단백질 결정의 미세 결정학 및

본 프로토콜의 전반적인 목적은 미세 결정, 특히 세포 내에서 생성되어 in vivo 결정으로 간주되는 결정에 적용되는 X선 결정학 방법론을 소개하는 것입니다. 이 접근법의 주요 장점은 미세 결정을 생산, 검출 및 분석하는 간단하고 효율적인 프로세스를 제공한다는 점입니다. 이 방법은 살아있는 세포 내부에서 성장한 결정을 사용하여 미세 결정의 활용을 용이하게 함으로써, 복잡한 정제 과정과 Aprocox 침강 시험의 필요성을 제거하는 것을 목표로 합니다.

본 영상에서는 싱크로트론 빔라인에서의 X선 회절 실험을 위한 간단한 준비 및 조작 방법에 집중해 보겠습니다. 일반적인 결정학적 방법과 가장 크게 다른 단계들을 보여드립니다. 이번 시연에서는 성공적으로 성장시킨 vital polyhedron 단백질 결정체들을 사용하지만, 이 방법은 박테리아, 곤충, 포유류 또는 효모 세포에서 결정화되는 모든 단백질에도 적용할 수 있습니다.

먼저, cypovirus polyhedron 단백질을 과발현하는 Sf9 세포 30 milliliters를 회전 플랫폼 위에서 27 degrees celsius로 3일 동안 배양합니다. 클래스 II 생물 안전 작업대 내에서 표준 무균 기술을 준수하여 메인 배양액의 무균 상태가 유지되도록 주의하며, 멸균된 세롤로지 피펫을 사용하여 Sf9 세포 배양액 500 microliters를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브 내의 세포 5 microliters를 피펫으로 취해 유리 슬라이드 위에 분주합니다.

그 다음, 유리 커버슬립의 한쪽 끝이 액적에 닿도록 비스듬히 기울여 샘플 위에 놓고, 공기 방울이 생기지 않도록 조심스럽게 커버슬립을 액체 위로 내립니다. 이어서 도립 현미경으로 슬라이드를 촬영합니다. 200배 배율부터 시작하여 세포를 주의 깊게 관찰하고, 결정으로 추정되는 것을 발견하면 최대 배율로 확대하여 확인합니다.

날카로운 모서리와 굴절률의 변화를 확인하십시오. 결정이 확인되면, 이전 단계들을 반복하여 매일 배양물을 관찰함으로써 결정의 성장을 모니터링하십시오. Sf9 세포의 경우, 배양물을 원심분리 튜브로 옮겨 수확하십시오.

튜브를 얼음 위에 놓고 가능한 한 빨리 다음 단계로 진행하십시오. 결정 함유 세포를 분리하려면, 감염된 Sf9 세포 4 mL를 유세포 분석용 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 대조군으로 모의 감염된 배양액에서 동일한 수의 Sf9 세포를 담은 두 번째 튜브를 준비하십시오.

다음으로, 유세포 분석 직전에 두 시료 모두에 propidium iodide를 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 이제 FSC 및 SSC에 따라 세포 분리가 가능한 표준 유세포 분석기에 대조군 시료 세포를 적용합니다. 최소 20,000개의 이벤트를 분석합니다.

분석 과정에서 사멸 세포, 세포 응집체 및 데브리를 제거한 후, FSC-SSC 플롯을 생성합니다. 그다음, 결정이 포함된 샘플의 이벤트를 최소 20,000건 분석합니다. FSC-SSC 플롯을 대조군과 비교하여 결정 함유 세포에 해당하는 뚜렷한 세포군이 나타나는지 확인합니다.

일반적으로 더 높은 SSC 또는 FSC에서 나타나는 결정 함유 세포군 주변으로 게이트를 설정합니다. 이 게이팅을 사용하여, 50 µL의 PBS 버퍼가 미리 채워진 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 약 150,000에서 200,000개의 결정 함유 세포를 분리합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 분리된 시료를 광학 현미경으로 이미지화하여 어떤 세포군이 결정 함유 세포와 연관되어 있는지 확인합니다.

실험적 위상 결정(experimental phasing)이 필요한 경우, 이 단계에서 세포를 중원자 용액과 함께 배양할 수 있습니다. 이 방법은 텍스트 및 다른 리뷰에 설명된 대로 다양한 화합물과 배양 시간을 스크리닝한 후에 수행합니다. 먼저 핀에 장착된 마이크로 메시(micro mesh)를 마그네틱 완드 끝에 부착하여 시료 장착을 위한 도구를 준비하십시오.

완드를 투석 플로트 부표(dialysis float buoy)의 틈새에 가로로 놓습니다. 그런 다음, 핀셋으로 종이 심지를 집어 고정합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 설정이 완료되었는지 다시 한번 확인하십시오.

이제 세포를 동일한 부피의 0.4% trypan blue 용액과 혼합하여 최종 농도를 0.2%로 맞춥니다. 세포를 재부유시킨 후, 분류된 세포 0.5 µL를 마이크로 메시 위에 피펫팅합니다. 세포가 마이크로 메시 표면에 안착되면, 종이 심지로 흡수시켜 과잉 액체의 대부분을 제거합니다. 마이크로 메시의 액체를 충분히 제거하지 않으면, 세포들이 과잉 액체 내에서 서로 다른 깊이에 위치하게 되어 싱크로트론의 X선 빔에 정렬시키는 과정이 복잡해질 수 있습니다.

또한, 과도한 액체는 배경 X선 산란을 증가시킵니다. 마이크로 메쉬를 너무 많이 블로팅하면 액체가 완전히 제거되어 샘플이 그리드 구멍에 유지되지 않습니다. 최적의 블로팅을 통해 마이크로 메쉬에 얇은 액체 층만 남게 되면, 샘플을 보호하는 동시에 샘플이 그리드 구멍 내부로 들어가게 됩니다.

일부 결정은 동결 방지제 사용이 필요합니다. 본 실험에서는 필요하지 않으나, 절차는 시료를 도포한 후 블로팅(blotting)하는 과정과 동일합니다. 액체 층이 얇게만 남아 있도록 확인하십시오.

마이크로 메쉬를 액체 질소로 즉시 급속 냉각한 후, 방사광 가속기 마이크로포커스 빔라인으로 운반하기 위해 로봇 퍽(robot puck)으로 옮깁니다. in vivo 결정의 크기가 작으므로, 마이크로포커스 결정학 빔라인에서 회절 데이터를 수집하십시오. 먼저 마이크로 메쉬를 고니오미터에 장착합니다.

이제 정면 및 측면 방향을 이용하여 마이크로 메시를 빔 경로의 중심에 맞추는 것부터 시작하십시오. 마이크로 메시를 정면으로 둔 상태에서, 마이크로 메시의 수평 레인 중 하나의 중심을 맞추어 정렬을 미세 조정하십시오. 정렬을 아주 약간씩만 재조정하며 이 수평 레인을 따라 데이터를 수집하십시오.

해당 레인의 모든 결정을 테스트한 후, 다음 레인으로 이동하여 정렬 절차를 반복하십시오. 트립판 블루(trypan blue)의 색상 변화를 지표로 삼아, 처리된 레인을 명확히 식별하여 결정을 누락하거나 중복해서 촬영하지 않도록 주의하십시오. in vivo 미세 결정을 이용한 구조 결정의 두 가지 방법에 대한 개요가 제시되어 있습니다.

윗줄은 세포에서 결정을 정제하는 고전적인 접근 방식을 설명하며, 아랫줄은 데이터 수집을 위해 결정을 숙주 세포 내에 유지하는 in cellulo 결정학 접근 방식을 보여줍니다. in cellulo 방식의 경우, 비감염 세포의 유세포 분석 프로파일을 결정 함유 세포의 프로파일과 비교하여, 다른 세포로부터 결정 함유 세포를 분리하여 선택하기 위해 어떤 세포 집단을 선정해야 하는지 결정하는 데 사용됩니다. 이 예시에서 다면체 결정을 포함하는 세포는 비감염 세포보다 측방 산란(side scattering) 수치가 더 높습니다.

트리판 블루(trypan blue)로 염색된 세포는 대부분의 싱크로트론 빔라인에서 사용 가능한 카메라를 통해 쉽게 시각화할 수 있습니다. 정제된 결정은 크기가 매우 작아 X선 빔과 일치시키고 식별하는 데 많은 노력이 필요하지만, 데이터 수집 시에는 그리드 패턴으로 진행하여 센터링 절차를 최소화하고, 동일한 세포나 결정을 두 번 노출하거나 세포 및 결정을 누락하는 것을 방지하는 것이 가장 좋습니다. 이 과정에 숙달되면 결정이 포함된 세포의 수확부터 데이터 수집까지 약 반나절이 소요됩니다.

본 절차는 실험적 위상 결정을 위한 중원자 침지법(heavy-atom soaks)과 함께 사용할 수 있습니다. 다면체(polyhedron)의 경우, 단백질 발현 시작일로부터 8일 만에 일반 구조를 얻었습니다. 액체 질소를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 질식 및 동상에 대한 예방 조치를 반드시 취해야 함을 유의하십시오.