Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

이 컴퓨터 보조 방법의 전반적인 목표는 유선 전체 마운트 이미지에 수정된 숄 분석(sholl analysis)을 적용하여 설치류의 중요한 발달 지표인 유선 분지 밀도와 분지 감쇠를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질 노출이 유선 발달을 어떻게 변화시키는지와 같은 유선 생물학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여 유선 발달의 기본 특성을 객관적으로 정량화할 수 있다는 점입니다.

이 절차를 위해, 고정된 배율로 선세포 상피가 보이는 전체 마운트 이미지를 준비하십시오. 먼저, ImageJ에서 이미지를 엽니다. 그다지, freehand 도구를 선택하십시오.

선 조직 상피 주변을 따라 외곽선을 그리고 주변 영역을 정리하십시오. 그런 다음, 림프절 주변을 따라 외곽선을 그리고 자르기 명령을 사용하여 이미지의 이 부분을 제거하십시오. 이미지의 배경이 검은색인 경우, 반드시 흰색으로 변환해야 합니다.

편집(Edit)을 클릭한 다음 옵션(Options), 색상(Colors)을 선택하십시오. 대화 상자의 배경 옵션 드롭다운 메뉴에서 흰색을 선택하십시오. 배경이 계속 검은색으로 보일 수 있으나, 이미지 처리 시에는 흰색으로 처리됩니다.

이제 컬러 채널을 3개의 8비트 그레이스케일 이미지로 분리합니다. 그런 다음, 일반적으로 블루 채널인 대비가 가장 좋은 채널을 선택하십시오. 이제 선택한 컬러 채널에서 배경을 제거합니다.

그런 다음, 원하는 파라미터를 선택하고 변경 사항을 미리 봅니다. 대화 상자에서 light background와 preview를 체크한 후, 원하는 대비가 얻어질 때까지 픽셀 수를 조정하십시오. 추가적인 대비가 필요한 경우, Unsharp Mask 옵션을 사용하십시오.

대화 상자에서 미리보기를 확인하고, 원하는 대비가 얻어질 때까지 픽셀 반경과 마스크 가중치를 조정하십시오. 언샤프 마스크 필터를 적용한 후, 필터로 인해 생성된 테두리를 제거하십시오. 도구 모음에서 빨간색 이중 화살표 버튼을 클릭하고 그리기 도구를 선택하십시오.

그런 다음, 지우개 도구를 선택합니다. 지우개 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 지름을 조절한 후, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 테두리를 지웁니다. 지우는 동안에는 실행 취소를 한 번만 할 수 있으므로 주의하십시오.

필터 중 하나를 적용한 후, 남은 노이즈를 수동으로 제거하십시오. 원본 이미지의 복사본을 참조하여, 먼저 툴바에서 빨간색 이중 화살표 버튼을 클릭하고 그리기 도구를 선택한 다음, 지우개 도구를 선택하여 식별된 노이즈를 제거하십시오.

지우개 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 지름을 조정하십시오. 그런 다음, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태로 노이즈를 지웁니다. 지우는 동안에는 한 번의 실행 취소만 가능하므로 주의하십시오.

다음으로, 이미지 임계값을 조정합니다. 슬라이더를 이동하여 최소 및 최대 임계값을 조정함으로써 샘의 이미지를 개선합니다. 그런 다음, 적용(Apply)을 클릭합니다.

다음 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 추가 노이즈를 자동으로 제거하십시오. 첫 번째 옵션은 despeckle 명령을 사용하는 것이며, 두 번째 옵션은 remove outliers 명령을 사용하는 것입니다.

이 과정은 픽셀이 사용자 정의 임계값을 초과하여 중앙값에서 벗어난 경우에만 해당 픽셀을 주변 영역의 중앙값으로 대체합니다. 이제 원본 이미지를 대조군으로 사용하여, 임계값 설정 및 노이즈 제거 과정에서 삭제된 선유피텔륨(glandular epithelium) 부분을 재구성하십시오. 이미지를 재구성할 때는 이미지의 무결성을 유지하기 위해 세심하게 그리고 최소한으로 수행해야 합니다.

그리기 도구에서 스프레이 캔 도구를 선택하십시오. 스프레이 캔 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 도구 크기를 조정한 다음, 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 샘의 누락된 부분을 조심스럽게 채우십시오. 다음으로, Sholl 분석을 위해 샘의 골격화 이미지를 생성하십시오.

먼저, 이미지를 이진 형식으로 변환합니다. 그런 다음, 이미지의 스켈레톤화(skeletonization)를 수행합니다. 이 과정은 이진 이미지의 가장자리에서 픽셀을 반복적으로 제거하여 최종적으로 픽셀 너비가 1픽셀인 형태로 축소합니다.

이제 임계값 설정(thresholding)과 스켈레톤화(skeletonizing)로 인해 발생한 간극을 메우기 위해 이미지를 한 번 팽창(dilate)시킵니다. 그런 다음 '다른 이름으로 저장' 명령을 사용하여 이미지를 새 파일로 저장하십시오. 마지막으로, 두 이미지를 겹쳐서 스켈레톤 이미지의 정확도를 원본과 대조하여 확인하십시오.

이미지 추가 대화 상자에서 골격 이미지를 선택하고 불투명도를 30%로 설정하십시오. 그런 다음, 향후 참조를 위해 오버레이를 새 이미지로 저장하십시오. 우선, 골격 이미지를 열고 이미지를 이진 형식으로 변환합니다. 이제 이미지 스케일을 정의하십시오.

밀리미터당 픽셀 수를 입력한 다음, 알려진 거리(known distance)와 픽셀 종횡비(pixel aspect ratio)를 모두 1로 설정하고, 길이 단위로 밀리미터를 입력한 후 전역 옵션을 토글하여 모든 이미지에 스케일을 적용합니다. 다음으로, 선 그리기 도구를 사용하여 sholl 분석을 위한 최종 반경을 결정합니다. 주관의 시작 지점부터 선상피의 가장 원위부 지점까지 선을 그립니다.

그런 다음 M 키를 누르면 선의 거리가 표시됩니다. 이제 sholl 분석 설정을 입력하십시오. 먼저 shells 정의 섹션에서 옵션을 선택하고, 시작 반경을 0.00 millimeters로 설정하고 반경 단계 크기를 0.1 millimeters로 설정하십시오.

샘플 수를 1로 설정하십시오. 방금 그린 선의 길이는 종료 반경 필드에 자동으로 입력됩니다. 반경당 다중 샘플 옵션에서 적분 시 평균(mean)을 선택하십시오.

기술자 및 곡선 피팅 옵션에서 포위 반경 컷오프를 1로 설정하십시오. 1차 분지 수의 경우 시작 반경에서 추론을 선택하고, 선형 및 최적 피팅 차수 옵션을 선택하십시오. 그런 다음, 정규화되지 않은 프로필에서 가장 유용한 정보를 선택하십시오.

이제 Sholl 방법 섹션에서 정규화된 프로파일을 위한 영역을 선택하십시오. 마지막으로, 출력 섹션에서 교차점 마스크 생성(create intersections mask)을 선택하여 교차점의 히트맵을 만듭니다. 이제 링이 표시된 이미지의 미리보기 창을 열어 분석 영역을 확인하십시오.

모든 설정이 올바른지 확인한 후, 확인(okay)을 클릭하여 분석을 실행하십시오. 분석을 실행하면 sholl 프로파일 선형 창, sholl 프로파일 세미로그 창, 모든 sholl 출력값이 포함된 sholl 결과 창, 그리고 다항식에 의해 결정된 각 반지름에서의 교차 횟수를 제공하는 파일 이름 sholl 프로파일 창이 생성됩니다. MEA를 측정하려면 ImageJ에서 샘의 골격 이미지(skeleton image)를 사용하여 작업하십시오.

다각형 도구를 열고 선 조직의 주변부를 따라 다각형을 그립니다. 마우스 클릭을 통해 선분을 추가하십시오. 상피 영역 전체가 둘러싸지면 더블 클릭하여 다각형을 닫습니다.

그런 다음 M 키를 눌러 결과 창을 엽니다. 면적 열의 값은 MEA에 해당합니다. 선상피가 림프절 너머로 확장된 경우, 분지 밀도를 계산할 때 MEA에서 림프절 면적을 뺍니다.

림프절 영역은 MEA와 동일한 방식으로 측정할 수 있습니다. 설명된 방법을 사용하여 연령이 일치하는 두 그룹의 쥐를 분석하였습니다. 그룹 B의 동물들은 조기 유선 발달을 유도하는 것으로 알려진 화학 물질을 처리받았습니다.

선(gland)으로부터의 반지름 방향을 따라 분지 교차점의 수를 도식화하면 결과의 변동성을 확인할 수 있습니다. Sholl 분석 결과, 그룹 간 평균 교차점 수에서 뚜렷한 차이가 나타났습니다. 하지만 결론을 도출하기 위해서는 교차점 데이터를 유선 조직 면적으로 정규화해야 합니다.

Sholl 분석과 유선 상피 영역 측정은 비교 분석에 유용한 두 가지 생리학적 파라미터를 제공합니다. 분명히, 처리군의 샘 크기가 훨씬 더 컸습니다. Sholl 분석에서는 분기 밀도와 k 값을 계산하는 데 사용되는 Sum N 값이 도출됩니다.

처리군에서 더 높은 평균 분지 밀도와 분지 감쇄율이 더 낮음을 나타내는 더 낮은 평균 k값은 처리된 동물이 처리되지 않은 동물보다 더 잘 발달된 샘 조직을 가지고 있음을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때 노이즈 제거가 가장 중요한 단계임을 기억하는 것이 중요합니다. 너무 많이 또는 너무 적게 제거하면 샘 조직의 무결성을 해치고 결과가 왜곡될 수 있습니다.

이 방법을 사용할 때는 깨끗한 유선 전체 마운트로 시작하는 것이 중요합니다. 찢어짐이나 접힘과 같은 결함이 있으면 정확한 스켈레톤화(skeletonized) 영상을 얻을 수 없습니다. 정확한 스켈레톤화 영상을 생성하려면 인내심과 연습이 필요합니다.

이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 분석하는 샘플당 15분에서 20분 정도가 소요됩니다.