Name: Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 수정된 Sholl 분석법을 이용하여 설치류 유방 전체 마운트 이미지에서 유선 분지 밀도와 감소율을 객관적으로 정량화하는 방법을. 이 기술은 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ를 활용하여 유방 발달의 핵심 특성을 정확하게 측정합니다.

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저자는이 방법과 Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) 박사의 지속적인 도움을 받아 Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC)을 인정하고 싶습니다. Sholl 응용 프로그램에 대한 지원.

<ol><li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li>
<li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li>
<li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Sholl_Analysis">http://imagej.net/Sholl_Analysis</a> (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+%28TCDD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li>
<li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li>
<li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland%3A+an+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5(2011).</li>
<li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373(2013).</li>
<li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li>
<li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li>
<li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Inter+J+of+Androl%22%5BJournal%5D)">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

출생부터 사춘기까지 유선의 성장은 알로 메트릭입니다. 사춘기 후, 유선은 광범위한 지방 분지 및 신장을 통해 발생하며 유방 상피가 전체 지방 패드를 차지할 때까지 계속됩니다. 분지 특성은 유선 개발의 중요한 측면이며, 이러한 특성을 객관적으로 정량화하는 능력은 정상적인 유방 발달을 평가하고 유방 내 독성 물질에 일생 초기 노출 후 비정상적인 발달을 확인하는 데 매우 유용 할 수 있습니다. 형태 학적 특징을 채점하고, 기본 치수 측정을 정량화하며, 유방 조직을 계수하는 것은 유선 개발을 평가하는 전형적인 방법입니다. 그러나 이러한 방법은 설치류 유선의 크기와 모양이 상당히 다양하기 때문에 특별히 민감하지 않으며 경험이없는 평가자에게는 발달 해석이 어려울 수 있습니다. 또한,편견은 제대로 눈이 멀지 않은 연구에 존재합니다. Sholl 분석 방법은 유방 상피 분지 밀도와 분지 복잡성, 유선 분비의 개별 형태 학적 특성을 정확하게 정량화하기위한 효율적인 프로토콜을 제공하며 연구 및 ...

유선 분지는 일반적으로 분비선 발달의 지표로 평가되는 특성이지만 객관적으로 정량화하기는 어렵습니다. 1953 년에 Sholl 1 은 고양이의 시각 및 운동 피질에서 신경 연결 돌기 arborization을 측정하는 방법을 설명했으며,이 기술을위한 플러그인은 Ferriera 등 2에 의해 개발되었습니다. 뉴런과 유선 모두 유사한 나무와 유사한 구조를 나타 내기 때문에,이 플러그인은 혈관 주위 쥐 유선의 2D 이미지에서 유방 상피 분지 밀도를 정량화하기 위해 사용되었습니다. 생후기가 학업 실험실 및 시험 가이드 라인 연구에서 종종 평가되는 생활 단계이기 때문에 주변기 단계는 분석을 위해 선택되었습니다. Sholl 분석은 추가 플러그인이 포함 된 오픈 소스 이미지 처리 패키지 인 ImageJ 인 FIJI와 함께 배포되는 플러그인입니다. 플러그인은 predef를 둘러싼 일련의 동심원 반지름을 만듭니다.ined center (전형적으로는 신경 세포의 soma 또는 유선의 1 차관의 기원)과 물체의 distal-most 부분 (enclosing radius)으로 확장된다. 그런 다음 각 링에서 발생하는 교차 수 (N)를 계산합니다. 플러그인은 Sholl 회귀 계수 ( k )를 반환하는데, 이는 상피 분지의 붕괴 속도를 측정합니다. ImageJ를 사용하여 유선 전체 이미지의 골격화 된 이미지가 생성되고 유방 상피 영역 (MEA)이 측정됩니다. Sholl 분석 플러그인을 사용하여 이미지를 분석하고 여기서 사용하지 않은 다른 값 중 N 및 k 값이 반환됩니다. 유방 상피 분화 밀도는 N / MEA를 계산하여 결정됩니다. 선 상피의 바깥 쪽 영역에서 분지가 계속되는 정도는 분기 복잡성이며 균일 한 원위 상피 성장의 지표입니다. k 는 epith에서 원위부 감소의 척도이므로그것은 분지 복잡성과 유방 발달의 확실한 지표의 효과적인 척도이다. 이 프로토콜은 유선 전체 마운트의 골격화 이미지를 생성하고 peripubertal 남성과 여성의 쥐의 유방 분기 특성을 정량적으로 평가하기위한 컴퓨터 보조 방법을 설명합니다. 이 방법은 상대적으로 빠르며 전문화 된 현미경 장비를 사용할 필요가 없습니다. 이 방법의 개발 및 검증은 Stanko et al. (2015) 3 . 이 보고서는 또한 쥐 유선 전체 = 마운트의 준비를 설명합니다. 유사한 유방 전체 마운트 절차가 Assis et al. (2010) 4 및 Plante et al. (2011) 5 .

<table><tbody><tr><td>해부 보드</td><td>NA</td><td>NA</td><td>대략 10"x12"의 스티로폼 조각이 적합합니다.</td></tr><tr><td>해부 : T-Pins</td>, <td>Daigger</td><td>EF7419A</td><td></td></tr><tr><td>에탄올,</td><td>NA</td>, <td>NA</td>, <td>70 % 에탄올</td>이 함유 된 스프레이 병이 적합합니다.</tr><tr><td>곡선형 해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14569-09</td><td></td></tr><tr><td>직선 해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm 현미경 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>Thermo Scientific Superfrost 플러스 & Colorfrost Plus 슬라이드는 IHC 및 해부병리학 응용 분야에서 값비싼 코팅 없이도 조직 절편을 영구적으로 고정합니다. 이 처리는 염색 중 조직 손실과 슬라이드 준비 시간을 줄여줍니다. 슬라이드는 정전기로 동결 조직 절편과 세포학 제제를 끌어당기고 실란과 유사한 화학적 성질을 특징으로 하지만 응용 프로그램 성능을 향상시키기 위해 최적화되었습니다. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 커버 유리 24 x 60 x 1 mm</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>베미스 파라필름 M 실험실 래핑 필름</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트, &ge; 99.8%(GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Carmine 명반&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 칼륨 황산염&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>Permount 마운팅 미디어</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>매크로스코프</td><td>Leica</td><td>Z16 APO&nbsp;</td><td>이것은 이 실험실에서 사용되는 이미지 캡처 하드웨어 및 소프트웨어입니다.&nbsp; 다양한 옵션이 있기 때문에 방법과 응용 프로그램은 실험실마다 다를 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Leica</td><td>DFC295</td><td></td></tr><tr><td>카메라 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>Leica Application Suite v3.1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>오픈 소스</td><td>http://imagej.net/Welcome</td><td></td></tr><tr><td>Sholl 분석&nbsp;</td><td>오픈 소스</td><td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td><td></td></tr></tbody></table>

sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

점점 더 많은 수의 연구가 설치류 유선을 화학 물질 노출의 발달 독성을 평가하기위한 종점으로 이용하고있다. 이러한 노출이 유선 분화에 미치는 영향은 일반적으로 기본 치수 측정을 사용하거나 형태 학적 특성을 채점하여 평가됩니다. 그러나 발달 변화를 해석하는 광범위한 방법은 실험실 간 일관성없는 번역을 초래할 수 있습니다. 연구를 통해 비교되는 데이터로부터 적절한 해석이 형성 될 수 있도록 일반적인 평가 방법이 필요합니다. 본 연구는 유선의 분지 특성을 정량화하기위한 Sholl 분석 방법의 적용을 기술한다. Sholl 방법은 원래 신경 돌기 패턴을 정량화하는데 사용하기 위해 개발되었습니다. 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 인 ImageJ와이 분석을 위해 개발 된 플러그인을 사용하여 유선 분지 밀도와 am혈관 주위 암컷 쥐의 유선이 결정되었다. 여기에 설명 된 방법은 유선 개발의 중요한 특성을 정량화하기위한 효과적인 도구로 Sholl 분석의 사용을 가능하게합니다.

이 프로토콜에서 분석 된 유선에 대해 측정 된 밀폐 반경, MEA, N, k 및 계산 된 분기 밀도 값을 표 1 에보고합니다. Sholl 분석은 각각의 반경 (도 9)의 교점의 수의 선형 및 세미 - 로그 플롯을 생성하고, 선택된 경우, 교차점의 히트 맵 (도 10). 덜 발달 된 땀샘은 동일한 MEA 내에서 더 적은 교차점을 나타내므로 더 낮은 분기 밀도를 보입니다. 잘 발달 된 샘은 전체 선 상피, 특히 원위부에 균일하게 분지를 계속할 것입니다. 이 영역에서 분기가 계속되는 정도는 분기 복잡성 및 복잡성 감소가 붕괴 속도 (또는 Sholl 회귀 계수, k )로 전달되는 것으로 설명 할 수 있습니다. 붕괴 속도는 말초 상피 브래지어의 변화를 반영합니다nching)하고 둘러싸는 반경 ( 즉,</...

설치류의 유선 선생 발달은 일반적으로 기술적 평가를 사용하거나 기본적인 신체적 속성을 측정하여 평가되었습니다. 분지 밀도는 객관적으로 정량화하기 어려운 유방 발달의 지표입니다. 이 프로토콜은 유선의 분기 특성의 정량 평가를위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

이 컴퓨터 보조 방법의 전반적인 목표는 유선 전체 마운트 이미지에 수정된 숄 분석(sholl analysis)을 적용하여 설치류의 중요한 발달 지표인 유선 분지 밀도와 분지 감쇠를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질 노출이 유선 발달을 어떻게 변화시키는지와 같은 유선 생물학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여 유선 발달의 기본 특성을 객관적으로 정량화할 수 있다는 점입니다.이 절차를 위해, 고정된 배율로 선세포 상피가 보이는 전체 마운트 이미지를 준비하십시오. 먼저, ImageJ에서 이미지를 엽니다. 그다지, freehand 도구를 선택하십시오.선 조직 상피 주변을 따라 외곽선을 그리고 주변 영역을 정리하십시오. 그런 다음, 림프절 주변을 따라 외곽선을 그리고 자르기 명령을 사용하여 이미지의 이 부분을 제거하십시오. 이미지의 배경이 검은색인 경우, 반드시 흰색으로 변환해야 합니다.편집(Edit)을 클릭한 다음 옵션(Options), 색상(Colors)을 선택하십시오. 대화 상자의 배경 옵션 드롭다운 메뉴에서 흰색을 선택하십시오. 배경이 계속 검은색으로 보일 수 있으나, 이미지 처리 시에는 흰색으로 처리됩니다.이제 컬러 채널을 3개의 8비트 그레이스케일 이미지로 분리합니다. 그런 다음, 일반적으로 블루 채널인 대비가 가장 좋은 채널을 선택하십시오. 이제 선택한 컬러 채널에서 배경을 제거합니다.그런 다음, 원하는 파라미터를 선택하고 변경 사항을 미리 봅니다. 대화 상자에서 light background와 preview를 체크한 후, 원하는 대비가 얻어질 때까지 픽셀 수를 조정하십시오. 추가적인 대비가 필요한 경우, Unsharp Mask 옵션을 사용하십시오.대화 상자에서 미리보기를 확인하고, 원하는 대비가 얻어질 때까지 픽셀 반경과 마스크 가중치를 조정하십시오. 언샤프 마스크 필터를 적용한 후, 필터로 인해 생성된 테두리를 제거하십시오. 도구 모음에서 빨간색 이중 화살표 버튼을 클릭하고 그리기 도구를 선택하십시오.그런 다음, 지우개 도구를 선택합니다. 지우개 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 지름을 조절한 후, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 테두리를 지웁니다. 지우는 동안에는 실행 취소를 한 번만 할 수 있으므로 주의하십시오.필터 중 하나를 적용한 후, 남은 노이즈를 수동으로 제거하십시오. 원본 이미지의 복사본을 참조하여, 먼저 툴바에서 빨간색 이중 화살표 버튼을 클릭하고 그리기 도구를 선택한 다음, 지우개 도구를 선택하여 식별된 노이즈를 제거하십시오.지우개 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 지름을 조정하십시오. 그런 다음, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태로 노이즈를 지웁니다. 지우는 동안에는 한 번의 실행 취소만 가능하므로 주의하십시오.다음으로, 이미지 임계값을 조정합니다. 슬라이더를 이동하여 최소 및 최대 임계값을 조정함으로써 샘의 이미지를 개선합니다. 그런 다음, 적용(Apply)을 클릭합니다.다음 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 추가 노이즈를 자동으로 제거하십시오. 첫 번째 옵션은 despeckle 명령을 사용하는 것이며, 두 번째 옵션은 remove outliers 명령을 사용하는 것입니다.이 과정은 픽셀이 사용자 정의 임계값을 초과하여 중앙값에서 벗어난 경우에만 해당 픽셀을 주변 영역의 중앙값으로 대체합니다. 이제 원본 이미지를 대조군으로 사용하여, 임계값 설정 및 노이즈 제거 과정에서 삭제된 선유피텔륨(glandular epithelium) 부분을 재구성하십시오. 이미지를 재구성할 때는 이미지의 무결성을 유지하기 위해 세심하게 그리고 최소한으로 수행해야 합니다.그리기 도구에서 스프레이 캔 도구를 선택하십시오. 스프레이 캔 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 도구 크기를 조정한 다음, 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 샘의 누락된 부분을 조심스럽게 채우십시오. 다음으로, Sholl 분석을 위해 샘의 골격화 이미지를 생성하십시오.먼저, 이미지를 이진 형식으로 변환합니다. 그런 다음, 이미지의 스켈레톤화(skeletonization)를 수행합니다. 이 과정은 이진 이미지의 가장자리에서 픽셀을 반복적으로 제거하여 최종적으로 픽셀 너비가 1픽셀인 형태로 축소합니다.이제 임계값 설정(thresholding)과 스켈레톤화(skeletonizing)로 인해 발생한 간극을 메우기 위해 이미지를 한 번 팽창(dilate)시킵니다. 그런 다음 '다른 이름으로 저장' 명령을 사용하여 이미지를 새 파일로 저장하십시오. 마지막으로, 두 이미지를 겹쳐서 스켈레톤 이미지의 정확도를 원본과 대조하여 확인하십시오.이미지 추가 대화 상자에서 골격 이미지를 선택하고 불투명도를 30%로 설정하십시오. 그런 다음, 향후 참조를 위해 오버레이를 새 이미지로 저장하십시오. 우선, 골격 이미지를 열고 이미지를 이진 형식으로 변환합니다. 이제 이미지 스케일을 정의하십시오.밀리미터당 픽셀 수를 입력한 다음, 알려진 거리(known distance)와 픽셀 종횡비(pixel aspect ratio)를 모두 1로 설정하고, 길이 단위로 밀리미터를 입력한 후 전역 옵션을 토글하여 모든 이미지에 스케일을 적용합니다. 다음으로, 선 그리기 도구를 사용하여 sholl 분석을 위한 최종 반경을 결정합니다. 주관의 시작 지점부터 선상피의 가장 원위부 지점까지 선을 그립니다.그런 다음 M 키를 누르면 선의 거리가 표시됩니다. 이제 sholl 분석 설정을 입력하십시오. 먼저 shells 정의 섹션에서 옵션을 선택하고, 시작 반경을 0.00 millimeters로 설정하고 반경 단계 크기를 0.1 millimeters로 설정하십시오.샘플 수를 1로 설정하십시오. 방금 그린 선의 길이는 종료 반경 필드에 자동으로 입력됩니다. 반경당 다중 샘플 옵션에서 적분 시 평균(mean)을 선택하십시오.기술자 및 곡선 피팅 옵션에서 포위 반경 컷오프를 1로 설정하십시오. 1차 분지 수의 경우 시작 반경에서 추론을 선택하고, 선형 및 최적 피팅 차수 옵션을 선택하십시오. 그런 다음, 정규화되지 않은 프로필에서 가장 유용한 정보를 선택하십시오.이제 Sholl 방법 섹션에서 정규화된 프로파일을 위한 영역을 선택하십시오. 마지막으로, 출력 섹션에서 교차점 마스크 생성(create intersections mask)을 선택하여 교차점의 히트맵을 만듭니다. 이제 링이 표시된 이미지의 미리보기 창을 열어 분석 영역을 확인하십시오.모든 설정이 올바른지 확인한 후, 확인(okay)을 클릭하여 분석을 실행하십시오. 분석을 실행하면 sholl 프로파일 선형 창, sholl 프로파일 세미로그 창, 모든 sholl 출력값이 포함된 sholl 결과 창, 그리고 다항식에 의해 결정된 각 반지름에서의 교차 횟수를 제공하는 파일 이름 sholl 프로파일 창이 생성됩니다. MEA를 측정하려면 ImageJ에서 샘의 골격 이미지(skeleton image)를 사용하여 작업하십시오.다각형 도구를 열고 선 조직의 주변부를 따라 다각형을 그립니다. 마우스 클릭을 통해 선분을 추가하십시오. 상피 영역 전체가 둘러싸지면 더블 클릭하여 다각형을 닫습니다.그런 다음 M 키를 눌러 결과 창을 엽니다. 면적 열의 값은 MEA에 해당합니다. 선상피가 림프절 너머로 확장된 경우, 분지 밀도를 계산할 때 MEA에서 림프절 면적을 뺍니다.림프절 영역은 MEA와 동일한 방식으로 측정할 수 있습니다. 설명된 방법을 사용하여 연령이 일치하는 두 그룹의 쥐를 분석하였습니다. 그룹 B의 동물들은 조기 유선 발달을 유도하는 것으로 알려진 화학 물질을 처리받았습니다.선(gland)으로부터의 반지름 방향을 따라 분지 교차점의 수를 도식화하면 결과의 변동성을 확인할 수 있습니다. Sholl 분석 결과, 그룹 간 평균 교차점 수에서 뚜렷한 차이가 나타났습니다. 하지만 결론을 도출하기 위해서는 교차점 데이터를 유선 조직 면적으로 정규화해야 합니다.Sholl 분석과 유선 상피 영역 측정은 비교 분석에 유용한 두 가지 생리학적 파라미터를 제공합니다. 분명히, 처리군의 샘 크기가 훨씬 더 컸습니다. Sholl 분석에서는 분기 밀도와 k 값을 계산하는 데 사용되는 Sum N 값이 도출됩니다.처리군에서 더 높은 평균 분지 밀도와 분지 감쇄율이 더 낮음을 나타내는 더 낮은 평균 k값은 처리된 동물이 처리되지 않은 동물보다 더 잘 발달된 샘 조직을 가지고 있음을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때 노이즈 제거가 가장 중요한 단계임을 기억하는 것이 중요합니다. 너무 많이 또는 너무 적게 제거하면 샘 조직의 무결성을 해치고 결과가 왜곡될 수 있습니다.이 방법을 사용할 때는 깨끗한 유선 전체 마운트로 시작하는 것이 중요합니다. 찢어짐이나 접힘과 같은 결함이 있으면 정확한 스켈레톤화(skeletonized) 영상을 얻을 수 없습니다. 정확한 스켈레톤화 영상을 생성하려면 인내심과 연습이 필요합니다.이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 분석하는 샘플당 15분에서 20분 정도가 소요됩니다.

quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리 프로토콜은 쥐 복부 유선을 해부하다 방법과 유선 전체 마운트를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 세 최종 포인트 (터미널 최종 꽃봉오리의 번호, 상피 연신율과 차별화)을 사용하여 유선의 형태를 분석하고식이 수정에 노출된 쥐의 유방암 위험을 예측하는 이러한 결과를 사용하는 방법에 대해...

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

우리는 세포로 구성된 거시 구조 수준에서 기관의 변화에 대한 연구를 용이하게하는 3 차원 (3D) 조직학 볼륨 재구성을위한 이미지 등록 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법을 사용하여 야생형과 Igfbp7-null 유선의 3차원 변화를 연구했습니다.

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

유방암의 영상 유도 예방 치료를 위해 쥐 유방 유관 나무에 화학적 절제 용액을 전달하는 절차가 설명됩니다. 유방 상피 세포는 유두 개구부에 직접 캐뉼레이션과 70 % 에탄올 기반 절제 용액의 덕트 내 주입을 통해 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 표적화 될 수 있습니다.

쥐 모델에서 유방암 예방을 위한 관내 에탄올 기반 절제 치료의 X선 시각화

여기에서는 Isolectin B4의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

배우세요 수정된 Sholl 분석법을 이용하여 설치류 유방 전체 마운트 이미지에서 유선 분지 밀도와 감소율을 객관적으로 정량화하는 방법을. 이 기술은 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ를 활용하여 유방 발달의 핵심 특성을 정확하게 측정합니다.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

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