분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

이 절차의 전반적인 목표는 초기 결정화 스크리닝 조건에서 고품질 결정을 생산하는 것입니다. 결정은 단백질, DNA, RNA 및 그 복합체의 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 고분자 구조에 대한 무언가가 점점 더 어려워지고 있습니다.

또한 다양한 초기 조건을 제공하면 유용한 결정의 수율이 증가하는 동시에 시료 및 결정 최적화의 필요성이 줄어듭니다. 두 개의 완전 자동화 시스템인 LMB는 나노리터 액적에서 최대 1,920개의 증기 확산 실험을 용이하게 합니다. 간결함을 위해 사용자는 나노리터 디스펜서, 잉크젯 프린터 및 접착판 실러의 기본 기능과 유지 관리에 이미 익숙하다고 가정합니다.

절차를 수행하기 전에 시스템의 로봇이 초기화되고 제어 소프트웨어가 열려 있는지 확인하십시오. 메인 프로그램이 시작되기 약 30분 전에 튜브 냉각 캐리어의 냉각기를 켭니다. 플레이트 실러의 전동 SBS 캐리어에 테스트 플레이트를 놓습니다.

플레이트 실러를 실행하고 필름이 제대로 도포되었는지 확인하십시오. 이 테스트를 두 번 더 반복하여 플레이트 씰러가 준비되었는지 확인합니다. 그런 다음 20리터의 탈이온수를 액체 처리기의 주 용기에 추가합니다.

20% 에탄올 헹굼 용액의 더 작은 용기에서 커플 링 인서트를 분리하고 인서트를 주 용기에 연결하십시오. 잉크젯 프린터 터치스크린에 적절한 화면 이름을 입력합니다. 그런 다음 캐러셀 도어를 열고 닫아 캐러셀 회전을 트리거합니다.

첫 번째 스택이 나타나면 문을 엽니다. 첫 번째 스택에 22개의 결정화 플레이트를 완전히 로드하며, 각 플레이트는 컬럼 1이 바깥쪽을 향하도록 합니다. 같은 방법으로 다음 두 스택을 완전히 로드합니다.

나머지 6개의 플레이트를 네 번째 스택의 가장 높은 위치에 로드한 다음 캐러셀 도어를 닫습니다. 냉각기 디스플레이가 섭씨 14도를 나타내는지 확인합니다. 선택한 스크리닝 키트를 1분 동안 부드럽게 반복해서 뒤집습니다.

그런 다음 액체 처리기의 전면 패널을 엽니다. 튜브를 열고 표준 96웰 레이아웃의 냉각 캐리어에 넣습니다. 각 튜브를 캐리어에 넣으면 동일한 96웰 레이아웃으로 트레이의 뚜껑을 놓습니다.

System 1을 사용할 때 라벨 리드는 96웰 레이아웃의 트레이에 배치되어 튜브가 올바르게 배열되었는지 교차 확인할 수 있습니다. 튜브 위치를 교차 확인한 다음 모든 튜브가 수평이고 캐리어에 고정되었는지 확인합니다. 그런 다음 전면 패널을 닫습니다.

액체 처리기 소프트웨어의 시작 창에서 Run Maintenance(유지 관리 실행)를 선택하고 Flushing 프로그램을 엽니다. 프로그램을 실행하여 시스템에서 20% 에탄올을 씻어내고 액체 디스펜싱 팁의 외부를 세척합니다. 플러시가 완료되면 취소를 클릭하여 시작으로 돌아갑니다.

Run An Existing Process(기존 프로세스 실행)를 선택하고 Start Your Selection(선택 항목 시작)을 클릭합니다. MRC 키트 디스펜싱 프로그램을 엽니다. 구성 화면에서 인스턴스의 경우 18인치를 입력하고 프로그램을 실행하고 처음 4개의 플레이트가 라벨을 붙이고, 채우고, 밀봉될 때 시스템을 모니터링합니다.

처음 4개 플레이트의 준비가 완료될 때까지 시스템을 방치하지 마십시오. 72개의 플레이트가 모두 준비되고 캐러셀에 다시 배치되면 탈이온수 용기에서 20% 에탄올 용기로 커플링 인서트를 전환합니다. 이전과 동일한 프로세스를 사용하여 시작 플러시 프로그램을 실행합니다.

냉각기를 끄고 빈 스크리닝 키트 튜브를 버립니다. 캐러셀에서 준비된 72개의 접시를 조심스럽게 꺼냅니다. 잘못 채워졌거나 제대로 밀봉되지 않은 플레이트는 폐기하십시오.

바로 사용할 수 있는 플레이트는 섭씨 10도에서 보관하십시오. 먼저 시스템의 로봇이 켜져 있는지, 소프트웨어가 열린 상태에서 나노리터 분전기가 초기화되었는지, 액체 분주기의 Method Manager가 열려 있는지 확인합니다. 메인 프로그램이 시작되기 약 15분 전에 마이크로튜브 냉각 캐리어를 켭니다.

플레이트 실러의 전동 SBS 캐리어에 테스트 플레이트를 놓습니다. 플레이트 씰러를 실행하고 플레이트가 제대로 밀봉되었는지 확인합니다. 플레이트 씰러를 세 번 테스트합니다.

그런 다음 나노리터 디스펜서를 실행하여 테스트 플레이트에 100나노리터 방울의 테스트 용액을 설정합니다. 여기에 표시된 것은 나노리터 디스펜서에서 생성된 100나노리터 액적의 광학 현미경 사진으로, 적색 염료로 만든 테스트 용액을 사용합니다. 나노리터 디스펜서 소프트웨어를 닫고 데크에서 스트립 홀더 블록을 제거합니다.

다음으로, 맞춤형으로 설계된 플레이트 홀더에 고정되며, 해당 조건에서 휘발성 시약의 상대적 양이 가장 높은 사전 충전된 96웰 결정화 플레이트를 설정합니다. 플레이트에서 접착 필름을 제거합니다. Liquid Handler 전면 패널을 열고 밀봉되지 않은 플레이트를 첫 번째 슬라이딩 캐리어 뒤쪽의 데크에 놓습니다.

SBS 알루미늄 뚜껑으로 플레이트를 덮습니다. 뚜껑의 반대쪽 모서리에 부드러운 압력을 가하여 덮개를 캐리어의 왼쪽 뒤쪽 모서리 쪽으로 고정합니다. System 2를 사용할 때는 상당한 양의 휘발성 시약이 포함된 스크리닝 키트를 먼저 처리해야 합니다.

이렇게 하면 SBS 리드에 결로 현상이 형성되는 것을 방지할 수 있으며, 이로 인해 리드의 자동 전달 또는 플레이트 밀봉에 영향을 줄 수 있습니다. 밀봉을 풀고 슬라이딩 캐리어에 적재한 다음 나머지 19개의 플레이트를 같은 방식으로 덮어 가장 휘발성이 높은 조건에서 가장 낮은 휘발성 조건으로 작업합니다. 마이크로튜브 냉각 캐리어가 섭씨 4도가 되면 녹색 표시등으로 표시된 대로 덮개를 제거합니다.

최소 440마이크로리터의 단백질 샘플이 들어 있는 마이크로튜브의 뚜껑을 잘라냅니다. 샘플의 반월판 위에 거품이 없으면 액체 감지 시스템을 방해할 수 있습니다. 튜브를 마이크로튜브 냉각 캐리어의 위치 1에 놓습니다.

플레이트 이동 어댑터 캐리어 앞의 액체 처리기 데크에 PCR 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 전면 패널을 닫습니다. Liquid Handler 분석법 관리 인터페이스에서 Setup Plates를 선택합니다.

두 시스템의 초기화를 모니터링하고 플레이트 유형 및 각 조건에 대한 방울 수, 방울 크기, 처리할 첫 번째 플레이트의 위치 및 플레이트 수를 포함한 실행 매개변수를 입력합니다. 데크를 로드하는 데 도움이 필요한지 묻는 메시지가 표시되면 No를 클릭합니다. 빈 팁 랙이 없는지 확인한 후 확인을 클릭합니다. 실행에 대한 충분한 팁이 있는지 확인했으면 확인을 클릭합니다. 필요한 경우 팁 관리 시스템을 업데이트하고 확인을 클릭합니다. 나노리터 디스펜서 데크에 스트립 홀더 블록이 떨어져 있고 캐리어가 50마이크로리터 팁 스택의 뒤쪽에 있고 알루미늄 SBS 뚜껑이 없는지 확인합니다.

다른 모든 필수 구성 요소가 준비되었는지 다시 확인한 다음 프로세스를 시작합니다. 나노리터 디스펜서가 첫 번째 플레이트에 방울을 세팅하고 플레이트 씰러가 이후에 플레이트를 밀봉할 때 시스템을 모니터링합니다. 첫 번째 플레이트의 준비가 완료될 때까지 시스템을 방치하지 마십시오.

20개의 플레이트가 모두 결정화 방울로 준비되고 자동으로 슬라이딩 캐리어로 돌아가면 전면 패널을 열고 플레이트를 부드럽게 제거합니다. 결정화를 위해 보관하기 전에 플레이트가 올바르게 밀봉되었는지 확인하십시오. 보관을 위해 액체 처리기의 왼쪽에 쌓기 전에 20% 에탄올 용액으로 SBS 뚜껑을 청소하십시오.

PCR 플레이트와 마이크로튜브를 폐기합니다. 마이크로튜브 냉각 캐리어를 끄고 응결을 닦아냅니다. 더 많은 결로를 흡수하기 위해 더 시원한 표면 위에 종이 타월을 두십시오.

그런 다음 캐리어 커버를 교체하고 전면 패널을 닫습니다. OmpF 및 MreB는 초기에 이러한 완전 자동화 프로토콜을 사용하여 스크리닝되었습니다. X선 회절에 충분한 품질의 OmpF 결정이 LMB 7 플레이트의 A4 웰에서 발견되었습니다.

MreB의 회절 품질 결정은 LMB 20 플레이트의 D12 웰에서 발견되었습니다. 사전 연료 플레이트를 섭씨 10도에서 보관하는 것은 결빙 및 4도에서 보관하는 것을 피하기 위한 절충안이며, 이는 결정화 조건의 악화 및 응축 관련 문제를 유발할 수 있습니다. 이런 식으로 보관하면 플레이트를 4-5개월 이내에 사용할 수 있습니다.

4개에서 8개 사이의 LMB 플레이트는 System 1을 통해 매년 생산되며 나중에 초기 스크리닝에 사용됩니다. 프로토콜은 예상 회전율이 훨씬 낮을 때 다르게 최적화해야 합니다. 당사의 전체 사전 연료 플레이트 세트는 일반적으로 새로운 샘플의 대형 초기 스크린으로 사용됩니다.

그러나 훨씬 구체적인 샘플 요구 사항에 따라 더 적은 수의 플레이트를 선택할 수 있습니다. 액적을 준비한 후, 플레이트는 섭씨 4도 또는 18도로 엄격하게 제어되는 온도로 저진동 선반에 보관됩니다. 실험은 스크롤 광원 현미경으로 평가됩니다.

결정의 특성을 주의 깊게 조사한 후 LMB 또는 C6 Screen 데이터베이스와 같은 웹 기반 도구를 사용하여 조건 간의 특성 및 유사성을 분석할 수 있습니다. 결정화 조건의 후속 최적화는 여전히 필요할 수 있습니다. 4-corner 방법 및 첨가제 스크리닝을 사용한 추가 자동화 프로토콜은 본 원고에 설명되어 있습니다.