성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

본 세포 배양 기술의 전반적인 목표는 골수 신경 전구세포를 농축하여 기능적인 슈반 세포(Schwann cells)로의 분화를 촉진하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포 및 재생 의학의 핵심 과제인, 제한된 신경 전구세포원을 활용하여 외상 후 축삭 재생 및 재수초화를 돕는 글리아(glia)를 생성하는 방법을 다룹니다. 이 기술의 장점은 효율적인 배양 조건 설정을 통해 골수 기질 세포로부터 신경 세포의 증식을 촉진함으로써 자가 세포 치료에 활용할 수 있다는 점입니다.

2일 동안 배양한 후, 사용한 배지와 부착되지 않은 세포의 75%를 제거하고 부착된 세포를 10 mL의 PBS로 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후, PBS를 10 mL의 골수 기질 세포(marrow stomal cells, MSC) 성장 배지로 교체하고 배양물을 인큐베이터로 되돌립니다. 6~7일째가 되면 가시적인 콜로니가 나타나야 합니다.

10일째에, 신선한 PBS로 배양물을 세척하고 1.5 milliliters의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 세포를 분리합니다. 37 °C에서 5분 후, 반응을 중화시키기 위해 3 milliliters의 MSC 성장 배지를 첨가하고 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집합니다. 펠렛을 5 milliliters의 신선한 MSC 성장 배지에 재현탁하고, 새로운 10 centimeter 조직 배양 플레이트에 4 × 10⁴ cells/cm² 밀도로 세포를 분주합니다.

세포는 계대 배양 후 2일 이내에 80에서 90%의 합쳐짐(confluency) 정도에 도달해야 합니다. 저산소 전처리를 위해, 먼저 링 클램프를 풀고 노출된 부분을 70% ethanol로 닦아냅니다. 저산소 챔버를 구성 부품으로 더 분해하여 층류 후드(laminar flow hood)에 넣고 UV 광선 아래에서 15분 동안 멸균합니다.

다음으로, 방금 시연한 것과 같이 80~90% 합류도(confluent)의 MSC 배양물을 10 milliliters의 PBS로 세척하고, 25 millimolar hepes가 첨가된 신선한 MSC 성장 배지로 처리합니다. 처리된 배양물을 재조립된 저산소 챔버에 넣고 링 클램프를 조입니다. 가스 누출이 없도록 챔버의 연결 부위를 밀봉하고, 99% nitrogen과 1% oxygen의 혼합 가스를 10 liters per minute의 유속으로 챔버 내에 주입합니다.

5분 후, 챔버를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 16시간 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 시연한 방법대로 세포를 분리하고 원심분리를 통해 수집합니다. 펠렛을 신경 전구세포 배지로 재현탁하고, 저부착 6-웰 플레이트에 cm²당 6 × 10³개의 세포를 분주한 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 12일 동안 배양합니다.

6~7일째에 상당한 크기의 비부착성 세포 구체가 관찰되어야 합니다. 10~12일째에는 상등성 배양보다 저산소 상태의 배양에서 더 많은 신경구(neurosphere)가 나타납니다. 12일째에 10 milliliters 피펫을 사용하여 신경구를 15 milliliters 원추형 튜브로 옮기고, 원심분리를 통해 신경구를 수집합니다.

구체들을 DMEM/F12에 재현탁하고, 웰당 1.5 milliliters의 신경교 유도 배지를 사용하여 poly-D-lysine laminin이 코팅된 6-웰 플레이트에 제곱센티미터당 5~10개의 신경구체를 분주합니다. 3일마다 배지를 교체하며 신경구체 세포 배양을 최소 7일 동안 유지합니다. 후근 신경절을 수확하려면, 첫 번째 배아를 해부 현미경 하에서 엎드린 자세로 실온의 PBS가 담긴 10 centimeter 배양 접시로 옮긴 후, 척수 양측을 따라 미세 해부 핀셋을 삽입합니다.

둔성 박리법을 사용하여 핀셋으로 척수를 주변 연조직으로부터 분리하고, 목 개구부와 꼬리 그루터기를 따라 척수를 절제합니다. 분리된 척수에서 척수, 신경근 및 부착된 후근신경절만 남을 때까지 잔여 연조직을 제거합니다. 연결된 신경근으로부터 개별 후근신경절을 분리합니다.

그런 다음, 1 mL 피펫 팁이 장착된 피펫 펜을 사용하여 최대 100개의 dorsal root ganglia를 PBS가 담긴 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 신경절을 수집하고, 튜브당 200 µL의 recombinant enzymatic cell dissociation reagent에 펠렛을 재현탁합니다. 37 °C에서 10분간 반응시킨 후, 200 µL 피펫 팁을 사용하여 dorsal root ganglion neuron maintenance medium 내의 펠렛을 부드럽게 분쇄(triturate)하며 dorsal root ganglia를 다시 원심분리합니다.

poly-D-lysine laminin이 코팅된 6-well 플레이트에 well당 1.5 mL의 dorsal root ganglion 뉴런 유지 배지를 사용하여, cm²당 5 × 10³개의 dorsal root ganglion 세포를 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 신선한 dorsal root ganglion 뉴런 정제 배지를 넣어 인큐베이터에서 다시 2일 동안 배양합니다. 이러한 유지 및 정제 사이클을 3~4회 반복하면, dorsal root ganglion 세포 배양물은 뉴런 마커인 Tuj-1에는 양성 반응을 보이고 글리아 세포 마커인 S100 beta에는 음성 반응을 보여야 합니다.

슈반 세포 유사 세포(Schwann cell-like cell) 배양 7일째에, PBS로 세포를 헹군 후 웰당 0.5 mL의 재조합 효소 세포 해리 시약을 사용하여 37°C에서 5분 동안 해리합니다. 세포 펠렛을 공배양 배지에 재현탁하고, 정제된 배측 신경절(dorsal root ganglion) 뉴런 배양물 위에 슈반 세포 유사 세포를 1 × 10³ cells/cm² 밀도로 파종하여 37°C, 5% CO2 조건에서 14일 동안 공배양합니다. 건강한 MSC는 가늘어지는 형태를 보이는 반면, 많은 횟수의 계대 배양을 거쳐 다분화 능력을 상실한 MSC는 사각형 모양을 나타냅니다.

확장된 MSC 콜로니는 MSC 마커의 발현, 조혈모세포 마커의 부재, 그리고 지방세포, 골세포 및 연골세포 계통으로의 분화 능력을 보여야 합니다. 저산소 사전 처리된 건강한 MSC 배양물은 수와 크기 면에서 더 큰 뉴로스피어(neurospheres)를 형성함을 보여줍니다. 배근신경절 뉴런 네트워크의 순도는 뉴런 마커인 Tuj-1의 발현과 슈반 세포 마커인 S100의 동시 부재를 통해 확인할 수 있습니다.

후근 신경절 뉴런과 14일 동안 공동 배양한 후, 슈반 세포 유사 세포는 성숙하고 운명이 결정된 슈반 세포의 특성과 기능적 성질을 획득합니다. 일단 숙달되면, 세포 확장 기술이 적절하게 수행될 경우 인간 또는 쥐의 BMSCs에서 신경 전구세포 하위 집단을 10일 이내에 확장할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 BMSC 샘플에 nestin 양성 신경 전구세포가 포함되어 있고 CD45 양성 조혈 전구세포가 모두 제거되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 BMSC를 확보하고, 신경 전구 세포 하위 집단을 농축하며, 신경 전구 세포를 운명이 결정된 슈반 세포로 분화시켜 외상 후 축삭 재생 및 재수초화를 촉진하는 데 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 통해 성숙한 슈반 세포와 같은 수초 형성 글리아 세포를 유도하여, 말초 및 중추 신경계 모두의 탈수초성 손상 및 질환 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.