Name: 단백질 결정의 미세 결정학 및 셀룰로에서 회절 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 생체 내에서 성장한 단백질 미세결정을 이용한 X선 결정학 방법을 통해 복잡한 정화 과정 없이 효율적으로 결정을 생산하고 분석하는 기술을 익히세요.

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저자들은 오스트레일리아 싱크로트론의 MX2 빔라인에서의 지원을 위해 정화 된 미세 결정, Daniel Eriksson 및 Tom Caradoc-Davies의 사진을 제공 한 Chan-Sien Lay과 Monash University의 FlowCore 시설에서 나온 Kathryn Flanagan 및 Andrew Fryga 귀중한 도움.

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이 프로토콜은 과거에 간과되었을 작은 결정의 분석을 용이하게하기 위해 미정을 분석하는 두 가지 접근법을 제공합니다. 미세 결정 정제를위한 중요한 단계 제시된 프로토콜은 Sf9 세포에서 발현 된 Bombyx mori CPV1 폴리 헤드린을 모델 시스템으로 사용하여 최적화 하였다. 그러나, 생체 내 미결정은 기계적 저항성에 큰 변화를 보인다. 예를 들면, 곤충 세포에서 성장 카 텝신 B의 침상 결정은 강성 및 기계적 스트레스에 매우 내성, 여기 14 설명한 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 정제 할 수있다. 한편, 또한 배양 된 곤충 세포에서와 유사한 침상 형태로 성장 반딧불이 루시퍼 결정, 즉시 세포 용해 (38)에 용해. 따라서, 생체 내 추출 및 정제 프로토콜수정은 단계 1.3, 2a.3-4, 2b.4...

생물 고분자의 고해상도 구조 결정을위한 X 선 결정학의 사용은 지난 20 년간 꾸준히 발전해 왔습니다. 전문가가 아닌 연구자에 의한 X 선 결정학 (X-ray crystallography)의 증가 추세는 생명 과학 분야의 많은 분야에서이 접근법의 민주화를 보여줍니다 1 . 역사적으로 ~ 10 μm 이하의 크기를 가진 결정은 구조 결정을 위해 사용하기에 어렵지 않은 경우 도전적인 것으로 간주되었습니다. 싱크로트론 방사선 소스의 전용 미세 초점 빔라인의 가용성 증가와 미세 결정 조작 도구 개발과 같은 기술적 진보로 인해 X 선 미세 결정의 폭 넓은 사용을 방해하는 이러한 장벽이 제거되었습니다. 직렬 X 선 마이크로 결정학 2 , 3 및 마이크로 전자 회절 4 ha의 발전구조 결정을위한 마이크로 및 나노 결정의 사용이 가능할뿐만 아니라 때로는 큰 결정 5 , 6 , 7 의 사용보다 바람직하다는 것을 보여 주었다. 이러한 발전은 제 8 펩티드 곤충 바이러스 9, 10에 의해 생성 된 천연 결정의 연구에 적용 하였다. 이들은 이제 막 단백질 복합체 크고 11 가장 어려운 시스템을 포함하는 생물학적 고분자의 다양한 사용된다. 이 미세 결정의 분석을 용이하게하기 위해 meso , 특히 멤브레인 단백질 12 와 마이크로 유체 칩 13 에서 분석되었습니다. 이러한 신규 microcrystallography 방법론의 가용성에 사용할 수있는 가능성을 제기in vivo 결정학에 대한 대안을 제공하는 구조 생물학 14 , 15 , 16 의 새로운 경로로서의 생체 내 결정화. 불행하게도, 생체 내 결정체가 생성 될 수있을지라도, 세포로부터의 정제 동안 리간드의 분해 또는 손실, 싱크로트론 빔라인에서의 수정 및 시각화의 어려움 및 지루한 X- 선 회절 실험과 같은 몇 가지 장애물이 남아있다. 대안으로 결정은 정제 단계 17 , 18 , 19 없이 셀 내에서 직접 분석되었습니다. 비교 분석은 cellulo 접근 그러한 정제 된 결정과 높은 해상도 (20)의 수율 데이터의 분석을보다 더 효율적이 될 수 있음을 시사한다. 이 프로토콜은단백질 미세 결정학에 새로운 연구원을 돕는 경향이 있었다. 싱크로트론 빔라인에서 X 선 회절 실험을위한 시료 준비 및 조작에 초점을 맞춘 방법론을 제공합니다. 두 가지 옵션이 고전 microcrystallography 또는 cellulo 분석 ( 그림 1 )에 대한 유동 세포 계측법에 의해 정렬 크리스탈 포함 세포에 대한 격리 된 결정을 사용하여 제안하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Sf9 세포</td>, <td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM, 곤충 배지</td>, <td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1 L 세포 배양 플라스크</td><td>, Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>곤충 세포 배양을 위한 쉐이킹 인큐베이터</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브, 50</td><td></td> mL용 스윙 버킷이 있는 Falcon <td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator에는 19 mm 프로브</td><td>MSE Soniprep 150이</td> 장착되어 있습니다.<td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 유입 세포 분류기&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Heavy 원자 스크린</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 mesh는 더 넓은 표면을 제공합니다. 체계적인 연구를 위해 인덱싱된 메쉬를 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>종이 심지</td><td>Mitigen</td><td></td><td>종이 심지의 크기는 최적의 흐름을 위해 다양할 수 있습니다. 이것은 사용된 결정과 동결 방지제의 특성에 크게 좌우됩니다.</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 미소초점 빔라인</td><td>호주 싱크로트론</td><td></td><td>사용 가능한 미소초점 빔라인 목록은 Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash; 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

많은 싱크로트론 설비에서 고품질의 미세 초점 빔라인이 출현함에 따라 도전을 대표하는 가장 큰 차원에서 10μm보다 작은 결정의 일상적인 분석이 가능 해졌다. 우리 는 생체 내에서 성장한 결정에 특별한 초점을 맞춘 X 선 결정학에 의한 단백질 미결정의 구조 결정을위한 두 가지 대안 적 작업 흐름을 제시합니다. 미세 결정은 초음파 처리에 의해 세포로부터 추출되고 차등 원심 분리에 의해 정제되거나 결정 함유 세포의 유동 세포 계측법에 의한 세포 분류 후에 셀룰로오스로 분석된다. 선택적으로, 정제 된 결정 또는 결정 - 함유 세포를 실험적 단계적 조정을 위해 중질 원자 용액에 침지시킨다. 이 샘플들은 액체 질소에서의 마이크로 메쉬지지 및 플래시 냉각에 대한 적용에 의해 유사한 방식으로 회절 실험을 위해 준비됩니다. 격리 된 미세 결정과 수정 결정의 연속 회절 실험을 간략하게 기술하고 비교한다.microfocus 싱크로트론 빔라인을 사용하여 셀을 포함하는 셀을 조정하여 위상 조정, 모델 구축 및 미세 조정에 적합한 데이터 세트를 생성합니다. 이러한 워크 플로우는 곤충 세포에 재조합 배큘로 바이러스 (baculovirus)가 감염되어 생성 된 Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) 폴리 헤드린의 결정체를 예로들 수 있습니다. 이 사례 연구 에서 셀룰로오스 분석은 정제 된 결정의 분석보다 효율적이며 표현에서부터 정제까지 ~ 8 일 내에 구조를 산출합니다.

생체 내 미세 결정을 이용한 구조 결정을위한 두 가지 대체 방법의 개요가 제시됩니다 ( 그림 1 ). Polyhedra는 초음파 처리 및 원심 분리로 쉽게 정제 할 수 있습니다. 밀도 때문에, 그들은 pipetting ( 그림 3a 와 3b )에 의해 제거 할 수있는 파편 층 밑에 튜브의 바닥에 레이어를 형성합니다. 그런 다음 샘플을 여러 차례의 초음파 처리하고 펠렛의 흰색 및 백악면으로 판단 할 때 충분한 순도에 도달 할 때까지 세척합니다 ( 그림 3c ). in cellulo approach의 경우, 감염되지 않은 세포의 유동 세포 계측...

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 미세 결정, 특히 세포 내에서 생성되어 in vivo 결정으로 간주되는 결정에 적용되는 X선 결정학 방법론을 소개하는 것입니다. 이 접근법의 주요 장점은 미세 결정을 생산, 검출 및 분석하는 간단하고 효율적인 프로세스를 제공한다는 점입니다. 이 방법은 살아있는 세포 내부에서 성장한 결정을 사용하여 미세 결정의 활용을 용이하게 함으로써, 복잡한 정제 과정과 Aprocox 침강 시험의 필요성을 제거하는 것을 목표로 합니다.본 영상에서는 싱크로트론 빔라인에서의 X선 회절 실험을 위한 간단한 준비 및 조작 방법에 집중해 보겠습니다. 일반적인 결정학적 방법과 가장 크게 다른 단계들을 보여드립니다. 이번 시연에서는 성공적으로 성장시킨 vital polyhedron 단백질 결정체들을 사용하지만, 이 방법은 박테리아, 곤충, 포유류 또는 효모 세포에서 결정화되는 모든 단백질에도 적용할 수 있습니다.먼저, cypovirus polyhedron 단백질을 과발현하는 Sf9 세포 30 milliliters를 회전 플랫폼 위에서 27 degrees celsius로 3일 동안 배양합니다. 클래스 II 생물 안전 작업대 내에서 표준 무균 기술을 준수하여 메인 배양액의 무균 상태가 유지되도록 주의하며, 멸균된 세롤로지 피펫을 사용하여 Sf9 세포 배양액 500 microliters를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브 내의 세포 5 microliters를 피펫으로 취해 유리 슬라이드 위에 분주합니다.그 다음, 유리 커버슬립의 한쪽 끝이 액적에 닿도록 비스듬히 기울여 샘플 위에 놓고, 공기 방울이 생기지 않도록 조심스럽게 커버슬립을 액체 위로 내립니다. 이어서 도립 현미경으로 슬라이드를 촬영합니다. 200배 배율부터 시작하여 세포를 주의 깊게 관찰하고, 결정으로 추정되는 것을 발견하면 최대 배율로 확대하여 확인합니다.날카로운 모서리와 굴절률의 변화를 확인하십시오. 결정이 확인되면, 이전 단계들을 반복하여 매일 배양물을 관찰함으로써 결정의 성장을 모니터링하십시오. Sf9 세포의 경우, 배양물을 원심분리 튜브로 옮겨 수확하십시오.튜브를 얼음 위에 놓고 가능한 한 빨리 다음 단계로 진행하십시오. 결정 함유 세포를 분리하려면, 감염된 Sf9 세포 4 mL를 유세포 분석용 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 대조군으로 모의 감염된 배양액에서 동일한 수의 Sf9 세포를 담은 두 번째 튜브를 준비하십시오.다음

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

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현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

여기에서는 미세 결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 결정 분말을 준비하기 위해 실험실에서 개발된 절차를 설명합니다.

작은 분자의 미세 결정 전자 회절

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

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지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

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거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

배우세요 생체 내에서 성장한 단백질 미세결정을 이용한 X선 결정학 방법을 통해 복잡한 정화 과정 없이 효율적으로 결정을 생산하고 분석하는 기술을 익히세요.

단백질 결정의 미세 결정학 및

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