분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

이러한 라벨링 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 배아에서 안정적이고 동적이며 초기 미세소관을 이미지화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 미세소관이 세포 극성 형성에 어떻게 기여하는지와 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현장에서 뚜렷한 미세소관 집단의 검출 및 정량화를 최적화한다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 미세소관의 무결성을 유지하는 데 어려움이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 병기된 제브라피시 배아를 염소 제거한 후 1, 5ml 원심분리기 튜브로 옮겨 가능한 한 많은 배지를 제거합니다. 미세소관 어셈블리 완충액 또는 MAB에 4%PFA 1ml를 첨가하여 배아를 섭씨 28.5도에서 5분 동안 고정합니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 고정제를 흡인하고 1ml의 새 고정제로 교체하십시오. 샘펠을 실온에서 3시간 동안 로커에 배양합니다. 정착액을 흡입하고 TBS NP-40 버퍼 1ml를 추가합니다.

로커에서 배아를 5분 동안 부드럽게 저어줍니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 완충액을 1ml의 새 TBS NP-40으로 교체한 후 배아를 섭씨 4도에서 7일 이상 보관하지 마십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 아가로스에 배아를 탈노른자 및 매립한 후, TBS NP-40으로 채워진 절편 접시를 넣고 비브라톰을 사용하여 아가로스 포매 배아의 가장 높은 접근의 40마이크로미터 절편을 생성합니다. 가는 집게를 사용하여 관심 섹션을 24웰 플레이트에서 500마이크로리터의 TBS NP-40으로 옮깁니다. 버퍼를 제거하고 500마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.

그런 다음 실온에서 최소 1시간 동안 섹션을 흔듭니다. 차단 용액을 차단 완충액에 희석된 300마이크로리터의 1차 항체로 대체하고 섭씨 4도의 로커에서 36-72시간 동안 샘플을 배양합니다. 600마이크로리터의 TBS NP-40을 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다.

실온의 로커에 각각 30분 동안 놓습니다. 차단 완충액에 희석된 300마이크로리터의 형광단 접합 2차 항체를 절편에 첨가하고 16-24시간 동안 섭씨 4도의 로커에서 암흑 속에서 배양합니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 샘플을 두 번 세척합니다.

다음으로, 500마이크로리터의 DAPI 용액을 배아에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 TBS NP-40을 사용하여 실온에서 5분 동안 샘플을 세 번 세척합니다. 세탁 후 먼지가 없는 슬라이드 중앙에 페이드 방지제가 포함된 장착 매체 한 방울을 떨어뜨립니다.

가는 집게를 사용하여 섹션을 장착 매체 방울로 옮깁니다. 그런 다음 샘플 위에 먼지가 없는 커버 슬립을 놓습니다. 이미징이 수행될 때까지 호일로 싸인 슬라이드를 건조하고 어둡고 서늘한 곳에 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 세부 정보를 사용하여 선택한 2차 항체 형광단에 대한 채널 설정으로 z 스택 컨포칼 이미지를 캡처하고 이미지 파일을 저장합니다. Image J와 같은 3D 해석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일 사본을 엽니다. 이미지, 색상, 병합 채널을 선택하여 관심 채널을 오버레이하여 병합된 이미지를 만듭니다.

594 나노미터, 488 나노미터 및 DAPI 채널을 각각 빨간색, 녹색 및 파란색으로 가색으로 선택합니다. 확인하고, 복합을 만들고, 선택합니다. 이미지, 스택, z 프로젝트를 사용하여 z 스택의 최대 강도 투영을 수행하여 병합된 z 스택을 단일 2D 이미지로 시각화합니다.

안쪽의 가장 좋은 z 평면의 시작 및 끝 위치를 각각 시작 슬라이드 및 중지 슬라이스로 입력합니다. 투영 유형으로 최대 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 3D 해석 소프트웨어에서 라이브러리를 선택하고 생성한 다음 이미지 라이브러리에 대한 설명이 포함된 이름을 제공합니다.

원시 이미지 파일을 클릭하고 생성하여 라이브러리로 드래그합니다. 그런 다음 분석할 파일을 선택합니다. 그런 다음 보기 메뉴에서 확장 초점을 선택하여 기본 창에 채널 병합 이미지를 표시합니다.

자유형 ROI 도구를 선택하고 분석할 관심 영역을 간략하게 설명합니다. actions(작업) 탭을 선택한 다음 crop to selection(선택 항목으로 자르기)을 선택하여 이미지를 자릅니다. 그런 다음 자른 이미지 파일을 새 이름으로 저장합니다.

그런 다음 측정 탭을 클릭하여 3D 분석과 관련된 특정 개체를 필터링하기 위한 프로토콜을 만듭니다. 그런 다음 프로토콜 창으로 개체를 끌어다 놓고 첫 번째 프로토콜인 DAPI의 이름을 바꿉니다. 드롭다운 메뉴에서 베타 튜불린 채널을 선택합니다.

그런 다음, 다음 설정을 베타 튜불린 프로토콜로 끌어다 놓고 다음 순서로 개체를 찾습니다. 구멍과 객체를 채우고, 터치하는 객체를 분리하고, 크기별로 객체를 제외하고, 접촉하지 않는 ROI를 제외합니다. 이제 각 프로토콜의 맨 아래에서 측정을 선택합니다.

그런 다음 DAPI를 제외한 모든 채널에 대해 모든 튜불린 라벨링에 대해 강도 및 부피 측정과 골격 길이를 선택합니다. 측정할 영역 주위에 ROI를 그립니다. summary(요약) 탭에서 소프트웨어가 영역을 처리한 후의 측정값을 관찰합니다.

그런 다음 데이터를 복사하여 여기에 표시된 대로 실행 가능한 스프레드시트에 저장합니다. 장치를 통해 다중 우물을 구성하려면 지그 또는 띠톱을 사용하여 50ml 원심분리기 통을 세로로 반으로 나눕니다. 70마이크로미터 나일론 메쉬에서 반경 3cm의 반원 7개를 자르고 분할 원심분리기 튜브의 절반에 단단히 맞도록 자릅니다.

수족관 안전 실리콘 실러를 사용하여 10ml 그라데이션 표시와 평행한 원심분리기 튜브에 반원을 붙입니다. 장치를 이틀 동안 건조시킨 후 2-3시간 동안 물이 담긴 비커에 담가 헹굽니다. 절단된 원심분리기 튜브의 상단 나사산 끝에 모델링 점토를 깔아 통과 장치에 유지되는 액체의 높이가 1/4인치의 깊이가 되도록 합니다.

50ml 주사기에서 플런저를 제거하고 팁에 12인치의 미세한 튜브를 삽입하여 세척 장치를 준비합니다. 튜브를 최대한 밀어 넣고 모델링 점토를 사용하여 조인트 주위를 밀봉합니다. 배아 배지를 사용하면 액체가 장치를 통해 전체 흐름을 통과할 수 있도록 메쉬를 미리 적십니다.

액체가 모든 구획을 끌어당기지만 점토 가장자리가 있는 전면은 여전히 비워지도록 얼음 위에서 장치를 각도로 맞춥니다. 얼음 위의 흐름을 통해 장치 위의 링 스탠드에 세척 장치를 매달아 놓습니다. 200ml의 배아 배지를 얼음으로 식히고 세척 장치에 충분히 부어 모든 기포가 제거되고 유속이 분당 약 7밀리리터가 되도록 합니다.

주사기의 높이를 변경하여 유량을 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 탈염소화하고 노코다졸을 준비한 후, 10ml의 차가운 노코다졸 작업 용액을 사용하여 노코다졸 치료군의 배아 배지를 교환합니다. 발달 단계에 적합한 시간 동안 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 밀리리터 유리 피펫에 연마된 불을 사용하여 각 실험 그룹에 대해 별도의 구획을 사용하여 배아를 유동 장치로 옮깁니다. 50ml 주사기 상단에 얼음처럼 차가운 배아 배지를 부어 노코다졸 세척을 시작합니다. 실온에서 20분 동안 세척한 후 미세소관이 다시 자라도록 하려면 불로 연마된 1ml 유리 피펫을 사용하여 따뜻한 배아 배지가 들어 있는 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다.

배아가 이식되는 즉시 타이머를 시작하십시오. 마지막으로, 약 10개의 배아를 1ml의 4%PFA MAB 고정제로 채워진 1.5ml 원심분리 튜브에 피펫팅하여 대조군 및 세척 배아를 1분, 5분, 10분에 고정하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 샘플을 고정합니다. 글루-튜불린(glu-tubulin) 및 티르 튜불린(tyr tubulin)을 안정적이고 역동적인 미세소관을 위한 마커로 사용.

동적 미세소관은 신경 사멸 단계에서 뒷뇌에서 pre=dominate하는 것으로 나타났습니다. 사멸이 향상된 상피화(epithelialization) 단계인 신경 간상(neural rod)으로 진행됨에 따라, 질적으로 더 적은 수의 미세소관이 특히 복부 간상에서 항티르-튜불린 항체와 면역 반응을 보입니다. 대조적으로, 글루 튜불린은 신경 사멸 전체에 흩어져 반점이 있지만 미세소관 관을 따라 복부 신경 간상체에서 풍부합니다.

화살촉은 라벨링이 증가하는 특정 미세관 다발 또는 구조를 가리킵니다. 노코다졸 처리는 미세소관을 해중합하여 완화된 라벨링을 생성합니다. 미세소관이 다시 자라면서 중심소체에서 뻗어 나옵니다.

그러나 이것은 평면이 아닌 궤적으로 인해 단일 평면에서 명확하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 일부 이미지 분석 소프트웨어는 길이를 3D로 측정할 수 있어 노코다졸 세척 후 미세소관 성장을 평가할 수 있습니다. 미세소관의 평균 길이는 분석된 신경관의 모든 영역에서 노코다졸 세척 후 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 보입니다.

3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석이 완료되고 품질이 제어되면 전체 미세소관에 대한 안정된 미세소관의 비율로 총 미세소관 및 안정적인 미세소관의 평균 길이와 같은 원시 데이터에서 유용한 정보를 복구할 수 있습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 처음부터 끝까지 일주일 이상 걸리지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 미세소관이 쉽게 해중합되므로 적시에 샘플을 수집하고 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차는 돌연변이 분석에도 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 온전한 배아에서 뚜렷한 미세소관 집단을 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.