Name: 분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아에서 안정적이고 동적인 미세소관을 면역표지하는 방법을 통해 발달 신경생물학 연구를 수행하세요. 이 기술은 세극성 형성에 미세소관이 어떻게 기여하는지 이해하는 데 도움을 줍니다.

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Confocal 현미경에서는 미국 국립 과학 재단 (NSF), 부여 #DBI-0722569 자금으로 구입 했습니다. 연구로는 미국 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 일반 의료 과학 (NIH/NIGMS) 그랜트 #GM085290 및 미국 부서 방어 (국방부) 부여 #W81XWH-16-1-0466 R.M. 브루 스 터에 게 수 여를 지원 했다. E. 생체 전 대학 및 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 UMBC에 교부 금에 의해 지원 되었다, # 52008090를 부여. S.P. 브라운에 의해 미국 부의 교육 GAANN 장학금을 지원 했다, #GM055036, 그리고 자금으로 미국 국방부 부여 #W81XWH-16-1-0466 연구 조교 메이어 대학원 친교 NIH/NIGMS 보조금에 의해 자금.

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저자는 공개 없다.

현재 많은 방법이 있다 초기 zebrafish 개발에서 산 역학 이미징을 위한 조직11,12,,1314고정 태그 분자의 라이브 영상에서의 immunolabeling에 이르기까지. 단일 셀에 MTs 동적 또는 안정 상태에 있을 수 있습니다, 있지만 epithelialization는 MTs는 시간이 지남에 따라 점차적으로 안정화 과정 이다. 안정적이 고 동적 MTs에 대 한 마커를 사용 하 여이 현상을 시각화 하는 방법을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 배아 zebrafish 조직의 횡단면에 안정적인 산 인구를 동적 전환 척도를 3 차원 이미징 소프트웨어의 힘을 활용 합니다. 프로토콜 2, 메서드는 초기 MTs의 명료한 인구를 분류 하 여 그들의 성장과 nucleatio...

Microtubules (MTs)는 중합체의 α-및 β-tubulin 선형 protofilaments, 몇 가지는 속이 빈 튜브1,2형태로 결합으로 조립 이다. MTs는 끝 플러스 빠른 성장 하 고 느린-성장 하 고 끝은 centrosome 또는 다른 microtubule 조직 센터 (MTOC)3에서 앵커는 마이너스와 대립 된 구조. 드 노 보 MT 형성 nucleation 복잡 한 γ-tubulin 반지에서 (γ-TURC), 마운트 어셈블리4에 대 한 서식 파일을 제공 하 여 시작 됩니다. 어떤 주어진된 셀에 MTs의 두 인구 구분할 수 그 차례 이상의 서로 다른 속도로. 동적 MTs 성장의 단계 동적 불안정5라고 하는 과정에서 수축으로 전환 하 여 그들의 세포질 환경 탐구. 동적 MTs와 달리 안정적인 MTs 비 성장 고 동적 MTs6보다는 더 긴 반감기.

세포 생물학에 있는 연구의 십 년간은 정교한 배열의 마운트 구조와 기능을 공부 하는 도구를 제공 하 고 이러한 cytoskeletal 요소에 지식의 큰 몸이 귀착되. 예를 들어, MTs 설립 및 유지 보수 뿐만 아니라 안정적인 동적 MTs7, 대의 차동 subcellular 배포에 뿐만 아니라 그들의 본질적인 극성에 기인은 세포 극성의 중심 역할을 담당할 8. 반면, 훨씬 덜은 이해 MT 아키텍처 및 척 추가 있는 태아 같은 더 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 기능에 대 한 부분에서 높은 해상도에서 산 골격을 이미징의 도전 때문. 이 제한에도 불구 하 고 최근 세대 GFP 표현 유전자 변형 라인 라벨 MTs 또는 붙일 태그가 MT 마커의 과도 식 MTs 받 다 동적 변화 및 그들의 휴대에 대 한 우리의 이해를 증가 했다 고 zebrafish 태아에 있는 발달 역할. 전체 MT 네트워크 수 수 몇 군데는 tubulin에 유전자 변형 라인에 직접 레이블된9 또는 tubulin 고분자는 직접 표시 하지 MT 관련 된 단백질을 사용 하는 Doublecortin 같은 키 (Dclk) 또는 Ensconsin (EMTB)10, 11. 다른 선 (및 구문) 생성 된 산 플러스 끝 으로써 특히 산 내장 극성의 평가 활성화 또는 끝11,12,13, 마이너스 centrosome 고정 14. 이러한 도구의 힘 유기 체를 개발, MT의 역학을 공부 하는 능력에 있다. 이러한 연구 결과 밝혀졌다, 예를 들어 특정 세포 인구에서 MTs의 공간 및 동적 배포, mitotic의 방향 스핀 들 겪고 morphogenesis (세포 분열의 비행기의 표시기), 조직에 산 폴리머의 극성 세포 신장 등 마이그레이션 프로세스와 관련 및 MT 성장률 혜성 속도9,,1315에 의해 결정. 이러한 도구의 한계는 그들이 쉽게 안정적이 고 동적 MT 인구 사이 차별 하지 않습니다 이다.

풍부한 세포 생물학 문학에서 그리기, zebrafish 태아에 있는 안정적이 고 동적 MTs 이미지를 immunolabeling 방법 설명, 여기는 유전자 변형 라인의 사용을 보완 합니다. 제 브라에서 같은 immunolabeling 방법의 광범위 한 사용은 고정 절차 동안 MT 무결성을 보존 하기에 있는 어려움에 의해 약간 방해 되었습니다. 프로토콜 1 immunolabeling 총, 동적, 최적화 된 방법을 설명 하 고 있는 안정적인 MTs 개발 zebrafish hindbrain의 횡단면. 또한, 상업적으로 사용 하 여 간단한 메서드 사용 가능한 소프트웨어 계량 이러한 산 인구를 설명 되어 있습니다. 안정적인 MTs는 α-tubulin acetylation, detyrosination, 시간16,17동안 안정적인 MTs에 축적 등의 여러 포스트 번역 상 수정에 따라 동적 MTs에서 구별 된다. Zebrafish 태아 acetylation 속눈썹 및 axonal MTs만 안정적인 interphase MTs18, 안정된 MTs의 하위 집합을이 마커의 유용성을 제한 하지에 발생 합니다. 대조적으로, detyrosination18zebrafish 태아 있는 모든 안정적인 MTs에 나타납니다. 이 포스트 번역 상 수정 α-tubulin (detyrosinated tubulin)18 의 카 터미널 글루탐산을 노출 하 고 안티-Glu-tubulin19를 사용 하 여 검출 될 수 있다. Detyrosination 안정 MTs에 우선적으로 발생 합니다, 하지만 실험적인 증거가 포스트 번역 상 수정 산 안정성16의 원인 보다는의 결과 임을 나타냅니다. 동적 MTs 구성 상호 MT 인구, 항 체, 안티-Tyr-tubulin, 그 구체적으로 인식 하는 α-tubulin19의 tyrosinated 형태를 사용 하 여 구별 된다. 이러한 마커 및 confocal 영상 immunolabeling, 다음 MTs (길이, 번호, 및 관계 되는 풍부)의 정량 분석 개발 신경 튜브의 정의 된 영역에서 수행할 수 있습니다. 효율적인된 방안은 여기 3 차원 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여이 분석을 수행 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 주소 morphogenesis 설립 또는 세포 극성20의 성숙에 관한 질문에 적용할 수 있습니다. 실제로, 안정적인 MTs의 편광 배열의 정교 포토 리셉터 morphogenesis21, 개발 신경 튜브18 및 축 삭 형성8셀의 epithelialization를 포함 하 여 많은 개발 이벤트를 동반 한다.

프로토콜 2 그들의 어셈블리 단계 (nucleation/앵커리지와 성장)22,23동안 MTs를 분석 하는 세포 생물학 분석 실험의 비보에 적응을 설명 합니다. 초기 MTs는 centrosome에서 nucleated 되며 이후 어머니 중심소체23의 subdistal 부속에 고정. Depolymerization를 다음 초기 MT 자라나 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 MTs, 약 희미하게 절차와 치료 후 회복 기간 depolymerize nocodazole 치료에 세부 정보를 제공 합니다. MT 다시 성장에서 정기적 모니터링총 MTs에 대 한 마커 immunolabeling에 의해 s 게시물 유실 (β-tubulin) 안티는 centrosome에 대 한 표시와 함께 (안티 γ-tubulin)과 핵 (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), 프로토콜 1에서 설명 하는 일반 절차에 따라. 이 프로토콜의 MT depolymerization 단계 드 노 보 산 성장에 대 한 평가 보다는 기존 MTs의 확장 하면 필수적 이다. 이 기술은 다른 측정 하 산 성장 속도 (depolymerization의 부재) 끝 트 란 외.와 같이 녹색 형광 단백질 (GFP EB3), 융합 단백질 3을 묶는 등 플러스 팁 마커를 사용 하 여 다른 게시 된 절차 이므로 201211. 또한,이 분석 결과 배아 드 노 보 마운트 어셈블리에 결함 분석에 특히 유용 이전에 보고 된 NEDD1 돌연변이는 γ-tubulin는 centrosome에의 채용은 장애인 등에서 불완전 한 결과 신경 관 형성 및 신경 결함24.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td></td><td></td><td>페트리디쉬를 처리하는 데 사용됩니다.&nbsp; &nbsp; &nbsp; 용액을 가열하여 1% 아가로스 를 준비합니다. 마이크로웨이브에서 100ml 1X 배아 배지당 1g의 아가로스 중합될 때까지.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>시그마</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>시그마</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mounting 매체</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-&베타;-튜불린</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>토끼 항-&감마;-튜불린</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>토끼 안티-&알파;-튜불린</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>토끼 안티-데티로신화-튜불린</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp; 새로운 로트를 처음 사용하는 적정 항체.</td></tr><tr><td>토끼 안티 티로 신 튜불린</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>마우스 안티 센트린</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>염소 488 안티 토끼</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>염소 594 안티 토끼</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>염소 594 안티 마우스</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>염소 488 안티 마우스</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>셀 트리트</td><td></td>먼트 229693 <td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 디쉬</td><td>셀 트리트</td><td>먼트 229638</td><td></td></tr><tr><td>50ml 팔콘 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>짠 나일론 메쉬 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>수족관 밀봉제</td><td>Amazon.com, by MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>링 스탠드</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>모델링 점토</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>모든 왁스 또는 유성 무독성 모델링 점토로 충분합니다</td></tr><tr><td>클램프</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml 주사기</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>배아 배지 (E3)</td><td></td><td></td> <td>34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2 &middot; 2H2O 9.78 g MgCl2&middot; 6H2O 60X 스톡을 준비하려면 H2O에 성분을 용해시켜 최종 부피 2L까지 NaOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 오토 클레이 브. 1X 배지를 준비하려면 60X 스톡 16.5mL를 1L로 희석합니다.</td></tr><tr><td>차단 용액</td><td></td><td></td><td>50ml TBS-NP-40 2.5ml 일반 염소 혈청 1g BSA 625 &마이크로; l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>상업용 3-D 이미지 처리 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>드라이 블록 히터&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>프로토콜 1에서 아가로스를 용융하기 위한 핫 플레이트로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>플랫 임베딩 몰</td>드 <td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>퍼블릭 도메인 이미지 처리 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 성공 여부는 로트 번호에 따라 다릅니다.</td></tr></tbody></table>

분석, 동적, 안정과 초기 microtubules zebrafish 태아에 있는 immunolabeling의 사용

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs)는 역동적이 고 연약한 구조는 이미지에 vivo에서, 특히 척 추가 있는 태아에에서 게 도전 하는. Immunolabeling 메서드는 zebrafish 태아의 개발 신경 관에서 MTs의 명백한 인구 분석 여기 설명 되어 있습니다. 신경 조직에 포커스를 실행 하는 동안이 방법론은 다른 조직에 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나 절차는 일찍 중반 somitogenesis 단계 배아 (1 somite 12 somites에), 그들은 수 다른 단계 비교적 사소한 조정의 범위에 적응을 위해 최적화 됩니다. 첫 번째 프로토콜에는 안정적이 고 동적 MTs의 공간적 분포를 평가 하 고 이미지 처리 소프트웨어와 함께 이러한 인구의 정량 분석을 수행 하는 방법을 제공 합니다. 이 방법은 기존 도구 이미지 microtubule 역학 및 실시간, 사용 유전자 변형 라인 또는 태그 구문 과도 식에서 배포를 보완합니다. 그러나 사실, 이러한 도구는 매우 유용 합니다, 쉽게 역동적이 고 안정적인 MTs 사이 구분 하지 않습니다. 이미지 분석이 고유한 microtubule 인구를 셀 분극 및 morphogenesis 기본 이해 메커니즘에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 두 번째 프로토콜 초기 MTs를 구체적으로 분석 하는 기법을 설명 합니다. 이것은 약 nocodazole와 마약 유실 후 복구 기간 microtubule depolymerization 다음 시간이 지남에, MTs의 드 노 보 성장 특성을 포착 하 여 수행 됩니다. 이 기술은 zebrafish 태아에 있는 MTs의 연구에 적용 하지 않은 하지만 microtubule 어셈블리에 연루는 단백질의 기능 vivo에서 조사에 대 한 가치 있는 분석 결과 이다.

Immunolabeling를 사용 하 여 안정적이 고 동적 MTs의 분석 프로토콜 1, 산 초 (신경 용골) 동안 부분 모집단의 분포와 신경 관 발달의 늦은 (신경 대) 단계 드러났습니다, 각각 사용 하 여 Glu tubulin 및 Tyr tubulin 표식으로 안정적이 고 동적 MTs에 대 한. 동적 MTs는 hindbrain에 신경 용골 단계 (4-5 somites)에서 지배 (그림 2A-D). 용골 신경 막대 (11-12 somites), 향상 된 epithelialization의 단계에 개발로 질적으로 적은 MTs는 복 부 막대에 특히 안티 Tyr tubulin 항 체 (그림 2E-H)와 함께 immunoreactive. 반면, Gl...

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

이러한 라벨링 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 배아에서 안정적이고 동적이며 초기 미세소관을 이미지화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 미세소관이 세포 극성 형성에 어떻게 기여하는지와 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현장에서 뚜렷한 미세소관 집단의 검출 및 정량화를 최적화한다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 미세소관의 무결성을 유지하는 데 어려움이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 병기된 제브라피시 배아를 염소 제거한 후 1, 5ml 원심분리기 튜브로 옮겨 가능한 한 많은 배지를 제거합니다. 미세소관 어셈블리 완충액 또는 MAB에 4%PFA 1ml를 첨가하여 배아를 섭씨 28.5도에서 5분 동안 고정합니다.그런 다음 피펫을 사용하여 고정제를 흡인하고 1ml의 새 고정제로 교체하십시오. 샘펠을 실온에서 3시간 동안 로커에 배양합니다. 정착액을 흡입하고 TBS NP-40 버퍼 1ml를 추가합니다.로커에서 배아를 5분 동안 부드럽게 저어줍니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 완충액을 1ml의 새 TBS NP-40으로 교체한 후 배아를 섭씨 4도에서 7일 이상 보관하지 마십시오.텍스트 프로토콜에 따라 아가로스에 배아를 탈노른자 및 매립한 후, TBS NP-40으로 채워진 절편 접시를 넣고 비브라톰을 사용하여 아가로스 포매 배아의 가장 높은 접근의 40마이크로미터 절편을 생성합니다. 가는 집게를 사용하여 관심 섹션을 24웰 플레이트에서 500마이크로리터의 TBS NP-40으로 옮깁니다. 버퍼를 제거하고 500마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.그런 다음 실온에서 최소 1시간 동안 섹션을 흔듭니다. 차단 용액을 차단 완충액에 희석된 300마이크로리터의 1차 항체로 대체하고 섭씨 4도의 로커에서 36-72시간 동안 샘플을 배양합니다. 600마이크로리터의 TBS NP-40을 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다.실온의 로커에 각각 30분 동안 놓습니다. 차단 완충액에 희석된 300마이크로리터의 형광단 접합 2차 항체를 절편에 첨가하고 16-24시간 동안 섭씨 4도의 로커에서 암흑 속에서 배양합니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 샘플을 두 번 세척합니다.다음으로, 500마이크로리터의 DAPI 용액을 배아에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 TBS NP-40을 사용하여 실온에서 5분 동안 샘플을 세 번 세척합니다. 세탁 후 먼지가 없는 슬라이드 중앙에 페이드 방지제가 포함된 장착 매체 한 방울을 떨어뜨립니다.가는 집게를 사용하여 섹션을 장착 매체 방울로 옮깁니다. 그런 다음 샘플 위에 먼지가 없는 커버 슬립을 놓습니다. 이미징이 수행될 때까지 호일로 싸인 슬라이드를 건조하고 어둡고 서늘한 곳에 보관하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 세부 정보를 사용하여 선택한 2차 항체 형광단에 대한 채널 설정으로 z 스택 컨포칼 이미지를 캡처하고 이미지 파일을 저장합니다. Image J와 같은 3D 해석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일 사본을 엽니다. 이미지, 색상, 병합 채널을 선택하여 관심 채널을 오버레이하여 병합된 이미지를 만듭니다.594 나노미터, 488 나노미터 및 DAPI 채널을 각각 빨간색, 녹색 및 파란색으로 가색으로 선택합니다. 확인하고, 복합을 만들고, 선택합니다. 이미지, 스택, z 프로젝트를 사용하여 z 스택의 최대 강도 투영을 수행하여 병합된 z 스택을 단일 2D 이미지로 시각화합니다.안쪽의 가장 좋은 z 평면의 시작 및 끝 위치를 각각 시작 슬라이드 및 중지 슬라이스로 입력합니다. 투영 유형으로 최대 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 3D 해석 소프트웨어에서 라이브러리를 선택하고 생성한 다음 이미지 라이브러리에 대한 설명이 포함된 이름을 제공합니다.원시 이미지 파일을 클릭하고 생성하여 라이브러리로 드래그합니다. 그런 다음 분석할 파일을 선택합니다. 그런 다음 보기 메뉴에서 확장 초점을 선택하여 기본 창에 채널 병합 이미지를 표시합니다.자유형 ROI 도구를 선택하고 분석할 관심 영역을 간략하게 설명합니다. actions(작업) 탭을 선택한 다음 crop to selection(선택 항목으로 자르기)을 선택하여 이미지를 자릅니다. 그런 다음 자른 이미지 파일을 새 이름으로 저장합니다.그런 다음 측정 탭을 클릭하여 3D 분석과 관련된 특정 개체를 필터링하기 위한 프로토콜을 만듭니다. 그런 다음 프로토콜 창으로 개체를 끌어다 놓고 첫 번째 프로토콜인 DAPI의 이름을 바꿉니다. 드롭다운 메뉴에서 베타 튜불린 채널을 선택합니다.그런 다음, 다음 설정을 베타 튜불린 프로토콜로 끌어다 놓고 다음 순서로 개체를 찾습니다. 구멍과 객체를 채우고, 터치하는 객체를 분리하고, 크기별로 객체를 제외하고, 접촉하지 않는 ROI를 제외합니다. 이제 각 프로토콜의 맨 아래에서 측정을 선택합니다.그런 다음 DAPI를 제외한 모든 채널에 대해 모든 튜불린 라벨링에 대해 강도 및 부피 측정과 골격 길이를 선택합니다. 측정할 영역 주위에 ROI를 그립니다. summary(요약) 탭에서 소프트웨어가 영역을 처리한 후의 측정값을 관찰합니다.그런 다음 데이터를 복사하여 여기에 표시된 대로 실행 가능한 스프레드시트에 저장합니다. 장치를 통해 다중 우물을 구성하려면 지그 또는 띠톱을 사용하여 50ml 원심분리기 통을 세로로 반으로 나눕니다. 70마이크로미터 나일론 메쉬에서 반경 3cm의 반원 7개를 자르고 분할 원심분리기 튜브의 절반에 단단히 맞도록 자릅니다.수족관 안전 실리콘 실러를 사용하여 10ml 그라데이션 표시와 평행한 원심분리기 튜브에 반원을 붙입니다. 장치를 이틀 동안 건조시킨 후 2-3시간 동안 물이 담긴 비커에 담가 헹굽니다. 절단된 원심분리기 튜브의 상단 나사산 끝에 모델링 점토를 깔아 통과 장치에 유지되는 액체의 높이가 1/4인치의 깊이가 되도록 합니다.50ml 주사기에서 플런저를 제거하고 팁에 12인치의 미세한 튜브를 삽입하여 세척 장치를 준비합니다. 튜브를 최대한 밀어 넣고 모델링 점토를 사용하여 조인트 주위를 밀봉합니다. 배아 배지를 사용하면 액체가 장치를 통해 전체 흐름을 통과할 수 있도록 메쉬를 미리 적십니다.액체가 모든 구획을 끌어당기지만 점토 가장자리가 있는 전면은 여전히 비워지도록 얼음 위에서 장치를 각도로 맞춥니다. 얼음 위의 흐름을 통해 장치 위의 링 스탠드에 세척 장치를 매달아 놓습니다. 200ml의 배아 배지를 얼음으로 식히고 세척 장치에 충분히 부어 모든 기포가 제거되고 유속이 분당 약 7밀리리터가 되도록 합니다.주사기의 높이를 변경하여 유량을 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 탈염소화하고 노코다졸을 준비한 후, 10ml의 차가운 노코다졸 작업 용액을 사용하여 노코다졸 치료군의 배아 배지를 교환합니다. 발달 단계에 적합한 시간 동안 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 밀리리터 유리 피펫에 연마된 불을 사용하여 각 실험 그룹에 대해 별도의 구획을 사용하여 배아를 유동 장치로 옮깁니다. 50ml 주사기 상단에 얼음처럼 차가운 배아 배지를 부어 노코다졸 세척을 시작합니다. 실온에서 20분 동안 세척한 후 미세소관이 다시 자라도록 하려면 불로 연마된 1ml 유리 피펫을 사용하여 따뜻한 배아 배지가 들어 있는 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다.배아가 이식되는 즉시 타이머를 시작하십시오. 마지막으로, 약 10개의 배아를 1ml의 4%PFA MAB 고정제로 채워진 1.5ml 원심분리 튜브에 피펫팅하여 대조군 및 세척 배아를 1분, 5분, 10분에 고정하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 샘플을 고정합니다. 글루-튜불린(glu-tubulin) 및 티르 튜불린(tyr tubulin)을 안정적이고 역동적인 미세소관을 위한 마커로 사용.동적 미세소관은 신경 사멸 단계에서 뒷뇌에서 pre=dominate하는 것으로 나타났습니다. 사멸이 향상된 상피화(epithelialization) 단계인 신경 간상(neural rod)으로 진행됨에 따라, 질적으로 더 적은 수의 미세소관이 특히 복부 간상에서 항티르-튜불린 항체와 면역 반응을 보입니다. 대조적으로, 글루 튜불린은 신경 사멸 전체에 흩어져 반점이 있지만 미세소관 관을 따라 복부 신경 간상체에서 풍부합니다.화살촉은 라벨링이 증가하는 특정 미세관 다발 또는 구조를 가리킵니다. 노코다졸 처리는 미세소관을 해중합하여 완화된 라벨링을 생성합니다. 미세소관이 다시 자라면서 중심소체에서 뻗어 나옵니다.그러나 이것은 평면이 아닌 궤적으로 인해 단일 평면에서 명확하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 일부 이미지 분석 소프트웨어는 길이를 3D로 측정할 수 있어 노코다졸 세척 후 미세소관 성장을 평가할 수 있습니다. 미세소관의 평균 길이는 분석된 신경관의 모든 영역에서 노코다졸 세척 후 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 보입니다.3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석이 완료되고 품질이 제어되면 전체 미세소관에 대한 안정된 미세소관의 비율로 총 미세소관 및 안정적인 미세소관의 평균 길이와 같은 원시 데이터에서 유용한 정보를 복구할 수 있습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 처음부터 끝까지 일주일 이상 걸리지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 미세소관이 쉽게 해중합되므로 적시에 샘플을 수집하고 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차는 돌연변이 분석에도 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 온전한 배아에서 뚜렷한 미세소관 집단을 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피시 태아에서 안정적이고 동적인 미세소관을 면역표지하는 방법을 통해 발달 신경생물학 연구를 수행하세요. 이 기술은 세극성 형성에 미세소관이 어떻게 기여하는지 이해하는 데 도움을 줍니다.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

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