전자 발현 프로파일링에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 세포 분류기와 같은 특수 장비를 사용하는 경우에는 고도로 숙련된 작업자가 필요하다는 점을 잊지 마십시오. 이 기술은 개발 이후 시각 분야의 연구자들이 망막 신경절 세포의 생존 및 사멸 메커니즘을 이해하고, 시력 보존을 위한 새로운 치료법을 개발하는 데 기여하는 토대를 마련하였습니다.이 영상을 시청한 후, 농축된 균질한 일차 생쥐 망막 신경절 세포 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 쥐의 원발성 망막 신경절 세포(RGC)를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환에서 기능적 망막 신경절 세포의 상실로 인한 시력의 주요 저하를 더 잘 이해하는 것을 목표로 망막 신경절 세포에 대한 향후 연구를 가능하게 합니다.

형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.

Sprague-Dawley (SD) 쥐에서 일차 망막 뮐러 세포의 분리 및 배양

배우세요 유동 세포 계측법을 이용한 일차 쥐 망막 신경절 세포(RGCs) 분리 방법으로, 시력 퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 표준화된 기술입니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

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