Name: 성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 골수 유래 간엽줄기세포를 저산소 전처리하여 신경전구세포를 풍부하게 만드는 방법입니다. 이 기술은 성숙한 슈반세포로 분화시켜 손상된 신경의 축삭 재생과 재수취화를 촉진합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 저산소 챔버 장치를 제공 한 Dr. Nai-Sum Wong과 기술 지원을 담당 한 Ms. Alice Lui를 인정하고자합니다.

동물을 포함한 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 엄격히 수행되었으며, 홍콩 대학교 의과 대학 Li Ka Shing 학부의 교수 및 연구 실용 동물 사용위원회의 승인을 받았습니다. 인간 골수 샘플은 정보 제공자의 동의를 얻은 후 건강한 공여자의 장골 크레스트로부터 얻어졌다. 의정서는 홍콩 대학 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 1. 래트 MSC 배양 물의 제조 <ol><li> 대퇴골에서 MSCs 수확 <ol><li> 사용 전 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 툴 ( 즉, 잘게 깎은 가위, 무뚝뚝한 뾰족한 절단 가위 및 이빨 집게)을 고압 살균하십시오. </li><li> 15 % 태아 소 혈청 (FBS)과 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S, 1 % v / v)이 보충 된 최소 필수 중 알파 - 알파 변형 (αMEM)을 포함하는 MSC 성장 배지를 준비한다.). </li><li> 펜토 바르 비톤 과다 투여 (240 mg / kg 체중, 복강 내)하여 젊은 수컷 Sprague Dawley 쥐 (체중 200-250 g)를 희생시킨다. 참고 : 다른 쥐의 골수 샘플은 별도로 처리해야합니다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부와 팔다리를 깨끗이 닦으십시오. </li><li> 미세 해부 가위 및 포 셉를 사용하여 중간 허벅지를 통해 피부와 피하 조직을 제거합니다. 대퇴부가 노출 될 때까지 허벅지 근육을 원주 방향으로 제거합니다. 무릎 및 엉덩이 관절이 보일 때까지이 근위 및 원위로 계속하십시오. 뾰족한 뾰족한 절단 가위를 사용하여 둔부와 무릎 관절을 통해 대퇴골을 분리하십시오. 참고 :이 단계에서 골수강을 노출시키기 위해 대퇴골을 가로 지르지 마십시오. 손상되지 않은 대퇴골을 층류 조직 배양 후드로 옮겨 추가 처리합니다. </li><li> metaphysis를 통해 대퇴골의 원위 및 근위 끝을 transect하는 무딘 팁 절단 가위를 사용. </li><li> 50 ML 원추형 튜브 위에 70 μm의 셀 스트레이너를 놓으십시오. 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 MM Na 2 HPO 4 , 산도 7.4)가 들어있는 21G, 10mL 주사기를 노출 된 대퇴부에 삽입하고 플러시를 반복하여 원뿔 튜브에 골수 내용물을 플러시하십시오. 참고 : 각 대퇴부를 세척하기 위해 약 20 mL의 PBS를 사용합니다. 플러시 된 내용의 색이 혈액 염색 및 탁한 상태로 유지되면 더 큰 볼륨을 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 분 480 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 물을 버린다. MSC 성장 매체 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend. 10cm 조직 배양 dish.Place 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 조직 문화 요리에 세포를 플레이트. 0 일째로 도금 첫 날을 기록한다. 참고 : 원심 분리를 포함한 모든 단계에서 최대 감속을 위해 브레이크를 설정하십시오. </li></ol></li><li> MSC 식민지의 확립과 확장 참고 :이 프로토콜 r골수강 내에서 MSCs를 선택하는 수단으로서의 조직 배양 플라스틱 접착에 관한 연구 11 . 골수 양은 조직 배양 플라스틱에 2 일 동안 고착시킬 수 있습니다. <ol><li> 2 일째, 10 mL의 PBS로 배양 판을 3 회 씻어서 비 부착 성 세포를 제거합니다. 린스 후 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. PBS로 세포를 씻어서 매 3 일마다 MSC 성장 배지로 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다 ( 그림 2A ). </li><li> 성장 매체를 제거하고 PBS로 세포를 씻어서 일 10까지 세포를 통과하십시오. 재조합 효소 세포 해리 시약 1.5 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C 5 분. 반응을 중화시키기 위해 3 mL의 MSC 성장 배지를 첨가한다. 5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. </li><li> PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 종자는 MSC 성장 배지에서 10-cm 배양 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 계대시켰다. 참고 : 랫 MSC는 계대 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다 ( 그림 2B ). 세포는 단계 1.2.2에서 설명한대로 8 계대까지 계대 할 수 있습니다. MSCs는 면역 세포 화학과 trilineage 분화 ( 그림 3 ) 12 에 대한 그들의 능력의 수단으로 특성 수 있습니다. 통로 3과 통로 8 사이의 MSC 배양 만이 후속 저산소증 전 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. 더 큰 계통 번호의 MSC는 평평한 형태를 취하고 ( 그림 2C ) 충분한 수의 신경 전구 세포를 생성하지 않습니다. 이러한 문화는 폐기해야합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인간 BMSC 배양 물의 제조 <ol><li> 인간 골수 1 mL를 MSC 성장 배지 9 mL로 희석하고 플레이트10cm 조직 배양 접시에있는 세포. 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에서 배양 물을 유지하십시오. </li><li> 2 일 후 배지를 제거하고 비 점착성 세포를 제거하기 위해 PBS 10 mL로 배양액을 3 회 부드럽게 씻어냅니다. 최종 린스 후 PBS를 제거하고 10 mL의 MSC 성장 배지로 교체하십시오. PBS 린스 후 배양 3 일마다 성장 배지를 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다. 식민지의 수는 개체간에 다를 수 있습니다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 10 일째에 세포를 통과시킵니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. MSC 성장 매체에서 10cm 문화 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도에서 계대 세포를 씨앗. 참고 : 인간 MSC ( 그림 2D )는 랫 MSC와 유사한 형태를 나타내며 마찬가지로 통과 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다. 그들은 chara이어야한다.immunocytochemistry 및 trilineage 차별화를위한 그들의 능력에 의해 cterized 12 . 쥐의 MSC와 마찬가지로, 3 ~ 8 단계의 인간 MSC는 후속 저산소 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. </li></ol> 3. 저산소 사전 컨디셔닝 <ol><li> 링 클램프를 풀고 hypoxia 챔버 구성 요소 ( 즉, 베이스, 뚜껑, 쟁반)를 분해하고 70 % 에탄올로 각 부품을 깨끗이 닦아냅니다. 15 분 동안 자외선 아래 살균을위한 층류 조직 문화 후드 내에 챔버 구성 요소를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning하기 전에, 매체를 제거하고 10 ML의 PBS로 쥐와 인간 MSC 문화 (섹션 1과 2)을 씻어. 25 MM HEPES로 보충 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. 참고 : 10cm dish에서 배양 된 MSC는 저산소 조건화를 받기 전에 80-90 %의 confluency에 도달해야합니다. </li><li> 줄을 놓으십시오.저산소실에서 요리를합니다. 챔버 부품을 다시 조립하고 링 클램프를 조입니다. 99 % N 2 / 1 % O 2 의 가스 혼합물을 5 분 동안 10L / min의 유속으로 챔버로 흘려 보내십시오. </li><li> 가스 누설이 없도록 저산소 챔버의 연결 끝 부분을 밀봉하십시오. 16 시간 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 ) 안에 챔버를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning 완료되면, 후속 신경 전구체 농축 문화에 대비하여 챔버에서 문화를 제거합니다. </li></ol> 4. 신경 전구 세포 농축 배양 <ol><li> B27 (2 % v / v), 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng / ml), 상피 세포 성장 인자 (EGF, EGF)가 보충 된 Dulbecco &#39;s modified eagle medium / Ham의 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)를 포함한다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 hypoxic preconditioned 쥐 / 인간 MSC를 분리합니다.5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 6,000 셀 / cm 2 의 밀도로 낮은 부착, 6 잘 접시에 신경 progenitor 매체와 종자에있는 세포를 Resuspend. 12 일 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 문화를 놓으십시오. 3 일마다 75 %의 신경 전구 세포를 보충하십시오. 참고 : 크기가 큰 비 부착 성 세포 클러스터는 6-7 일까지 관찰해야합니다. 10-12 일까지, 직경 ≥ 100 μm의 뉴로 필어를 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 4 ). 저산소 상태의 전처리 된 MSC는 정상 산소 상태에서 배양 된 MSC와 비교하여 더 많은 신경 세포를 생성합니다 9 . </li><li> 12 일에 10-mL 피펫으로 흡입하고 15 mL 원뿔 튜브로 옮겨 neurospheres를 모으십시오. 5 분 250 XG에서 neurospheres를 원심 분리기. 참고 : Neurospheres 수 있습니다네 스틴 (nestin) 및 GFAP 7 과 같은 신경 전구 마커에 대해 12 일째에 특징 지워진다. </li></ol> 5. DRG 뉴런과 공동 배양을 통한 운명의 결정을받은 Schwann 세포의 생성 <ol><li> 정제 된 래트 DRG 뉴런의 제조 <ol><li> 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 도구 ( 즉, 해부 가위, 포셉, 두 microdissection 집게 및 microdissecting 가위)을 고압. </li><li> 하룻밤 동안 4 ℃에서 poly-D-lysine (PDL, PBS에 10 μg / mL)을 코팅 한 6- 웰 조직 배양 플레이트. PDL을 제거하고 잘 PBS 당 1.5 ML로 씻으십시오. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 라미닌 (PBS 중의 10㎍ / mL)으로 플레이트를 코팅하는 것으로 진행한다. 1 well 당 1.5 mL의 PBS로 플레이트를 헹군다. </li><li> B27 (2 % v / v), L- 글루타민 (1 % v / v), 신경 성장 인자 (NGF, 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)가 보충 된 신경근 배지로 구성된 DRG 뉴런 유지 배지를 준비한다. % v / v). </li><li>B27 (2 % v / v), L-glutamine (1 %), NGF (20 ng / mL), P / S (1 %), fluorodeoxyuridine (FDU, 10)을 보충 한 신경 섬유 배지로 구성된 DRG 뉴런 정화 배지 μg / mL), 우리 딘 (10μg / mL). </li><li> 임신 14- 15 일에 임신 한 쥐를 pentobarbital 과량 투여 (240 mg / kg bodyweight, intraperitoneal)하여 희생시킨다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부를 깨끗이 닦습니다. </li><li> 벌금 해부 가위와 포 셉를 사용하여 동물의 하복부 벽을 세로로 자르십시오. 해부 가위를 사용하여 자궁을 확인하고 제거하십시오. 자궁 벽을 잘라 배아를 노출시키고 추출하십시오. 배아를 PBS로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기십시오. 얼음에 문화 접시를 놓으십시오. </li><li> 해부를위한 배아를 PBS (실온)로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 배아가 엎드리는 자세에있게하십시오. 아니E : 희끄무레 한 척수와 부착 된 DRG는 반투명 한 피부를 통해 배아의 지느러미 측면에서 볼 수 있습니다. </li><li> 척수의 양쪽을 따라 microdissecting 집게를 삽입하고 주변 연조직에서 척수를 분리 시작하기 위해 무딘 절개를 사용합니다. 목 개방과 꼬리 스텁을 따라 microdissecting 집게를 사용하여 동물에서 척수를 무료로 잘라. 주변의 연조직에서 코드를 제거하기 위해 코드의 복부 측면에 대해 추가 무딘 절개를 수행하십시오. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 해제 척수의 지느러미 측면 이상의 잔여 연조직을 제거합니다. 참고 :이 단계에서는 척수, 신경 뿌리 및 부착 된 DRG 만 남아 있어야합니다. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 연결 신경 뿌리에서 개별 DRGs를 분리합니다. PBS가 포함 된 1.5 ML, 살균 원심 분리기 튜브에 DRG를 전송하는 1 ML 팁에 연결된 피펫 펜을 사용합니다. 참고 : 각 1.5 mL 튜브의 경우 최대100 개의 DRG를 수용 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 250 XG에서 DRGs를 원심 분리기 및 재조합 효소 세포 해리 시약 (튜브 당 200 μL)에 그들을 resuspend. 10 분 동안 37 ℃, 5 % CO 2를 인큐베이션한다. 5 분 250 XG에서 DRG를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 DRG 뉴런 유지 관리 매체에 resuspend. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 부드러운 마찰로 펠렛을 떼어. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 잘 당 DRN 뉴런 유지 매체 1.5 ML PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 5,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 배양 2 일 후, DRG 뉴런 유지 매체를 제거하고 PBS로 헹구고 DRG 뉴런 정화 배지로 교체하십시오. 참고 : 각 정화 사이클에 대해 DRG 배양 물을 정화 배지로 2 일 동안 처리 한 다음 유지 관리 배지에서 1 일 배양합니다. 3-4 정화 사이클 후에, rem모든 내인성 glia의 타원형이 예상된다. 이것은 약 14 일 소요됩니다. 정제 된 문화는 연결 표지 TUJ1에 대해 양성이며 S100β 발현에는 결핍되어있다 ( 그림 5 ). </li></ol></li><li> 슈반 세포 - 유사 세포의 생성 <ol><li> β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10 %), P / S (1 % v / v). </li><li> PDL / laminin - 코팅 6 - 웰 플레이트에서 웰당 1.5 ML의 glial 유도 매체 cm 2 당 5-10 구의 밀도에서 섹션 4에서 준비 neurospheres를 판다. PBS로 세포를 헹구어 glial 유도 매체를 2 일마다 교체하십시오. 참고 : 시드 neurospheres에서 세포가 2 일까지 바깥쪽으로 마이 그 레이션 것으로 나타났습니다. 7 일까지, 철근 모양이 테이퍼 모양과 Schwann 세포에 대한 immunoposivity을 보여야한다마커 p75 뉴로 트로 핀 수용체 (p75) 및 S100β 7 . 이러한 셀을 SCLC라고합니다. </li></ol></li><li> SCLC와 DRG 뉴런의 공동 배양 <ol><li> DRG 뉴런 유지 매체 (단계 5.1.4)와 glial 유도 매체 (단계 5.2.1)로 구성된 공동 배양 배지를 1 : 1 부피비로 준비합니다. </li><li> FBS (5 %), β- 헤레 구린 (10 ng / mL), P / S (1 % v / v)가 보충 된 DMEM / F12로 구성된 Schwann 세포 유지 배지를 준비한다. </li><li> 7 일 SCLC에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 씻어 내고 37 ℃에서 0.5 mL / well의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 5 분 동안 배양합니다. 공동 배양 배지에 SCLC를 재현 탁한다. </li><li> 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> 1,000 셀 / cm 2 의 밀도로 SCLC를 정화 DRG 뉴런 문화에 종자. 2 일 간격으로 배지 교환을 실시하여 14 일 동안 공동 배양 물을 유지하십시오. 참고 : 공동 배양하는 동안 SCLCs는 성숙 Schwann 세포의 전형적인 스핀들 모양의 형태를 획득했습니다 ( 그림 6 ). 이러한 세포는 성장 인자의 철수 후 그들의 표현형에서 유지하고 체외 및 생체 내 axons myelinate 수 있습니다 7 , 10 . Schwann 세포 마커 ( 즉, p75 및 S100β)의 양성 여부는 면역 형광법으로 모니터링해야합니다. </li><li> 공동 배양이 완료되면 단계 1.2.2에서 설명한대로 숙주가 수행 한 Schwann 세포를 통과시킨다. 1 웰 당 0.5 mL의 해리 시약을 사용한다. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> Schwann 세포 유지 배지에서 10,000 세포 / cm 2 의 밀도로 운명의 결정을 한 Schwann 세포를 Resuspend하십시오. immunofluorescence위한 PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 세포를 시드. 참고 : 공동 배양은 필연적으로 섬유 아세포를 채택한 MSCs를 포함합니다세포 운명 7 . 이 세포들은 공동 배양의 완료시 운명 - 확약 Schwann 세포와 함께 계대된다. 이 fibroblast substratum의 꼭대기에있는 Schwann 세포는 PBS (4 ℃)의 &quot;콜드 제트 (cold jets)&quot;를 사용하여 헹구어 낸 후 쉽게 분리되어 추가로 팽창 될 수있다. 운명을 약속 한 Schwann 세포는 1 달 동안 유지 매체에서 확장 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

이 원고의 모든 저자는 신고 할 공개가 없습니다.

저산소 전처리 및 신경 구형 문화를 통해 신경 전구 세포를 풍부하게하기 전에 MSC의 &quot;줄기 (stemness)&quot;를 보존하는 것이 중요합니다. 우리의 경험으로부터 다 분화 MSC는 길쭉한 섬유 모세포와 같은 형태로 확실하게 확인 될 수 있습니다. 대조적으로, 현저한 세포 골격 스트레스 섬유를 갖는보다 편평한 사각 형태를 채택한 MSCs는 신경 세포의 운명을 쉽게 받아들이지 않으므로 버려야한다. 일반적으로, 우리는 통과 번호가 8보다 큰 MSC를 사용하지 않습니다. 그들의 줄기를 보존하기 위해 MSC가 100 % 합류하기 전에 신속하게 통과시키는 것이 중요합니다. 반대로, MSC를 너무 낮은 합류점으로 유지하는 것은 바람직하지 않습니다. 우리의 경험으로부터 MSC를 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 파종 시키거나 1 : 2 비율로 80 % 합류하는 세포를 간단히 통과시켜 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. DRG 네트워크의 적절한 수립...

신경 progenitors과 그 유도체의 이식은 외상성 신경 손상 1 , 2 및 neurodegeneration 3 , 4 후 치료 전략으로 약속을 보여줍니다. 임상 적용 전에, i) 줄기 / 전구 세포의자가 공급원에 접근하고 확대하기위한 방법과 ii) 관련성이 있고 성숙한 세포 유형으로 그들을 안내하는 수단 3)을 보장하는 것이 필수적이다. 척수 손상에 대한 세포 치료에 대한 우리의 관심은 성인 조직으로부터의 강력한 신경 전구 세포 공급원을 찾기 위해 노력했다. MSCs의 subpopulation은 신경 볏에서 유래하고 쉽게 골수강에서 접근 가능합니다. 이 세포들은 뉴런과 glia 5 를 생성 할 수있는 신경 전구 세포입니다. 뇌 허혈의 동물 모델은 저산소증이 prol<html> 뇌 내부의 신경 progenitors의 iferation 및 multipotency 6 . 이것은 골수 유래 신경 전구 세포를 확장시키는 수단으로서 저산소 전처리를 이용하는 기초였다. 손상된 척수에 Schwann 세포를 이식하면 재생이 촉진됩니다 2 . SCLCs는 gliogenic 요인 ( ie, β-Heregulin, bFGF, 및 PDGF-AA)에 보충 교재에 의하여 MSCs에서 생성 할 수 있고 그러나 표현형 불안정성을 설명 할 수있다. 성장 인자를 제거하면 섬유 아세포 유사 표현형으로 되돌아 간다. 표현형의 불안정성은 세포 이식에서 바람직하지 않은데, 이는 분화 및 발암의 위험이 있기 때문이다. Schwann 세포 전구체는 배아 말초 신경 8 내의 축삭 번들과 관련이 있기 때문에, 우리는 정화 배아 DRG 뉴런과 함께 공동 배양 SCLCs 7 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. 결과 성숙 Schwann 세포는 운명 - 약혼 및 시험관 기능 7 , 9 및 생체 내 10 기능을 보여 줍니다. MSCs에서 신경 progenitors의 농축에 대한 우리의 프로토콜은 간단하고 효율적이며 이후의 assays에 대한 세포 번호의 증가 결과입니다. coculture 플랫폼을 통한 운명을 결정한 Schwann 세포의 유도는 glial differentiation의 연구와 잠재적 인 임상 적용을위한 안정되고 기능적인 Schwann 세포의 생성을 가능하게합니다.

<table><tbody><tr><td>&알파; MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>신경 성장 인자 (NGF)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 유래 성장 인자-AA (PDGF-AA)</td><td>페프로텍</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>헤레굴린 베타-3, EGF 도메인 (&beta;-Her)</td><td>밀리포어</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마알드리치</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-플루로-2' - 데옥시우리딘 (FDU)</td><td>시그마알드리치</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신(PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토마이신 (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>부착 배양을</td> <td>위한 10cm 플레이트TPP</td><td>93100</td> 조직 <td>배양 부착 배양에 의한 MSC 선택에 사용</td></tr><tr>부착 배<td>양을 위한 6-well plate</td><td>TPP</td><td>92006</td> 비부착 배양을 위한 UltraLow 6-well plate 통과 <td>후 MSC 확장에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3471</td><td>신경 전구 농축</td></tr><tr><td>항-인간 CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>에 사용BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>반 인간 nestin</td><td>R & D 시스템</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>안티 - 인간 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫 CD90 (Thy-1)</td> <td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫 CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫 네스틴</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>안티-S100&베타;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충기</td><td>시그마알드리치</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

이 원고는 골수 간질 세포 (MSC) 집단으로부터 신경 전구 세포를 풍부하게하고 나중에 성숙한 슈반 세포 운명으로 인도하는 방법을 설명합니다. 우리는 랫드 및 인간 MSC에 일과성 저산소 상태 (16 시간 동안 1 % 산소)를 투여 한 후 상피 세포 성장 인자 (EGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 보충과 함께 낮은 부착 기질에 신경근으로 확장시켰다. Neurospheres는 poly-D-lysine / laminin 코팅 조직 배양 플라스틱에 뿌리고 Schwann cell-like cells (SCLCs)를 생성하기 위해 β-Heregulin, bFGF 및 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)가 포함 된 gliogenic cocktail에서 배양 하였다. SCLC는 E14-15 임신 Sprague Dawley 쥐에서 얻은 정제 된 Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런으로 2 주간 공동 배양을 통한 운명을 유도했다. 성숙한 Schwann 세포는 S100β / p75 발현에 지속성을 나타내며 미엘린 분절을 형성 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생성 된 셀은 잠재적 인 a질병 모델링뿐만 아니라 척수 손상 후자가 세포 이식에서의 응용.

프로토콜의 핵심 단계에 대한 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 요약하면, 랫 및 인간 MSC는 조직 배양 플라스틱을 준수하여 선택됩니다. 확장 된 MSC는 저산소 상태로 전제 조건을 지키고 뉴로 스피어 형성 조건의 영향을받습니다. Neurospheres는 도금되어 SCLCs로 분화 할 수 있습니다. SCLC는 정제 된 DRG 뉴런과 함께 배양되어 운명의 확약 된 Schwann 세포를 생성합니다. 배양 된 랫 및 인간 MSC의 형태가 도 2 에 예시되어 있다 . 그들의 건강한 테이퍼 형태는 다발성을 잃은 높은 계통 번호에 대해 유지 된 MSC의 사각...

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

본 세포 배양 기술의 전반적인 목표는 골수 신경 전구세포를 농축하여 기능적인 슈반 세포(Schwann cells)로의 분화를 촉진하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포 및 재생 의학의 핵심 과제인, 제한된 신경 전구세포원을 활용하여 외상 후 축삭 재생 및 재수초화를 돕는 글리아(glia)를 생성하는 방법을 다룹니다. 이 기술의 장점은 효율적인 배양 조건 설정을 통해 골수 기질 세포로부터 신경 세포의 증식을 촉진함으로써 자가 세포 치료에 활용할 수 있다는 점입니다.2일 동안 배양한 후, 사용한 배지와 부착되지 않은 세포의 75%를 제거하고 부착된 세포를 10 mL의 PBS로 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후, PBS를 10 mL의 골수 기질 세포(marrow stomal cells, MSC) 성장 배지로 교체하고 배양물을 인큐베이터로 되돌립니다. 6~7일째가 되면 가시적인 콜로니가 나타나야 합니다.10일째에, 신선한 PBS로 배양물을 세척하고 1.5 milliliters의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 세포를 분리합니다. 37 °C에서 5분 후, 반응을 중화시키기 위해 3 milliliters의 MSC 성장 배지를 첨가하고 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집합니다. 펠렛을 5 milliliters의 신선한 MSC 성장 배지에 재현탁하고, 새로운 10 centimeter 조직 배양 플레이트에 4 × 10⁴ cells/cm² 밀도로 세포를 분주합니다.세포는 계대 배양 후 2일 이내에 80에서 90%의 합쳐짐(confluency) 정도에 도달해야 합니다. 저산소 전처리를 위해, 먼저 링 클램프를 풀고 노출된 부분을 70% ethanol로 닦아냅니다. 저산소 챔버를 구성 부품으로 더 분해하여 층류 후드(laminar flow hood)에 넣고 UV 광선 아래에서 15분 동안 멸균합니다.다음으로, 방금 시연한 것과 같이 80~90% 합류도(confluent)의 MSC 배양물을 10 milliliters의 PBS로 세척하고, 25 millimolar hepes가 첨가된 신선한 MSC 성장 배지로 처리합니다. 처리된 배양물을 재조립된 저산소 챔버에 넣고 링 클램프를 조입니다. 가스 누출이 없도록 챔버의 연결 부위를 밀봉하고, 99% nitrogen과 1% oxygen의 혼합 가스를 10 liters per minute의 유속으로 챔버 내에 주입합니다.5분 후, 챔버를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 16시간 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 시연한 방법대로 세포를 분리하고 원심분리를 통해 수집합니다. 펠렛을 신경 전구세포 배지로 재현탁하고, 저부착 6-웰 플레이트에 cm²당 6 × 10³개의 세포를 분주한 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 12일 동안 배양합니다.6~7일째에 상당한 크기의 비부착성 세포 구체가 관찰되어야 합니다. 10~12일째에는 상등성 배양보다 저산소 상태의 배양에서 더 많은 신경구(neurosphere)가 나타납니다. 12일째에 10 milliliters 피펫을 사용하여 신경구를 15 milliliters 원추형 튜브로 옮기고, 원심분리를 통해 신경구를 수집합니다.구체들을 DMEM/F12에 재현탁하고, 웰당 1.5 milliliters의 신경교 유도 배지를 사용하여 poly-D-lysine laminin이 코팅된 6-웰 플레이트에 제곱센티미터당 5~10개의 신경구체를 분주합니다. 3일마다 배지를 교체하며 신경구체 세포 배양을 최소 7일 동안 유지합니다. 후근 신경절을 수확하려면, 첫 번째 배아를 해부 현미경 하에서 엎드린 자세로 실온의 PBS가 담긴 10 centimeter 배양 접시로 옮긴 후, 척수 양측을 따라 미세 해부 핀셋을 삽입합니다.둔성 박리법을 사용하여 핀셋으로 척수를 주변 연조직으로부터 분리하고, 목 개구부와 꼬리 그루터기를 따라 척수를 절제합니다. 분리된 척수에서 척수, 신경근 및 부착된 후근신경절만 남을 때까지 잔여 연조직을 제거합니다. 연결된 신경근으로부터 개별 후근신경절을 분리합니다.그런 다음, 1 mL 피펫 팁이 장착된 피펫 펜을 사용하여 최대 100개의 dorsal root ganglia를 PBS가 담긴 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 신경절을 수집하고, 튜브당 200 µL의 recombinant enzymatic cell dissociation reagent에 펠렛을 재현탁합니다. 37 °C에서 10분간 반응시킨 후, 200 µL 피펫 팁을 사용하여 dorsal root ganglion neuron maintenance medium 내의 펠렛을 부드럽게 분쇄(triturate)하며 dorsal root ganglia를 다시 원심분리합니다.poly-D-lysine laminin이 코팅된 6-well 플레이트에 well당 1.5 mL의 dorsal root ganglion 뉴런 유지 배지를 사용하여, cm²당 5 × 10³개의 dorsal root ganglion 세포를 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 신선한 dorsal root ganglion 뉴런 정제 배지를 넣어 인큐베이터에서 다시 2일 동안 배양합니다. 이러한 유지 및 정제 사이클을 3~4회 반복하면, dorsal root ganglion 세포 배양물은 뉴런 마커인 Tuj-1에는 양성 반응을 보이고 글리아 세포 마커인 S100 beta에는 음성 반응을 보여야 합니다.슈반 세포 유사 세포(Schwann cell-like cell) 배양 7일째에, PBS로 세포를 헹군 후 웰당 0.5 mL의 재조합 효소 세포 해리 시약을 사용하여 37°C에서 5분 동안 해리합니다. 세포 펠렛을 공배양 배지에 재현탁하고, 정제된 배측 신경절(dorsal root ganglion) 뉴런 배양물 위에 슈반 세포 유사 세포를 1 × 10³ cells/cm² 밀도로 파종하여 37°C, 5% CO2 조건에서 14일 동안 공배양합니다. 건강한 MSC는 가늘어지는 형태를 보이는 반면, 많은 횟수의 계대 배양을 거쳐 다분화 능력을 상실한 MSC는 사각형 모양을 나타냅니다.확장된 MSC 콜로니는 MSC 마커의 발현, 조혈모세포 마커의 부재, 그리고 지방세포, 골세포 및 연골세포 계통으로의 분화 능력을 보여야 합니다. 저산소 사전 처리된 건강한 MSC 배양물은 수와 크기 면에서 더 큰 뉴로스피어(neurospheres)를 형성함을 보여줍니다. 배근신경절 뉴런 네트워크의 순도는 뉴런 마커인 Tuj-1의 발현과 슈반 세포 마커인 S100의 동시 부재를 통해 확인할 수 있습니다.후근 신경절 뉴런과 14일 동안 공동 배양한 후, 슈반 세포 유사 세포는 성숙하고 운명이 결정된 슈반 세포의 특성과 기능적 성질을 획득합니다. 일단 숙달되면, 세포 확장 기술이 적절하게 수행될 경우 인간 또는 쥐의 BMSCs에서 신경 전구세포 하위 집단을 10일 이내에 확장할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 BMSC 샘플에 nestin 양성 신경 전구세포가 포함되어 있고 CD45 양성 조혈 전구세포가 모두 제거되었는지 확인하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 BMSC를 확보하고, 신경 전구 세포 하위 집단을 농축하며, 신경 전구 세포를 운명이 결정된 슈반 세포로 분화시켜 외상 후 축삭 재생 및 재수초화를 촉진하는 데 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 통해 성숙한 슈반 세포와 같은 수초 형성 글리아 세포를 유도하여, 말초 및 중추 신경계 모두의 탈수초성 손상 및 질환 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 동영상은 다분화능 골수 기질 세포(BMSC)에서 슈반 세포 유사 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 초기에 BMSC는 저산소증(hypoxia) 치료를 받은 후 신경 전구 세포(neuronal progenitor cell)로 직접 분화합니다. 그 후, 특정 배지 및 배양 조건을 사용하여 이러한 전구 세포가 슈반 세포와 같은 세포로 형질전환을 유도합니다.

골수 기질 세포에서 Schwann 세포 유사 세포 생성

이 비디오는 쥐 배아에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 분리하고 슈반 세포 전구체와 공동 배양하여 성숙한 슈반 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 DRG는 뉴런과 신경교세포를 분리하기 위해 처리됩니다. 분리된 세포를 배양하여 뉴런을 정제한 다음, 공동 배양 배지에서 슈반 세포 유사 세포(SCLC)와 공동 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 SCLC가 슈반 세포로 성숙하도록 유도합니다.

DRG 뉴런의 분리 및 Schwann 세포 전구체와의 공동 배양을 통해 Schwann 세포 생성

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.

클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

배우세요 골수 유래 간엽줄기세포를 저산소 전처리하여 신경전구세포를 풍부하게 만드는 방법입니다. 이 기술은 성숙한 슈반세포로 분화시켜 손상된 신경의 축삭 재생과 재수취화를 촉진합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

더 많은 동영상 탐색