Name: 분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 고분자 결정화를 위한 자동화된 증기 확산 실험 준비 방법을. 나노리터 액적을 사용하여 단백질, DNA, RNA 복합체의 고품질 결정을 효율적으로 생산하고 구조 생물학 연구에 활용하세요.

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MRC LMB 결정 화 시설이입니다 친절 하 게 의료 연구 위원회 (영국)에 의해 지원. 우리는 그들의 지원에 대 한 좌 클릭의 회원 감사 합니다: 올가 Perisic (PNAC), 토니 Warne, Fusinita 반 덴 Ent와 팻 에드워즈 (구조 연구), 스티브 Scotcher와 다른 구성원 기계 워크숍의 닐 그랜트와 조 웨스트 모어 랜드 (시각 보조 기능), 폴 하트와 톰 프랫 (그것)입니다. 우리는 또한 조지 스티븐 스와 도널드 Ogg (Alphabiotech, 스티브 엘리엇 (Tecan, 영국), 미첼 스튜어트 및 헤더 Ringrose (해밀턴 로봇, 영국), 폴 해 동, 로버트 루이스 및 Joby 젠킨스 (TTP Labtech, 영국), 폴 리어 (Swissci AG는, 스위스), 감사 하 고 싶습니다. 영국), 닐 윌리엄스 (: Markem Imaje, 영국)와 그레이엄 해리스 (클리블랜드 기관) 기술.

1. 두 개의 완전히 자동화 시스템 (초기 심사)
<ol><li>
시스템 1: 72 96 잘 결정 화 접시의 준비 키트 (좌 판) 상영으로 가득
	<ol>
<li>절차를 수행 하기 전에 시스템의 로봇 초기화 되 고 그들의 제어 소프트웨어는 확인 합니다. 주요 프로그램을 시작 하기 전에 약 30 분 튜브 냉각 캐리어의 냉각 장치를 켭니다.</li>
		<li>플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 영화 제대로 적용 된 확인 하십시오. 이 테스트 판 마감재 준비 되었는지 확인을 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>그런 다음 액체 처리기의 주요 컨테이너에 이온 물 20 L를 추가 합니다. 작은 컨테이너 (20% 에탄올 솔루션을 rinsing)에서 커플링 삽입을 분리 하 고 주요 컨테이너에 삽입 연결.</li>
		<li>잉크젯 프린터 터치 스크린에 적절 한 화면 이름 (표 1)을 입력 합니다. 그런 다음 열고 회전 목마 회전 하는 회전 목마 문을 닫습니다. 첫 번째 스택 자체를 선물 하는 때 문을 엽니다.</li>
		<li>완전히 로드 22 결정 화 접시, 각각 열 1 방향으로 첫 번째 스택 밖으로. 완전히 동일한 방법으로 다음 두 스택 로드.</li>
		<li>나머지 6 접시 4 스택의 가장 높은 위치에 로드 합니다. 그런 다음, 회전 목마 문을 닫습니다.</li>
		<li>냉각 장치 디스플레이 14 ° c.를 표시 되는지 확인 부드럽게 하 고 반복적으로 1 분 선택한 검사 키트를 반전. 그런 다음 액체 처리기의 전면 패널을 엽니다.</li>
		<li>튜브를 열고 표준 96-잘 레이아웃 (A1, A2, 등등)에 따라 냉각 캐리어에 넣어. 캐리어에서 각 튜브를 배치, 시 같은 96 잘 레이아웃에 쟁반에 그것의 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>크로스 체크 튜브 위치 하 고 모든 관 수준의 고 캐리어에 정착 합니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.</li>
		<li>액체 처리기 소프트웨어의 '시작' 창에서 '실행 유지 관리'를 선택 하 고 물 내리는 프로그램을 엽니다. 시스템에서 20%의 에탄올을 플러시 액체 분배 팁의 outsides를 세척 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>플러시 완료 되 면 '' '시작'으로 돌아가려면 취소를 클릭 합니다. '기존 프로세스 실행'을 선택 하 고 '선택 시작'을 클릭 합니다. 'MRC 키트 분배' 프로그램을 엽니다. 입력 '18' '인스턴스' 구성에서 화면 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>처음 4 개의 플레이트 표시, 가득, 고 봉인 시스템을 모니터링 합니다.</li>
		<li>일단 모든 72 접시는 준비 하 고 다시 회전 목마에에서 배치, 작은 컨테이너 주요 컨테이너에서 커플링 삽입을 전환 합니다. '플러시 시작' 프로그램을 실행 (단계 1.1.10 참조).</li>
		<li>냉각 장치를 해제 하 고 빈 삭제 키트 튜브를 상영. 회전 목마에서 72 준비 접시를 조심 스럽게 제거. 잘못 채워진 또는 제대로 밀폐 접시를 삭제 합니다. 10 ° c.에 준비-사용 판 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시스템 2: 20 좌 판에서 단일 샘플에서 결정 화 방울 (100 nL 단백질 + 100 nL 조건)을 설정
	<ol>
<li>첫째, 그 시스템의 로봇에는, nanoliter 디스펜서는 그것의 소프트웨어, 오픈 되며 액체 처리기의 메서드 관리자는 확인 합니다. 메인 프로그램 시작 됩니다 전에 15 분 정도 microtube 냉각 캐리어를 켭니다.</li>
		<li>플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 접시 제대로 밀봉을 확인 합니다. 테스트 판 마감재 세 번.</li>
		<li>그런 다음 테스트 플레이트에서 100-nL 방울 테스트 솔루션을 설정 하는 nanoliter 디스펜서를 실행 합니다. 현미경 방울 올바르게 설정 되어 있는지 확인 합니다. Nanoliter 디스펜서 소프트웨어 닫고 갑판에서 스트립 홀더 블록을 제거 합니다.</li>
		<li>그런 다음 사용자 정의 설계 플레이트 홀더 삽입 ( 대표 결과참조 하십시오: LMB에 결정 화 장치 개발) (표 1)의 조건에서 휘발성 약의 높은 상대 수량 좌 판. 접시에서 접착 필름을 제거 합니다.</li>
		<li>액체 처리기 전면 패널을 열고 첫 번째 슬라이딩 캐리어 뒤쪽 갑판에 봉인 되지 않은 접시를 장소 (사업자 슬라이딩 수 있습니다 꺼내 접근의 용이성에 대 한).</li>
		<li>SBS 알루미늄 뚜껑 접시 커버. 캐리어의 후면 왼쪽으로 뚜껑 뚜껑의 반대 코너에 부드러운 압력을 적용 하 여 정착.</li>
		<li>벗기, 슬라이딩 사업자로 로드 하 고 같은 방식으로, 적어도 휘발성 조건에 가장에서 일하고 나머지 19 번호판 커버. 일단 microtube 냉각 캐리어 4 ° C에서 녹색 빛에 의해 표시 된 대로, 그것의 덮개를 제거 합니다.</li>
		<li>단백질 샘플 (표 2)의 (적어도) 440 µ L을 포함 하는 microtube의 뚜껑을 잘라. 있는지 확인 하십시오 샘플 초승달 모양, 위의 아무 거품으로이 액체 감지 시스템에 방해가 됩니다. 튜브 microtube 냉각 캐리어의 위치 1에 배치 합니다.</li>
		<li>어댑터 플레이트 이동 캐리어 앞 액체 처리기 갑판에 PCR 접시를 놓습니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.</li>
		<li>갑판을 로드 한 후 nanoliter 디스펜서 갑판은 분명 스트립 홀더 블록의 50 µ L 팁 스택 뒤 캐리어는 알루미늄 SBS 뚜껑의 명확한 확인 합니다.</li>
		<li>액체 처리기 ' 관리 방법 ' 인터페이스에서 '판 설치'를 선택 합니다. 두 시스템의 초기화를 모니터 하 고 실행된 매개 변수를 입력 합니다. 메서드 관리 인터페이스 (프롬프트, 수치 및 준비에 도움이 팁 관리 시스템)의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>필요한 모든 구성 요소는 준비 하 고 다음 과정을 시작 다시 확인 합니다.</li>
		<li>모니터 시스템으로 nanoliter 디스펜서를 첫 번째 접시와 접시 마감재에 연속적으로 접시를 봉인.</li>
		<li>일단 모든 20 접시는 결정 화 방울으로 준비 하 고 자동으로 슬라이딩 통신 사업자에 게 반환, 전면 패널을 열고 플레이트를 부드럽게 제거 합니다. 확인 판 결정 화에 대 한 그들을 저장 하기 전에 제대로 밀봉 된다.</li>
		<li>스토리지에 대 한 액체 처리기의 왼쪽에 그들을 적재 하기 전에 20% 에탄올 솔루션 SBS 뚜껑 청소. PCR 플레이트와는 microtube 삭제 합니다.</li>
		<li>Microtube 냉각 캐리어를 끄고 응축을 닦아. 응축을 더 흡수 냉각기 표면 위에 종이 수건을 남겨 주세요. 다음, 캐리어 덮개를 장착 하 고 전면 패널을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 조건의 최적화
<ol><li>
주사기-기반 액체 처리기: 결정 화 접시 (4 구석 방법)의 저수지에 농도의 2 개의 선형 그라디언트를 생산.
	<ol>
<li>먼저, 액체 처리기에 고 오픈 소프트웨어 초기화를 확인 합니다.</li>
		<li>'그라데이션' 탭: 필요한 프로그램, 저수지 (표 3)에서 결정 화 접시 유형 및 최종 볼륨을 선택 합니다. [소 프로 파 놀] > 10 %v / v와 [MPD] > 20 %v 포함 하는 솔루션을 사용 하는 경우 / 대 3000 6000에서 '최대 총된 집'에 대 한 고급 설정을 인하 해야 한다
</li>
		<li>주사기를 준비 합니다. 각 주사기 (뾰족한 끝 아래)에 피스톤을 놓고 로봇 머리 아래 지정 된 홈에 주사기의 뒷면을 삽입 합니다. 주사기 (프로그램 제대로 연결 하는 모든 필요한 주사기 만으로 시작 됩니다) 위치에 고정 시계 방향으로 트위스트.</li>
		<li>골짜기를 준비 합니다. 스테인리스 스틸 프레임을 제거 하 고 골짜기를 삽입. 왼쪽에는 4 개의 위치 4 모서리 A, B, C, D. 스위치 ( 표 3, 0.5 mL 죽은 볼륨 표시 볼륨에 추가 된)에 각 주사기에 필요한 솔루션의 볼륨을 표시 ' 설정 ' 탭에 해당 합니다. 그들의 각각 골짜기에 모서리 솔루션을 부 어 하 고 프레임 (프레임 고 위치는 갑판의 정면에 있는 2 작은 자석) 갑판에 배치. 이 단계를 계속 하는 다른 방법 때 그들은 이미 갑판에 배치 하는 골짜기에 솔루션을 부 어 하는 것입니다.
</li>
		<li>자동화 한 SBS 캐리어에 결정 화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>'발음'을 클릭 하 고이 단계 (피스톤 중지 된 경우까지 그들의 방법을에) 완료를 기다립니다.</li>
		<li>'실행' 탭으로 전환 하 고 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>완료 되 면 프로그램, 다시 설정 탭으로 이동 하 고 '제거' 클릭: 시스템 남은 솔루션에서 주사기를 제거 하 고 다음 모든 방법을 최대 피스톤을 리프트. '제거' 대신 '제거'를 요구할 수 있습니다;이 하단에 위치, 발음 같은 주사기와 더 많은 솔루션 준비에 디트로이트를 떠날 것 이다.
</li>
		<li>반시계 그들을 왜곡 하 여 주사기를 제거 합니다.</li>
		<li>주사기와 적절 한 빈 골짜기를 버리십시오 (또는 이온된 수 및 다음 다시 20 %v / v 에탄올 솔루션 린스).</li>
		<li>접시를 봉인 하 고 높은 점성 솔루션 혼합 되는 1000 rpm에서 3 분 또는 10 분 microplate 믹서에 두십시오. 접시는 nanoliter 디스펜서에 결정 화 방울을 설정 하기 위한 준비가 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜 1 (미리 첨가제 화면 가득 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정)을 상영 하는 첨가제
	<ol>
<li>첫째, 초기 농도의 약 10% (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송 하는 경우)에 의해 증가 된 상태를 준비 합니다.</li>
		<li>액체 처리기가 작동 준비가 있는지 확인 하십시오. '추가 화면을 첨가제' 단일 플레이트에 대 한 프로그램 (저수지에서 볼륨을 입력: '72 µ L'). 라는, 인물 및 로봇의 선택에 따라 작동 준비가 되었는지 만들기와 정보 관리 시스템 (12 x 1000 µ L 팁 필요) 도움말.
</li>
		<li>-20 ° C 배양 기에서 추가 화면을 검색 하 고 알루미늄 인감 즉시 (플레이트 홀더 사용), 다음 접시 액체 처리기의 갑판에 배치. 프로그램 (접시는 캐리어의 전면 왼쪽에 있는 A1-코너 배치) 세로 레이아웃에 따라 운영 한다. 또한 또한 조건으로 채워진 컨테이너를 놓습니다. 프로그램을 실행 합니다.</li>
		<li>접시의 저수지를 입력 미 판 통에 그것을 놓고 프로그램을 실행 합니다. 재사용을 위한 이온 물, 20% 에탄올 상태의 컨테이너를 씻어.</li>
		<li>
Nanoliter 디스펜서에 방울을 설정합니다. 먼저, 결정 화 접시 (접시 홀더 사용)의 봉인을 해제. 다음, 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록의 첫 번째 위치에 장소. '설정' 탭 제어 소프트웨어에 갑판에 각 부품의 실제 위치를 표시합니다. 각 로드 드롭 크기 필요 (표 4) 단백질 샘플 스트립의 잘. 방울을 준비 하는 프로그램을 실행.
</li>
		<li>완료 되 면 프로그램, 갑판에서 접시를 제거 하 고 즉시 그것을 봉인 (접시 마감재, 3 인치 넓은 접착 테이프를 사용 하 여). 적절 한 상자에 스트립을 삭제 합니다.</li>
		<li>크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜 (재사용 가능한 첨가제 화면 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정) 2를 상영 하는 첨가제
	<ol>
<li>먼저, 첨가제 화면 준비: 해당 냉동된 96 잘 셀 문화 접시 40 분 동안 실 온에서 해 동을 떠나. 그런 다음 2 분 1000 x g에서 첨가제 화면 원심.</li>
		<li>조건 (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송)을 준비 합니다.</li>
		<li>상태와 결정 화 96 잘 접시의 저수지를 채우십시오. 액체 처리기에 프로토콜 1으로 같은 방식으로 진행, 2.2.2, 단계 하지만 저수지에서 볼륨에 대 한 '80 µ L'을 입력.</li>
		<li>(결정 화 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록, 표 4의 첫 번째 위치에 추가 화면을 포함 하는 접시) 갑판에 3 구성 요소와 함께 nanoliter 디스펜서에 방울을 설정 합니다.</li>
		<li>알루미늄 시트와 화면을 포함 하는 셀 문화 접시를 봉인 하 고 다시-20 ° C 인큐베이터에에서 배치.</li>
		<li>크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

LifeArc가 다음 항목 이후 우리는 이로써 충돌 상업적인 관심 상태: 96-및 48-잘 MRC 번호판, MRC 매달려 드롭 물개, 모 피어스, Pi, ANGSTROM와 LMB 결정 화 화면.

1-준비 및 초기 스크린 판에 저장 된의 사용
가벼운 강 수 또는 단계 분리 저장 하는 동안 일부 튜브에서 발생 하기 때문에 접시에 분배 되 고 전에 키트 상영을 혼합 한다. 화면 두 키트 (2 x 48 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 냉각 캐리어의 위치에서에 배치 됩니다. 때 화면 4 키트 (4 x 24 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브에 위치 c 1에에서 배치 됩니다, 세 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 위치에 놓이고 4 키트의 첫 번째 튜브 위치 g 1에에서 배치 됩니다. 그들의 냉각 캐리어에 튜브를 삽입 하는 동안 뚜껑 표준 96-잘 가로 레이아웃에 따라 트레이에 배치 됩니다. 잘 번호 제조 업체에 의해 뚜껑 위에 표시 됩니다, 이후 수 있습니다 검사 경우 모든 튜브 올바른 순서에 배치 되었습니다. 이 또한 접시의 감소 된 수를 채울 때 튜브에 올바른 뚜껑을 대체 하기 도움이 됩니다.
10 ° C, 및 씰링과 악화 조건 및 문제를 일으킬 수 있는 4 ° C에서 스토리지를 피하기 위해 타협에서 미리 채워진된 접시 저장 합니다. 접시를 위한 저장 됩니다 일반적으로 눈에 띄는 비응결 내부 얼굴에는 인감의로 몇 개월. 이것은 LMB05, LMB06, LMB09 및 LMB10 번호판에 대 한 적은 사실 휘발성 약 (표 1)의 상대적으로 높은 농도 가진 조건 포함. 인감의 안쪽에 작은 양의 응축 봉인 하는 효율을 감소 시키고 번호판 봉인 하는 동안 우물 사이의 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 도움이 동안 초기 냉각 응축 방지, 접시는 하룻밤 4 ° C의 찬 룸에 저장 되어 있는 절연된 피크닉 쿨러에 회전 목마에서 먼저 전송할 수 있습니다. 봉인 된 우물 내의 온도 기울기의 개발을 최소화 하 고 따라서 응축을 감소 매우 느린 냉각 전체15. 또한, 일단 판을 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다, 사내 사용자 지정 SBS 폴리스 티 렌 뚜껑 (표시 되지 않음) 각 스택 상단에 접시에 배치 됩니다.
우리의 미리 채워진된 접시의 전체 집합은 소설, 수용 성, 단백질 샘플에 대 한 큰 초기 화면으로 사용할 수 있습니다. 또는, 더 적은 접시 특정 요구 사항과 일치 하도록 선택할 수 있습니다. 예를 들어 LMB15 및 LMB19 막 단백질 샘플26,27, 특별히 공식화 화면 또는 LMB20 회절 데이터28 의 실험적인 단계적으로 촉진 하기 위하여 무거운 원자와 공식화 화면 (참고 : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">모 피어스 단백질 결정 화 스크린의 공식</a>).
2. 결정 화 방울 설정
2 시스템을 사용 하면 상당한 양의 휘발성 시 약 키트를 심사 해야 처리 처음. 이 뚜껑 처리 및 플레이트 씰링에 영향을 미칠 수 있는 SBS 뚜껑의 고무에 형성 하는 결로 방지 합니다. SBS 뚜껑은 처음 정렬 하는 데 필요한 이유는 접시 위에 때 클리어런스의 비트 ( 프로토콜, 단계 1.2.6 참조). PCR 격판덮개의 우물에서 단백질 죽은 볼륨은 상대적으로 관대 (0.8 µ L, 표 2의 참조 전설). Note는 동등 하 게 관대 한 죽은 볼륨은 고용 8 잘 스트립 (표 4)에 단백질으로 nanoliter 디스펜서를 개별적으로 사용 하는 경우. 그러나 작은 죽은 볼륨 작동 수 있습니다 일부 샘플 팁에 고착 하는, 로봇의 캘리브레이션 약간 정확 하지 않은 될 수 있습니다, 그리고 방을 평소, 등보다 따뜻한 될 수 있습니다. 모든 접근을 통합 하기 위하여 관대 한 죽은 볼륨에 의해 처리 하는 샘플 손실 이어질.
최근 개발 사용 추가 실험의 소형화 및 결정 화 조건 심사에 필요한 샘플의 볼륨을 해당 기술29,30 통합 하 여 크게 줄어들 수 있다 따라서 . 그러나, 더 소형화의 몇 가지 측면 방울31 의 증발 및 microcrystals32의 조작 등 신중한 검토가 필요합니다.
마지막으로, 결정 화 방울 (구형 위-웰 스)에서 설정할 때 원심 분리 (2000 rpm, 1 분) 접시의 일상적인 마지막 단계로 통합 될 수 있습니다. 보다 일관성 있는 크기와 모양 방울 원심에서 결과의 재현성 문제33,34을 줄일 수 있습니다. 확실 하 게 가운데 방울 전체 접시에 걸쳐 필요한 초점 거리와 비슷한 것으로 현미경을 사용 하 여 실험의 최신 평가 쉽게 것입니다.
3. 4 구석 방법의 장점
4 구석 방법의 가장 중요 한 장점은 단순, 오류를 최소화 하 고 간단한 자동화 프로토콜을 용이 하 게입니다. 예를 들어 4 코너 솔루션 항상 동일한 레이아웃에 따라 액체 처리기의 갑판에 배치 됩니다. 또한, 모든 프로그램은 (그림 3C) 솔루션 간의 고정된 비율 기반으로 합니다. 4 코너 솔루션의 수동 준비는 고 점도 될 수 있는 높은 농도에서 솔루션의 자동화 된 처리를 선호. 상대적으로 신속 하 고 정확한 포부/분배는 다음 대부분 액체 클래스의 최적화에 대 한 최소 요구 사항을 액체 처리기의 종류. 그럼에도 불구 하 고, 일부 코너 솔루션 여전히 너무 점성 액체-효율적으로 작동 하도록 시스템으로 운영 하는 로봇에 대 한 수 있습니다. 이 때문에 우리는 액체 처리기 긍정적인 변위 (그림 3B)와 운영에 대 한 하기로 했다.
농도의 2 선형 그라디언트, 뿐만 아니라 세 번째 구성 요소 (즉, 버퍼/첨가제의 집합) 편리한 방법으로 일정 농도에서 시험 수 있다. 이 위해, 다양 한 구성 요소를 제외 하 고 적당 하 게 높은 농도에 코너 솔루션의 핵심 집합의 비교적 큰 볼륨 먼저 준비 된다. 그런 다음이 구성 요소를 포함 하 여 재고 솔루션 최종 농도 조정에 추가 됩니다. 예를 들어 50 mL 4 코너 솔루션의 세트의 처음 보다 10% 높은 농도에서 준비 된다. 이 코어 세트는 다음 4 5 더 작은 하위 집합으로 분할 됩니다. 마지막으로, 다른 버퍼 pH 해결책의 볼륨의 10%는 각 하위 집합에 추가 됩니다.
4. 형식 및 첨가제 스크린의 종류
화면 때문에 그들은 정기적으로 사용 되지 않습니다-20 ° C (그림 4)에서 일반적으로 저장 되 고 휘발성/불안정 한 화합물을 포함. 깊은 우물 블록 (1 mL 스에서)에 저장 하는 냉동된 첨가제 스크린의 사용은 12-24 시간 실 온에서 완전히 해 동 모든 첨가제 솔루션에 대 한 걸릴 것입니다 때문에 일찍 계획 해야 합니다. 또한, 다양 한 사용자가 잠재적으로 교차 오염 문제를 일으키는 동일한 첨가제 화면을 공유 합니다. 마지막으로, 깊은 우물 블록의 높이 그들이 부적 절 한 대부분 nanoliter 디스펜서에 대 한 있습니다. 편리한 솔루션으로 이러한 문제를 회피, 로우 프로 파일 번호판 (그림 4) 화면 깊은 우물 블록에서 전송 한다.
역사적으로, 첨가제 화면 (단일 농도)와 단일 시 약의 광범위 한 다양 한 포함 하는 매우 인기 있는35,36되었습니다. 그러나, 다른 유형의 첨가제 화면 개발 되었습니다 첨가제37 또는 다른 농도38에서 발견 한 첨가제의 감소 된 수의 혼합을 통합 하는. 마지막으로, 상호 보완적인 접근 결정 화39,40이전 샘플에 첨가물의 효과 조사입니다.
5. 더 많은 고려 사항
좋은 연습: 나도 독성 물질을 포함 하는 대부분의 화면 하 고 따라서 적절 한 개인 보호 프로토콜 동안 고용 해야 합니다. 마찬가지로, 로봇의 부품을 이동 (비록 로봇의 대부분은 비상 정지 버튼/시스템) 프로그램이 실행 되는 동안 수동으로 방해 하려고 할 때 특히 부상, 발생할 수 있습니다. 참여, 일반 기술 복잡성 때문에 검사 로봇, 스크린 및 프로그램의 이전 특징 테스트 샘플 재현성의 지속적인된 높은 수준에 대 한 중요 하다.
처리량: 표시로 4000 8000 LMB 사이 격판덮개 생산 시스템 1 연간 (과 이후 초기 심사에 대 한 사용자). 그것은 하지 재고 다량 예상된 회전율은 4-5 개월 후, 어떤 조건으로 훨씬 낮은 때 10 ° C에서 미리 채워진된 접시의 악화 및 증발 하기 시작할 것 이다 적응. 작은-중간 크기 실험실41에 대 한 다른 접근 자동화 프로토콜을 구현 되었습니다.
저장 및 실험 평가: 방울을 준비 하 고, 후 접시에 긴밀 하 게 제어 된 온도 (± 0.5 ° C 최대 편차) 4 개 또는 18 ° C에서 낮은 진동 선반에 저장 됩니다. 실험 감기 빛 소스 현미경을 사용 하 여 평가 됩니다. 그러나 하나 신중 하 게 모든 측면을 고려해 다양 한 자동화 된 이미징 시스템 상업적으로 사용할 수 있습니다: 속도 접시를 스캔 하는 데 필요한 높은 처리량에 대 한 충분 한 것? 크리스탈 이외의 개체 자동 초점을 방해할 것 이다? 이미지의 결과 품질 (특히 주위에 작은 물방울의 가장자리) 자리 매우 작은 결정을 충분 한 것인가? 42 , 43 , 44
결정 화 조건 비교: 처음 얻은 결정의 본질에 대 한 신중한 조사 후 하나 <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB 화면 데이터베이스</a> 또는45c 6 <a href="http://c6.csiro.au/">웹 도구</a>사용 하 여 조건을 통해 트렌드와 유사성을 분석할 수 있습니다.

X 선 결정학은 더 원자 수준에서 생물학 및 질병 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 전진 하 고 이후에 약물 발견1합리적인 접근을 지원 하기 위해 광범위 하 게 적용 됩니다. 이 위해 순화 되며 단백질, DNA, RNA, 다른 ligands, 및 그들의 복합물의 집중된 (2-50 mg/mL) 고분자 샘플 trialed 양식에 그들의 성향을 결정 화2,3 통해 3 차원 격자 주문에 대 한 ,4. 높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도5,6근처에서 해결 될 수 있습니다. 결정적인 소설 샘플을 구체화 하는 조건을 예측할 수 없는 그리고 높은 품질 결정의 수익률은 대개 매우 낮은. 근본적인 이유는 관심의 많은 샘플 불안정 결정 (일반적으로 몇 일) 화에 대 한 해당 날짜 표시줄에 그들을 만드는 도전 생화학 속성. 마지막으로, 과정 샘플 및 샘플 변형, 생성 하 고 그들의 정화 및 결정 화7,8을 최적화 하는 데 필요한 시간에 의해 합성 된다.
결정 화 조건 샘플 용 해도 감소 시키는 비례적으로 솔루션 이며 조건에도 자주 버퍼 및 첨가제 포함. 이러한 시 약의 수백 그들은 낮은 성향 (예: 단백질 또는 핵 산 전개) 샘플 무결성을 방해 하는 결정 화 실험의 매개 변수를 변경 하 잘 적응 된다. 동안 수백만의 결정 화 시 약의 조합 테스트 하는 것이 불가능, 많은 검사 키트-다양 한 전략9와 공식화를 여러 테스트,10 -가능 하다 소형된 시련과 자동화 된 프로토콜. 이 관점에서 가장 의무가 기술이 이다 아마 100-200 nL 방울 전문된 결정 화 접시11 구현 결정 화 조건 (25-250 µ L)를 포함 하는 저수지 위에 작은 우물에 앉아 함께 증기 확산 , 12. 단백질 샘플 및 조건 자주 200의 전체 볼륨에 대 한 1:1 비율로 결합 nL 위 우물에서 물방울을 설정할 때. 로봇 nanoliter 단백질 결정 화는 대체 기술 및 플레이트-오일 일괄13 등 Lipidic 입방 단계14 (최신 하나는 횡단 막 단백질에 구체적으로 적용 되 고 구현 될 수 있습니다. 매우 저조한 물에 용 해).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB에 결정 화 시설</a> 2000 년대 초반에 시작 하 고 우리의 자동화 프로토콜의 초기 요약 200515에 제시 했다. 단백질 결정 화에 대 한 역사적 소개를 제시 했다 하 여도 로봇 nanoliter의 장점의 개요 (다음 일상적인 실험 소설 접근). 고분자의 결정 화 이후 품질 회절 결정16의 수익률 증가 고용 (적합 한) 초기 조건의 광범위 한 다양 한 매우 거의 또는 전혀 유용한 사전 정보를 기본적으로 확률 과정. 게다가, 초기 대형의 자주 간과 이점을 크게 샘플 및 많은 경우에 결정의 최적화에 대 한 필요성을 줄이는 것입니다. 물론, 하나 여전히 나중에 몇 가지 초기 조건의 최적화를 진행 하 고 해야 합니다. 일반적으로, 시 약의 pH 농도 체계적으로 조사 다음. 더 많은 시 약 또한 추가 결정의 매개 변수를 변경 하는 최적화 된 조건으로 도입 수 있습니다. 물론, 하나 신선한 샘플 결정 화를 시도 한다, 따라서 해당 프로토콜 해야 간단 하 고 사용 가능한 언제 든 지.
여기, 두 완전히 MRC LMB (시스템 1과 2)에서 설계 시스템 자동화 되 고 해당 프로토콜을 완벽 하 게 같습니다. 이 두 시스템의 주요 응용 프로그램은 초기 증기 확산 앉아 드롭 결정 화 접시에 의해 심사. 시스템 1 통합 액체 처리기, 재고 번호판 자동된 회전 목마, 플레이트 라벨에 대 한 잉크젯 프린터와는 접착 판 마감재. 시스템 1, 72 96 잘 접시는 상업적으로 이용 가능한 검사 키트 (시험관에 10ml의 시작 볼륨에서 저수지로 조건의 80 µ L)으로 가득, 레이블이 고 봉인. 판 다음 그들이 사용할 수 있는 사용자에 게 언제 든 지 (초기 화면 '좌 판' 이라고 함)으로 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다.
시스템 2 통합 액체 처리기, nanoliter 디스펜서와 접착 판 마감재. 시스템에서 2, 증기 확산 실험에 대 한 방울 (100-1000 nL) 앉아 조건을 결합 하 여 생산 그리고 20 48 또는 96 잘 접시의 위 우물에서 샘플 미리로 조건. 즉, 1920 초기 심사 조건이 trialed 시스템 2에 20 LMB 접시를 사용 하는 경우.
로봇은 개별적으로 선택한 조건의 최적화에 대 한 및 해당 반자동된 프로토콜도 같습니다. 4 구석 방법17 최적화 화면을 생산 하기 위해 정기적으로 채택 된다. 해당 프로토콜은 처음 4 솔루션 ('A, B, C 및 D')의 수동 준비를 필요합니다. 다음 두 개의 선형 그라디언트 (두 가지 주요 결정 화 에이전트)에 대 한 농도의 결정 화 접시의 저수지에 직접 자동으로 생성 됩니다. 이 위해, 주사기 기반 액체 처리기는 다른 비율에서 4 코너 솔루션 dispenses.
추가 조건 최적화, 잠재적으로 결과 결정18의 속성을 향상 시키는 첨가제 화면 사용할 수 하나. 두 방법 첨가물 심사에 사용할 수 있습니다: 결정 화 접시의 저수지에 방울 (프로토콜 1)을 설정 하기 전에 적절 한 첨가제로 시작 하는 프로토콜 및 다른 프로토콜 추가 화면이 나 옵 직접에 방울 (프로토콜 2).
다른 유용한 개발 자동화 된 고분자 결정 화를 촉진 하기 위하여 MRC LMB에 시작 했다 또한 제공 됩니다. 기본적으로, 결정 화 접시와 관련 된 장치 등을 쌓을 수 있는 사회의 바이오 심사 (SBS)는 뚜껑에 2 시스템을 사용 하 여 조건의 증발을 최소화 해야 합니다.
간단히, 사용자가 기본 기능 및 nanoliter 디스펜서, 잉크젯 프린터와 접착 판 마감재의 유지 보수에 익숙한 가정 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 접시 로봇의 갑판에 배치 되도록 잘 A1 ('A1-코너 ')는 플레이트 캐리어의 후면 좌측 구석으로.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>해당 없음</td><td>리퀴드 핸들러(시스템 1). 시스템 액체를 기준으로 한 흡인/분배. 자동화된 캐러셀을 통합합니다. EVOware plus 제어 소프트웨어 v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로랩&reg; 스타&트레이드;</td><td>Hamilton</td><td>해당 없음</td><td>리퀴드 핸들러 (시스템 2). 용적변위(CO-RE&trade; 기술)를 기반으로 한 흡인/투주. Hamilton STAR 제어 소프트웨어 v.4.3.5.4785(분석법 관리 인터페이스 포함).</td></tr><tr><td>모기&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/액</td>적<td>(시스템 2 및 독립형), 3위치 데크를 설정하는 데 사용되는 마이크로 주사기 기반 나노리터 디스펜서. 제어 소프트웨어 v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>잠자리&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>는</td><td>최적화 스크린을 생산하는 데 사용되는 주사기 기반 액체 핸들러 (4-corner 방법)를 사용하지 않습니다. 제어 소프트웨어 v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>접착 플레이트 실러</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>시스템 1 및 2에 통합됨(독립형 로봇으로도 사용됨).</td></tr><tr><td>잉크젯 프린터 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>해당 사항 없음</td><td>시스템 1에 통합됨. 터치스크린 인터페이스.</td></tr><tr><td>Crystallization Screens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Crystallization kit (test tubes, condition 당 10mL)는 LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&trade</td>에서 사용됩니다;LMB01 Wizard&trade에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>); </td> LMB02 Wizard&trade에서 사용되는 Classic 1 <td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Crystallization kit (test tubes, 조건 당 10mL</td></tr><tr><td>); LMB02</td><td></td> 그리드 스크린&트레이드에서 사용되는 클래식 2 <td>Rigaku</td> 1009531 <td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>); 황산 암모늄</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL)는 LMB03</td></tr><tr><td>그리드 스크린 및 무역에 사용됩니다. PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)는 LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade</td>에 사용됩니다.<td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)는 LMB03</td></tr><tr><td>그리드 스크린에 사용됩니다. 염화나트륨</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)는 LMB03</td></tr><tr><td>그리드 스크린에 사용됩니다. PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)는 LMB04</td></tr><tr><td>그리드 스크린&트레이드에 사용됩니다. MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건에 따라 10mL)는 LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade</td>에서 사용됩니다.LMB04 PEG/Ion&trade에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB05 Natrix&trade에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB05 Crystal Screen Lite&trade에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB06 Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr>) <tr><td></td><td></td><td>해당 없음</td>: <td>LMB06 Wizard&trade에서 사용되는 결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>); Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>결정화 키트 (테스트 튜브, 조건당 10mL)는 LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade에서 사용됩니다. Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>LMB07에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>LMB08에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>LMB08에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>LMB08에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>LMB08에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>LMB09에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL</td></tr>) <tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>LMB09에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>LMB09에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>LMB09에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>LMB10에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건별 10mL)</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>LMB10 Clear Strategy&trade에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>); 스크린 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; 스크린 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; 스크린 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)는 LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용됩니다. Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; 스크린 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; Screen 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; 스크린 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade에서 사용; Screen 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL) LMB12</td></tr><tr><td>Index&trade</td>에서 사용;LMB13 SaltRX&trade에서 사용되는 <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr>); LMB14 SaltRX&trade<tr>에서 사용되는<td>1</td>개의 <td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr>); <tr><td>LMB14</td> MemStar&trade에서 사용되는 2개의 <td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL</td></tr><tr><td>);</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL)는 LMB15</td></tr><tr><td>MemSys 및 trade</td>에서 사용됩니다.<td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>결정화 키트 (테스트 튜브, 조건에 따라 10mL)는 LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade에서 사용됩니다; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td> LMB16 MORPHEUS&reg; 화면에 사용된 결정화 <td>키트(시험관, 조건당 10mL)</td></tr><tr><td>Molecular</td><td>Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>LMB17 Pi 최소 화면에 사용된 결정화 키트(시험관, 조건당 10mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>결정화 키트(시험관, 조건당 10mL) LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG 화면에</td> 사용 <td>JenaBioScience</td>LMB19 MORPHEUS&reg에 사용된 <td>CS-128</td><td>결정화 키트(시험관, 조건별 10mL</td></tr><tr><td>); II 스크린</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>결정화 키트 (시험관, 조건당 10mL)는 LMB20</td></tr><tr><td>LMB 결정화 스크린 및 거래</td>에 사용됩니다.<td></td> LMB21Additive screens<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>HT 첨가제 스크린에 사용되는 Molecular Dimensions Ltd MD1-98 결정화 키트(테스트 튜브, 조건당 10mL) <tr><td></td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>96웰 딥웰 블록(웰당 1mL)에서 동결.</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; 첨가제 스크린</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>96-well deepwell 블록(500 &micro; L per well)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>ANGSTROM 부가적인 screen&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>96웰 딥웰 블록(웰당 1mL)에서 냉동.</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; 첨가제 스크린</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>96-well 세포 배양 Costar&reg; 플레이트에 V자형 웰 (100 &micro; L per well)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>ANGSTROM 부가적인 screen&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>96-웰 세포 배양 Costar&reg; 플레이트와 V-shaped 웰 (100 &micro; L per well)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>히포크라테스 첨가제 스크린</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 단일 첨가제 (MORPHEUS&reg에서 발견되는 약물 화합물; III)에 있습니다.</td></tr><tr><td>기타 소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop plate</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate. 리저버 권장 용량: 80&nbsp; &마이크로;L. 유용한 액적 부피 범위: 10-1000nL. UV 투과성.</td></tr><tr><td>48-웰 MRC 1-드롭 플레이트&nbsp; ('맥시 플레이트')</td><td>스위스시</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>스케일업/최적화를 위한 Sitting-drop, 증기 확산 플레이트. 리저버 권장 용량: 200&nbsp; &μm;L. 유용한 액적 부피 범위: 0.1-10 &마이크로;L. UV 투과성.</td></tr><tr><td>MRC 행잉 드롭 씰</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hanging-drop, MRC 증기 확산 플레이트(MRC 96T-UVP 및 MMX01-UVP)와 호환 가능. UV 및 X선 투과성.</td></tr><tr><td>접착 밀봉 테이프</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3인치 와이드 Duck&reg; HD 클리어&트레이드; 실러 및 수동 씰링용.</td></tr><tr><td>접착 알루미늄 시트</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>첨가제 스크린을 재밀봉하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>잉크 카트리지</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1(잉크젯 프린터).</td></tr><tr><td>솔벤트 카트리지</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (잉크젯 프린터).</td></tr><tr><td>50 &마이크로; L 팁&nbsp;</td><td>해밀턴</td><td>235947</td><td>시스템 2 (STAR&trade; 액체 처리기). 1920 x CO-RE&trade가 포함된 6세트 상자; 일회용 스택의 팁.</td></tr><tr><td>시약 용기</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>첨가제 스크리닝 프로토콜 중에 플레이트에 조건을 분배하는 데 사용됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 플레이트</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>시스템 2(모기로 전달될 단백질 포함). Abgene Diamond ultra, 384 V 자형 우물.</td></tr><tr><td>마이크로 주사기</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Mosquito&reg; 나노리터 디스펜서용 26,000개의 마이크로 주사기 스풀(9mm 간격).</td></tr><tr><td>스트립 홀더 블록</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Mosquito&reg; 스트립용 SSB 장치, 일명 '4방향 시약 홀더'.</td></tr><tr><td>2 &마이크로; L 8웰 스트립</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Mosquito&reg;의 갑판에 단백질이 포함되어 있습니다. 40 스트립의 상자, 최대. vol. 우물에서 3.2 & L.입니다.</td></tr><tr><td>5 &마이크로; L 8웰 스트립</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Mosquito&reg;의 갑판에 단백질이 포함되어 있습니다. 40 스트립의 상자, 최대. vol. 우물에서 7.5 & L.입니다.</td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>주사기 본체 및 피스톤 Dragonfly&reg; 액체 처리기용. 100개 팩.</td></tr><tr><td>최저점/저수지</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Dragonfly&reg;의 갑판에 재고 솔루션이 포함되어 있습니다. 50개 팩.</td></tr><tr><td>오비탈 마이크로플레이트 쉐이커</td><td>CamLab Limited</td><td>해당 없음</td><td>Variomag&reg; 단일 플레이트(0-2000 rpm)의 혼합 조건용.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 믹서</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. 96개의 진동 핀이 있는 단일 플레이트의 혼합 조건.</td></tr></tbody></table>

분자 생물학의 mrc 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도 근처에서 해결 될 수 있습니다. 그러나 단백질, DNAs, RNAs, 그리고 그들의 복합물을 구체화 하는 조건을 수 없습니다 전망 했다. 고용 조건의 광범위 한 다양 한 품질 회절 결정의 수확량을 증가 하는 방법 이다. 2 완전 자동화 된 시스템 nanoliter 방울에 증기 확산 하 여에서 MRC 연구소의 분자 생물학 (케임브리지, 영국, MRC-LMB) 1920 초기 조건에 대 한 결정 화 심사를 용이 하 게 개발 되었습니다. 반자동된 프로토콜 또한 pH, 시 약의 농도 변경 하 여 또는 잠재적으로 결과 결정의 속성을 향상 시키는 첨가제를 도입 하 여 조건을 최적화 하기 위해 개발 되었습니다. 모든 해당 프로토콜에에서 대해서 자세히 설명 하 고 간단히 설명 됩니다. 그들은 편리 하 고 고효율 고분자 결정 화는 다중 사용자 기능에는 사용자가 그들의 실험의 주요 매개 변수 제어를 제공 하는 동안 활성화 함께 찍은.

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

이 절차의 전반적인 목표는 초기 결정화 스크리닝 조건으로부터 고품질의 결정을 생성하는 것입니다. 생성된 결정은 단백질, DNA, RNA 및 이들의 복합체 구조를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 거대 분자 구조에 관한 연구는 점점 더 까다로워지고 있습니다.다양한 초기 조건을 제공하면 유용한 결정의 수득률을 높이는 동시에 샘플 및 결정 최적화의 필요성을 줄일 수 있습니다. 두 개의 완전 자동화 시스템인 LMB는 나노리터 드롭렛을 이용한 최대 1,920개의 증기 확산 실험 준비를 용이하게 합니다. 간결함을 위해, 사용자가 나노리터 디스펜서, 잉크젯 프린터 및 접착식 플레이트 실러의 기본 기능과 유지보수 방법에 이미 익숙하다고 가정합니다.절차를 수행하기 전, 시스템의 로봇들이 초기화되었는지 그리고 제어 소프트웨어가 실행 중인지 확인하십시오. 메인 프로그램이 시작되기 약 30분 전에 튜브 냉각 캐리어의 칠러를 켜십시오. 플레이트 실러의 전동 SBS 캐리어 위에 테스트 플레이트를 배치하십시오.플레이트 씰러를 작동시키고 필름이 적절하게 부착되었는지 확인하십시오. 플레이트 씰러가 준비되었는지 확인하기 위해 이 테스트를 두 번 더 반복하십시오. 그런 다음 액체 핸들러의 메인 컨테이너에 탈이온수 20 liters를 추가하십시오.커플링 인서트를 20% ethanol 세척액이 담긴 작은 용기에서 분리하여 메인 용기에 연결합니다. 잉크젯 프린터 터치스크린에 적절한 스크린 이름을 입력하십시오. 그다음 캐러셀 도어를 열고 닫아 캐러셀 회전을 트리거합니다.첫 번째 스택이 나타나면 문을 엽니다. 1번 컬럼이 바깥쪽을 향하도록 하여 첫 번째 스택에 22개의 결정화 플레이트를 가득 채웁니다. 다음 두 개의 스택도 동일한 방식으로 가득 채웁니다.남은 6개의 플레이트를 네 번째 스택의 가장 높은 위치에 로드한 다음, 캐러셀 도어를 닫으십시오. 칠러 디스플레이에 14 °C로 표시되는지 확인하십시오. 선택한 스크리닝 키트를 1분 동안 부드럽게 반복해서 반전시키십시오.그런 다음, 액체 핸들러의 전면 패널을 엽니다. 튜브를 열어 표준 96-웰 레이아웃에 맞춰 냉각 캐리어에 배치합니다. 각 튜브를 캐리어에 배치할 때, 튜브 캡을 동일한 96-웰 레이아웃으로 트레이 위에 놓습니다.System 1을 사용할 때는 튜브가 올바르게 배열되었는지 교차 확인하기 위해 레이블 리드(label leads)를 96-웰 레이아웃의 트레이 위에 배치합니다. 튜브의 위치를 교차 확인한 후, 모든 튜브가 캐리어 내에서 수평을 유지하며 안정적으로 안착되었는지 확인하십시오. 그 다음 전면 패널을 닫으십시오.액체 핸들러 소프트웨어의 Startup 창에서 Run Maintenance를 선택하고 Flushing 프로그램을 엽니다. 프로그램을 실행하여 시스템에서 20% ethanol을 배출하고 액체 분주 팁의 외부를 세척합니다. 플러싱이 완료되면 Cancel을 클릭하여 Startup으로 돌아갑니다.'기존 프로세스 실행(Run An Existing Process)'을 선택하고 '선택 시작(Start Your Selection)'을 클릭하십시오. MRC 키트 분주 프로그램을 엽니다. 구성 화면의 '인스턴스(Instances)'란에 18"를 입력하고 프로그램을 실행하십시오. 처음 4개의 플레이트에 라벨이 부착되고, 채워지고, 밀봉되는 동안 시스템을 모니터링하십시오.처음 4개 플레이트의 준비가 완료될 때까지 시스템을 방치하지 마십시오. 72개 플레이트가 모두 준비되어 캐러셀에 다시 배치되면, 커플링 인서트를 탈이온수 용기에서 20% ethanol 용기로 교체하십시오. 이전과 동일한 과정으로 스타트업 플러시 프로그램을 실행하십시오.칠러를 끄고 빈 스크리닝 키트 튜브를 폐기하십시오. 캐러셀에서 준비된 72개의 플레이트를 조심스럽게 꺼냅니다. 잘못 채워졌거나 밀봉 상태가 불량한 플레이트는 폐기하십시오.사용 가능한 플레이트를 10 °C에서 보관하십시오. 먼저 시스템 로봇이 켜져 있는지, 나노리터 디스펜서가 소프트웨어가 열린 상태로 초기화되었는지, 그리고 리퀴드 핸들러의 메소드 매니저가 열려 있는지 확인하십시오. 메인 프로그램이 시작되기 약 15분 전에 마이크로튜브 쿨링 캐리어를 켜십시오.플레이트 실러의 전동 SBS 캐리어에 테스트 플레이트를 놓습니다. 플레이트 실러를 작동시켜 플레이트가 적절하게 밀봉되었는지 확인합니다. 플레이트 실러 테스트를 3회 반복합니다.그런 다음 나노리터 디스펜서를 작동시켜 테스트 플레이트에 100 nanoliter의 테스트 용액 액적을 분주합니다. 여기 보이는 것은 나노리터 디스펜서로 생성한 100 nanoliter 액적의 광학 현미경 사진이며, 붉은색 염료로 만든 테스트 용액이 사용되었습니다. 나노리터 디스펜서 소프트웨어를 종료하고 데크에서 스트립 홀더 블록을 제거하십시오.다음으로, 실험 조건 중 휘발성 시약의 상대적 양이 가장 많은, 미리 채워진 96-웰 결정화 플레이트를 맞춤 설계된 플레이트 홀더에 장착하십시오. 플레이트에서 접착 필름을 제거합니다. 액체 핸들러의 전면 패널을 열고, 밀봉을 해제한 플레이트를 첫 번째 슬라이딩 캐리어 뒤쪽의 데크 위에 놓으십시오.SBS 알루미늄 덮개로 플레이트를 덮습니다. 덮개의 반대쪽 모서리를 가볍게 눌러 덮개가 캐리어의 왼쪽 뒷모서리 쪽으로 밀착되도록 합니다. System 2를 사용할 때는 휘발성 시약이 많이 포함된 스크리닝 키트를 먼저 처리해야 합니다.이렇게 하면 SBS 리드에 응결물이 형성되는 것을 방지할 수 있으며, 응결물은 리드의 자동 처리나 플레이트 밀봉에 영향을 줄 수 있습니다. 밀봉을 해제하고 슬라이딩 캐리어에 적재한 후, 휘발성이 가장 높은 조건부터 낮은 조건 순으로 나머지 19개의 플레이트도 동일한 방식으로 덮으십시오. 녹색 표시등으로 표시되는 대로 마이크로튜브 냉각 캐리어가 4 °C에 도달하면 덮개를 제거하십시오.최소 440 µL의 단백질 샘플이 담긴 마이크로튜브의 뚜껑을 잘라냅니다. 액체 검출 시스템에 간섭을 줄 수 있으므로, 액체 표면 위에 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 해당 튜브를 마이크로튜브 냉각 캐리어의 1번 위치(Position 1)에 배치합니다.플레이트 이동 어댑터 캐리어 앞의 액체 핸들러 데크 위에 PCR 플레이트를 놓으십시오. 그런 다음 전면 패널을 닫으십시오. 액체 핸들러 방법 관리 인터페이스에서 플레이트 설정(Setup Plates)을 선택하십시오.두 시스템의 초기화를 모니터링하고 플레이트 유형, 각 조건별 드롭 수, 드롭 크기, 처리할 첫 번째 플레이트의 위치 및 플레이트 수를 포함한 런 파라미터를 입력하십시오. 덱 로딩 도움 여부를 묻는 메시지가 나타나면 '아니오'를 클릭하십시오. 빈 팁 랙이 없는지 확인한 후 '확인'을 클릭하십시오. 런에 필요한 팁이 충분한지 확인한 후 '확인'을 클릭하십시오. 필요한 경우 팁 관리 시스템을 업데이트하고 '확인'을 클릭하십시오. 나노리터 디스펜서 덱에 스트립 홀더 블록이 없는지, 캐리어가 50 µL 팁 스택의 뒤쪽에 위치하며 알루미늄 SBS 리드에 걸리지 않는지 확인하십시오.다른 모든 필수 구성 요소가 준비되었는지 다시 한번 확인한 후 프로세스를 시작하십시오. 나노리터 디스펜서가 첫 번째 플레이트에 액적을 분주하고, 이후 플레이트 실러가 플레이트를 밀봉하는 동안 시스템을 모니터링하십시오. 첫 번째 플레이트의 준비가 완료될 때까지 시스템을 방치하지 마십시오.20개의 모든 플레이트에 결정화 드롭렛이 준비되어 슬라이딩 캐리어로 자동 복귀하면, 전면 패널을 열고 플레이트를 조심스럽게 꺼냅니다. 결정화를 위해 보관하기 전 플레이트가 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. SBS 리드는 20% ethanol 용액으로 세척한 후, 보관을 위해 액체 핸들러 왼쪽에 쌓아 둡니다.PCR 플레이트와 마이크로튜브를 폐기하십시오. 마이크로튜브 냉각 캐리어를 끄고 응결된 물방울을 닦아내십시오. 추가 응결물을 흡수할 수 있도록 쿨러 표면 위에 종이 타월을 올려두십시오.그런 다음 캐리어 커버를 교체하고 전면 패널을 닫습니다. OmpF와 MreB는 처음에 이러한 완전 자동화 프로토콜을 사용하여 스크리닝되었습니다. X-선 회절에 충분한 품질의 OmpF 결정이 LMB 7 플레이트의 A4 웰에서 발견되었습니다.MreB의 회절 품질 결정이 LMB 20 플레이트의 D12 웰에서 발견되었습니다. 사전 충전 플레이트를 10 °C에서 보관하는 것은 동결을 방지하고, 결정화 조건의 저하 및 결로 관련 문제를 일으킬 수 있는 4 °C 보관을 피하기 위한 절충안입니다. 이렇게 보관할 경우, 플레이트는 4~5개월 이내에 사용할 수 있습니다.System 1을 통해 연간 4,000에서 8,000개의 LMB 플레이트가 제작되며, 이는 이후 초기 스크리닝에 사용됩니다. 예상 처리량이 훨씬 적은 경우에는 프로토콜을 다르게 최적화해야 합니다. 일반적으로 당사의 사전 연료 플레이트 전체 세트는 새로운 샘플에 대한 대규모 초기 스크리닝용으로 사용됩니다.하지만 구체적인 샘플 요구 사항에 따라 더 적은 수의 플레이트가 선택될 수 있습니다. 드롭렛을 준비한 후, 플레이트는 온도가 4 또는 18 °C로 엄격하게 제어되는 저진동 선반에 보관합니다. 실험은 스크롤 광원 현미경으로 평가합니다.결정의 특성을 면밀히 조사한 후, LMB 또는 C6 Screen 데이터베이스와 같은 웹 기반 도구를 사용하여 조건별 특성과 유사성을 분석할 수 있습니다. 이후 결정화 조건의 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다. 4-코너 방법 및 첨가제 스크리닝을 포함한 추가적인 자동화 프로토콜은 본문의 원고에 기술되어 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용 lipidic mesophases의 막 단백질의 높은 처리량 결정에 로봇 접근 방식을 설명합니다. 방법 통합 점성과 끈적 끈적한 단백질을이고 mesophase을 처리 할 수​​있는 로봇을 소개합니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

여기, 우리는 일부 싱크 로트 론 beamlines에 자동화 심사 및 사용할 수 있는 데이터 수집 옵션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 과학자는 싱크 로트 론 cryocooled 샘플 보내기 회절 속성은 상영, 데이터 세트는 수집 처리 그리고, 구조 솔루션은 실행 가능한-모든 인간의 개입 없이.

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

적절한 처리 프로토콜과 함께 거대 분자 X 선 결정학을위한 새로운 샘플 홀더가 제공됩니다. 이 시스템은 결정 조작이나 장착없이 주변 및 극저온 온도모두에서 결정 성장, 크리스탈 흡수 및 비지석 회절 데이터 수집을 허용합니다.

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

데이터의 신호 대 잡음 비율은 마이크로 결정에서 X 선 회절 측정을 수행하는 데 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. VMXm 빔라인은 이러한 실험을 위한 저소음 환경과 마이크로빔을 제공합니다. 여기서는 VMXm 및 기타 마이크로포커스 대식분자 결정학 빔라인에 대한 미세 결정의 장착 및 냉각을 위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

여기서는 EMBL 그르노블의 HTX 연구소의 CrystalDirect 기술을 기반으로 단백질-투 구조, 신속한 리간드 단백질 복합 분석 및 대규모 단편 스크리닝을 위해 자동화된 거대 분자 결정도 파이프라인을 사용하는 방법을 설명합니다.

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

이 프로토콜은 1,536개의 미세분석 플레이트 준비에서 6주간의 실험 기간 종료에 이르는 고처리량 결정화 스크리닝을 자세히 설명합니다. 시료 설정, 얻은 이미징 및 사용자가 인공 지능 지원 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 분석을 수행하여 거대분자 결정화 조건을 빠르고 효율적으로 식별하는 방법에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

학습하세요 고분자 결정화를 위한 자동화된 증기 확산 실험 준비 방법을. 나노리터 액적을 사용하여 단백질, DNA, RNA 복합체의 고품질 결정을 효율적으로 생산하고 구조 생물학 연구에 활용하세요.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

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