Name: 혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 배우세요 혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성 능력을 평가하는 유방 팻 패드 이식 기술을 통해 생체 내 줄기세포 특성을 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 혈관 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31530045 및 31371500, YAZ, 31401245, QCY), 중국 과학 기술부 (2014CB964800), 중국 과학원 (XDB19000000 - YAZ), 중국 세포 생물학 학회 (Early Career Fellowship to QCY).

실험 절차는 승인 된 프로토콜 SIBCB-NAF-15-002-S335-003에 따라 중국 과학원 상하이 생화학 및 세포 생물학 연구소 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 마우스 유선으로부터의 VESCs의 분리 <ol><li> 유선 선 수확 및 조직 소화. <ol><li> 조직 기증자로 무게가 20에서 25 g 사이 인 8 주 된 액틴 -GFP 성숙한 처녀 기자 마우스를 사용하십시오. 참고 : 기증자로부터 유래 한 세포는 GFP 발현에 의해 쉽게 추적 될 수 있습니다. </li><li> RPMI1640에 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 펜 / strep 및 25 MM HEPES로 구성된 조직 소화 기본 매체를 준비합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 혼합물을 여과하고 물로 37 ° C로 예열하고 사전 예열하십시오. </li><li> CO 2 챔버에서 생쥐를 희생. 첫 번째 수직 피부를 만들어서 사타구니 유선의 네 번째 쌍을 해부합니다.(또는 외과 용 가위)를 사용하여 하 복부 중간 선에서 정중선 검사. 부드럽게 한쪽으로 포 using를 사용하여 사타구니의 유선을 노출 피부를 껍질. 양쪽에서 사타구니의 제 4 유방 땀샘을 얻고 가위로 6cm 페트리 접시에 잘게 자릅니다. <ol><li> 다진 조직의 총 무게를 측정하고 50 ML 튜브에 놓으십시오. 참고 : 결과 조직 뭉치가 각 조각에 대해 1mm 3 보다 작은 지 확인하십시오. 전형적인 수확량은 동물 당 약 5,000 VESC입니다. </li></ol></li><li> 조직 말단 1g 당 10mL의 양으로 50mL 뚜껑이 달린 원심 분리 튜브에서 소화 기질을 준비한다. 소화 완충액을 구성하는 소화 기질 10 mL 당 300 단위의 농도로 콜라게나 제 제 3 형을 첨가하십시오. 균등하게 섞어서 티슈 말에 첨가합니다. </li><li> 수평으로 50-mL 원심 분리 튜브를 흔들 플랫폼에 놓고 속도를 100 rpm으로 설정하고 온도를 37 ° C로 설정합니다. 흔들다유방 조직 2 시간. 적절한 소화가 이루어 지도록 튜브를 20 분마다 점검하고 수동으로 흔들어주십시오. 참고 : FACS 이전의 조직 소화의 목적은 고체 조직으로부터 단일 세포 용액을 준비하는 것입니다. 따라서 소화가 끝날 때까지는 내용물이 눈에 보이는 조직 조각이없는 두꺼운 용액이어야합니다. </li></ol></li><li> 단일 셀 솔루션 준비. <ol><li> 소화 후 미리 데워진 멸균 된 PBS로 50 mL 원심 분리 튜브를 충전하고 균등하게 혼합되도록 튜브를 뒤집습니다. 튜브를 200 xg에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 얻습니다. </li><li> 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 풀어 튜브의 바닥을 가볍게 치십시오. 적혈구를 용해시키는 완충액 3 mL (재료 표 참조)를 첨가하고 실온 (RT)에서 조직 배양 후드에서 5 분 동안 적혈구를 제거합니다. </li><li> 멸균 PBS 10 ML을 추가하고 균등하게 섞어 튜브 반전. 5 분 200 XG에서 원판 내용물을 원심 분리기 및 디스크상징액을 얻는다. 미리 데워진 0.05 % 트립신 3 mL를 넣고 5 분 동안 37 ℃에서 튜브를 보관하여 나머지 조직을 추가로 소화시킵니다. </li><li> 예열 된 IMDM 3 ML을 추가하고 100 μl의 DNase I 용액을 첨가하십시오 (PBS 1 mL에 희석 한 DNase I 0.25 mg). 튜브를 37 ° C에 보관하여 DNA 필라멘트를 분해하십시오. 세포 솔루션을 얻기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 혼합물을 전달하십시오. 효소 소화를 중화하기 위해 PBS + 5 % FBS 2 ML로 스트레이너를 두 번 씻어. </li><li> 세포를 펠렛으로 만들기 위해 5 분 동안 200xg에서 세포 혼합물을 원심 분리하십시오. 뜨는을 삭제하고 항체 얼룩에 대한 PBS + 5 % FBS의 1 ML에 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol></li><li> FACS 기반 Procr + VESC 격리. <ol><li> 기증자 유방 조직에서 얻은 세포 혼합물을 발표 된 일상적인 프로토콜 8 항체 염색법을 실시하십시오. 참고 : 다음 항체가 사용되었습니다 : 항 마우스혈액 계통 -FITC, 항 마우스 CD31 (PECAM1) -PECY7, 항 마우스 CD105-APC (모두 1㎍ / mL의 농도로 사용), 항 마우스 CD201 (Procr) - 비오틴 (농도 2.5 μg / mL) 및 streptavidin-v450 (0.5 μg / mL의 농도로 사용함). <ol><li> 항체 염색 후 PBS + 5 % FBS로 세포를 충전하고 5 분 동안 200g에서 원심 분리합니다. 뜨는을 버리고 PBS + 5 % FBS 1 ML와 세포를 resuspend. 40 μm 셀 스트레이너로 걸러냅니다. FACS 정렬까지 얼음에 놓습니다. </li></ol></li><li> Procr + VESC를 분리하기 위해 FACS 기반 정렬을 수행하십시오. <ol><li> 염색되지 않은 샘플과 각 단색 컨트롤을 분석하여 각 색상의 전압을 결정하십시오. 자동 형광 또는 배경 염색을 피하기 위해 보정 매개 변수를 계산하십시오. 원하는 세포 집단에 대한 적절한 게이팅 및 정렬을위한 템플리트를 설정하십시오. </li><li> FACS 정렬의 계층 구조를 설정하려면 먼저 파편을 제거합니다.모든 이벤트를 수행 한 다음 폭으로 트리거하여 이중선 또는 접착 성 세포 클러스터를 버립니다. 혈통 계통을 차단 한 다음 CD31 + 및 CD105 +를 사용하여 내피 세포 수를 정의합니다. 참고 : Procr + 세포는 FMO 대조군과 비교하여 CD31 + CD105 + EC로부터 분리되었다. 대표적인 FACS 분석 플롯이 그림 1에 나와 있습니다. FACS로 분리 된 VESC 모집단은 IMDM + 50 % FBS에 현탁시키고 추후 가공 할 때까지 얼음에 보관해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 유방 팻 패드를 사용 하여 생체 내 VESC 혈관 형성 분석 <ol><li> 이식을위한 주 EC를 준비하십시오. <ol><li> 10 % PBS + 5 % FBS로 FACS 정렬 세포를 탑 - 업하고 5 분 동안 200 xg에서 원심 분리하여 세포를 바닥에 내려 놓습니다. </li><li> 액체를 조심스럽게 흡인하고, hemocytometer를 사용하여 셀 번호를 계산하고, 세포막 펠렛을 기저막 매트릭스 혼합물 (consi100 ng / mL rmVEGF 및 60 U / mL 헤파린이 보충 된 50 % 기저막 매트릭스 및 20 % FBS가 함유 된 PBS)에 15,000 세포 / 15 μL의 작업 농도에 도달하도록 하였다. 참고 : 기저막 매트릭스 혼합물은 항상 얼음 위에 보관해야합니다. </li><li> 정렬 된 세포와 계수 된 세포를 연속적으로 희석하여 1.5mL 마이크로 튜브에 필요한 입력 농도에 도달 시키십시오. 최종 주입량이 총 15μL을 초과하지 않도록하십시오. 이식시 더 나은 내용 시각화를 위해 각 튜브에 0.1 % Trypan blue를 추가하십시오. 믹스하기 위해 철저히 피펫. 사용하기 전까지 얼음에 튜브를 보관하십시오. 참고 : 성공적인 선박 생성은 최소 100 VESC로 달성 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 주 EC를 유방 지방 패드에 이식하십시오. <ol><li> 수술 도구와 벤치 탑을 소독하십시오. 여러 동물에서 동일한 도구를 사용하는 경우에는 비드 살균기를 사용하여 소독 할 수 있습니다. </li><li> 3 주된 BALB / C 누드 마이크 마취귀하의 기관의 수의사와 IACUC에서 권장하는 마취 프로토콜을 사용하십시오. 수술 테이블에 등을 대고 각 마우스를 앙와위 자세로 눕습니다. 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정시킵니다. </li><li> 면봉을 요오드 계 살균 용액에 담급니다. 수술 전 피부 표면을 살균하기 위해 마우스의 복부 전체를 닦으십시오. </li><li> 마우스의 복부 피부를 잡고 포셉으로 들어 올립니다. 외과 용 메스를 사용하여 1cm 길이의 작은 절개를 만듭니다. 뒷다리를 향해 길이가 약 0.5 - 1 cm 인 두 번 자르고, 뒤집힌 Y 자형 절개를하십시오. <ol><li> 집게와 면봉을 사용하여 복부에서 피부를 부드럽게 분리하고 피부를 옆으로 핀으로 쥐의 유방을 노출시킵니다. 입체경 아래에 마우스를 놓고 배율을 2.0X로 설정합니다. 유방 지방 패드를 명확하게보고 조작 할 수 있도록 초점을 조정하십시오. </li></ol></li><li> 장소 27G 1 / 2 &quot;needl얼음에 담아서 미리 차게하십시오. 바늘 부착 부위에 갇힌 기포를 제거하기 위해 기저막 매트릭스 혼합물이 들어있는 1 mL 주사기를 미리 준비하십시오. microcentrifuge 튜브의 뚜껑에 혼합 솔루션 15 μL를 피펫 다음 뇌관 주사기로 전체 볼륨을 대기음. </li><li> 사타구니 림프절 앞에서 유방 지방 패드를 고정 핀셋을 사용하여 잡고 약간 쉽게 들어 올리십시오. 뚱뚱한 패드에 주사기 바늘의 약 1/4을 부드럽게 삽입하십시오. <ol><li> 일시 중지 패드에서 핀셋을 놓아 주사기 바늘을 잡고 안정시킵니다. 액체가 누출되지 않도록 천천히 용액을 주입하십시오. 바늘을 꺼낼 때 누출을 최소화하기 위해 셀 혼합물이 고형화되었는지 확인하기 위해 몇 초 동안 기다리십시오. </li></ol></li><li> 흡수성 봉합사로 피부 플랩을 닫습니다. 크기 5-0 비 반응성 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 피부 플랩을 봉합하고 외과 의사 스타일의 매듭으로 각 상을 닫습니다.ately 0.3 cm 떨어져있다. 또는 상처 스테이플로 피부를 닫으십시오. </li><li> 회복을 위해 별도의 케이지에 운영 마우스를 배치합니다. 마취 된 마우스가 저체온증을 앓지 않도록 케이지 위에 가열 램프를 놓습니다. 케이지 바닥에 부드러운 종이와면을 놓아 쥐가 수술 후 따뜻한 상태를 유지하게하십시오. <ol><li> 모든 수령자가 완전히 깨어날 때까지 조심스럽게 마우스를 관찰하십시오. 다음 며칠 동안, 모든 동물에게 선제 적으로 수술 후 진통제를 투여하거나 시설 수의사의 지시에 따라 투여하십시오. 상처 감염이 발생하면 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 바릅니다. 수술 상처가 상처 스테이플로 닫혀 있다면 상처가 완전히 닫힌 수술 10 일 후에 상처 클립을 제거하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 현미경 관찰을위한 전체 마운트 조직 준비 <ol><li> 조직 수확 <ol><li> 이식 후 2 - 4 주에 수혜자 BALB / c를 마취시킨다.단계 2.2.2에서와 같이, 체중 20g 당 0.12mL의 투여 량으로 2.5 % 마취제를 복강 내 주사하여 누드 마우스에게 투여 하였다. 참고 : 양성 혈관 성장은 세포 이식 후 2 - 4 주에 감지 할 수 있습니다. </li><li> 무균 PBS 50 μL에 resuspended 체중의 50 μg / 25 g의 복용량에 isolectin - 647 염료의 꼬리 정맥 주사와 수신 시스템의 순환을 라벨. 5 ~ 10 분의 쉬는 시간을 두십시오. CO 2를 사용하여 마우스를 희생한다. </li><li> 단계 2.2.4에 따라 세포가 처음 주입 된 유방 조직의 영역을 해부합니다. 외과 용 가위를 사용하십시오. 수술 블레이드를 사용하여 6cm 페트리 접시에 대략 3 ~ 4mm 3 큐브로 조직을 자릅니다. </li></ol></li><li> 조직 소화 및 항체 염색을위한 준비. <ol><li> 콜라게나 제 III가 보충 된 미리 데우는 소화 기질 (단계 1.1.2)의 10 ML로 채워진 15 ML 원심 분리기 튜브에있는 조직 조각을 소화(10 mL 당 300 U). </li><li> 100 rpm으로 설정 한 속도와 37 ° C로 설정된 흔들어 대는 플랫폼에 수평으로 15 mL 원심 분리 튜브를 놓고 약 1 시간 동안 조직 구조를 풀고 과도한 지방 세포 조직을 제거합니다. 참고 : 지방 세포는자가 형광을 생성하여 시끄러운 형광 배경을 만들 수 있습니다. 소화가 끝나면 조직 조각은 부드럽고 흐린 모양을 가져야합니다. 최적의 소화 기간은 잘게 썬 조직 조각의 크기에 따라 다르므로 최적의 결과를 얻으려면 적절하게 조정해야합니다. 조직 vasculature는 이미 형광 태그 Isolectin로 라벨이 붙어 있기 때문에, 모든 다음 절차는 빛으로부터 보호 수행해야합니다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 PBS로 조직 조각을 씻으십시오. 형광을 보존하기 위해 4cm PFA (pH 7.2 - 7.4)로 반쯤 채워진 6cm 페트리 접시에 조심스럽게 조각을 놓아서 전체 장착 조직을 고정시킵니다. 페트리 접시 놓기락킹 플랫폼에 놓고 RT에서 30 분 동안 조직을 부드럽게 교반한다. 주 : PFA는 발암 물질이므로주의해서 취급해야합니다. </li><li> 나머지 PFA를 제거하고 각 세척 사이에 10 분 간격으로 전체 고정 세척 버퍼 (PBS에 0.1 % 트윈)로 고정 된 조직을 세 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> 전체 - 마운트 조직 항체 얼룩. <ol><li> 2 ML 원심 튜브에 항체 얼룩 버퍼에 기본 항체를 희석. 4에서 밤새 일차 항체와 조직을 품어 ° C. 주 : 항체로서 래트 항 -CD31 (농도 : 10㎍ / ㎖) 또는 래트 항 -VE- 카데 렐 (CD144 / Cdh5; 농도 : 2.5㎍ / ㎖)을 사용 하였다. CD31과 VE-Cadherin은 내피를 인식하는 데 사용되는 세포 표면 마커입니다. 5x 항체 염색 완충액을 500 mM 말레 산, pH 7.5로 제조하고; 750 mM NaCl; 및 0.5 % (v / v) 트윈은 PBS에 용해된다. 신선한 1x 작업 용액을 준비 할 때만 적절한 혈청 용적 (5 %)을 첨가하십시오9 . </li><li> 항체 염색 버퍼를 제거하고 10 분 간격으로 세척 버퍼로 전체 마운트 조직 세 번 씻으십시오. 락커트 플랫폼에서 4 시간 동안 또는 4 ° C에서 밤새 2 차 항체 ( 재료 표 참조) 플러스 RT에서 DAPI와 조직을 품어. 참고 : 핵을 시각화하기 위해 5 μg / mL의 최종 농도로 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하십시오. </li><li> 10 분 동안 각각 3 번 세척 버퍼로 전체 마운트 조직을 씻으십시오. 80 % 글리세롤 또는 80 % 자당에서 조직 조각을 밤새 품어 더 나은 보존을 위해 조직을 탈수하십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 개별 조직 조각을 놓고 과도한 탈수 버퍼를 제거하십시오. 장착 매체와 조직을 덮고, coverslip을 배치하고 부드럽게 그것을 설정하는 조직을 쥐어 짜십시오. </li><li> 공 촛점 현미경 이미지 수집을 수행하십시오. 전체 장착 유방 땀샘의 경우, NA = 1.3 오일 목표를 가진 40X를 사용하여 이미지를 획득하십시오ve. 1,024 x 1,024의 광학 섹션 해상도와 1.0 - 1.2 μm의 레이어 분리로 Z 스택의 타일 스캔을 획득합니다. 참고 : 올바른 형광 신호를 포착하려면 필터 빔 스플리터를 PMT Gain 600-800의 게인 설정으로 트리플 다이크로 익 (TD) 488/553/638로 설정해야합니다. 다음의 여기 / 방출 원을 사용해야한다 : 488/509 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mGFP; 532/588 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mTomato; Alexa-647, 여기 / 방출 최대 값은 594/665; 및 DAPI (350 / 470의 여기 / 방출 최대 값). </li></ol></li></ol> 4. 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 계통 추적 <ol><li> 마우스 모델을 사용하여 Procr + VESC를 탐지합니다. <ol><li> Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 라고 함) 노크 인 마우스를 사용하십시오. 참고 :이 마우스 모델에서는 CreERT2-IRES-tdTomato 카세트 <sProcr 11 의 첫 번째 ATG 코돈 다음에 10이 삽입됩니다. <ol><li> (R26 mTmG이라 함) Rosa26 mTtomatomGFP 리포터 균주 크로스 Procr CreERT2 마우스 생체 내에서 내인성 Procr 11 +되는 EC의 운명을 추적한다. GFP 발현을 사용하여 모든 내인성 Procr + EC 및 그 자손을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 사춘기 단계 (5 주) 동안 체중 4 mg / 25 g의 용량으로 타목시펜 용액 11 (10 mg / mL의 저장 용액을 만들기 위해 땅콩 기름 + 10 % 에탄올에 용해 된 타목시펜 10 mg을 복강 내 투여) 이전) Procr + EC의 발달 과정을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 3 단계에서 설명한 준비 단계에 따라 Whole-mount immunostaining으로 표지 된 세포의 클론 형성 효율을 분석합니다. 단기 (2 일) 및 연장 된 기간 (최대 10 개월). 그림 3을 참조하십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

혈관 신생 분석은 혈관 역학을 연구하기위한 훌륭한 실험적 접근 방법입니다. 출생 개발 마우스 망막 혈관은 혈관 신생 (12)을 연구하는 매력적인 모델로 입증되었습니다. 비교적 접근하기 쉽지만 망막 혈관 내에서의 실제 조작은 다소 어렵습니다. 지금까지 가장 잘 설명 된 생체 내 이식은 수혈 마우스의 옆구리 부위에 피하로 주사하거나 주입하는 피하 시험입니다. 이러한 혈관 신생 분석은 내장 세포의 재생 잠재력 및 혈관 형성 능력을 시험하는데 효과적이다. 그러나, 이식 된 매트릭스 플러그의 위치는 세포 내에서 비교적 고립 된 환경을 생성하기 때문에, 최적의 생리 학적 틈새를 제공하지 못한다. 최근에, 새로운 폐 혈관 신생 모델은 또한 표면에 피브린 패치를 적용하여 개발되었다마우스 폐의 부위 13 . 그러나,이 기법은 마우스 흉강 내에서 침습적으로 작용하기 때문에, 조작은 또 다른 위험을 야기하므로 좀 더 일반화 된 분석 설정에서 사용...

개발과 항상성 동안, 혈관 성장과 개조는 신실하게 기관 성장과 수리에 따라 일어납니다. 혈관 신생은 선재 혈관으로부터의 새로운 혈관 생성을 설명하며, 이러한 동적 인 혈관 변화를 중재하는 주요한 힘으로 간주된다. 각 혈관은 내피 세포 (inner cells, ECs)의 층으로 안쪽에 늘어서 있으며 혈관 건축의 기초로 보인다. 오랜 시간 동안 항상성 (homeostasis) 동안 EC pool이 보충되는 메카니즘은 여전히 ​​명확하지 않았으며, 혈관 회전율이 성숙한 EC 증식의 결과인지 혈관 줄기 / 전구 세포 활동의 기여인지에 대한 주장이 제기되었다. 직접적인 생리 학적 증거가 없기 때문에 혈관 내피 줄기 세포 (Vascular endothelial stem cell, VESCs)의 존재와 세포 신원은 논란의 여지가있다. 줄기 세포 행동을 확인하는 데 사용되는 가장 일반적인 접근법 중 하나는 transplan추정 줄기 세포를 수령 마우스에 투여 이 방법 은 생체 내 후보 줄기 세포의 줄기 가능성을 측정합니다 . 이식은 먼저 조혈 시스템 2 의 계층 적 특징의 수립에 기여한 골수 줄기 세포 1 의 연구에 적용되었습니다. 내피 분야에서, 측면 피부 아래 피하에 삽입 된 기저막 매트릭스 ( 예 : matrigel) 플러그는 이식 된 EC의 혈관 형성 능력을 설명하기 위해 사용 된 생체 내 혈관 신생 분석 표준이었다. 3D 배양 시스템과 이식에서의 콜로니 형성을 포함한 여러 실험 방법은 잠재적 인 EC progenitor / VESC 집단을 3 , 4 , 5 , 6으로 제안했다. 그러나, 기저막 매트릭스에 내장 된 EC는 상대적으로 분리되어 있기 때문에주변 조직은 이식 된 세포의 혈관 신생 가능성을 완전히 탐색하는 데 필요한 최적의 틈새 환경을 제공하지 않습니다. 결과적으로, 매트릭스 플러그 내에 형성된 혈관은 주로 모세 혈관 유사하며 기능적으로 측정 불가능합니다. 유선은 출생 후 사춘기 및 임신 기간 동안 가장 강력한 성장을 보이며 발달합니다. 사춘기 단계에서 유방 상피는 주위의 혈관 구조물을 효과적으로 개장하는 동시에 유방 지방 패드 전체를 차지하도록 급속히 팽창합니다. 따라서 유선은 혈관 신생 연구에 훌륭한 모델입니다. 그것은 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공하며, 따라서 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가하기위한 이상적인 이식 부위이다. 또한 유방 지방 패드는 형성된 외인성 혈관이 숙주 순환 시스템과 통합되도록하여 functional 평가 및 피하 이식에 대한 이점을 나타냅니다. 시험 관내 배양 및 이식 시험은 세포 집단의 재생 특성을 조사하는 효과적인 방법이기는하지만, 세포가 원래의 서식처에서 제거됨에 따라 가소성을 자극 할 수 있으며 세포가 분리되면 변화가 유발 될 수 있음이 알려져있다 그들의 생리적 환경 7 . 그러므로 세포 내 운명의 직접적인 생체 내 증거를 얻는 것이 내피 개체군의 행동에 대한 현재의 이해를 발전시키는 핵심 접근법이다. 생체 내에서 줄기 세포의 생체 내 행동을 밝힐 수 있기 때문에 VESC의 확인과 신체 시스템의 특성 조사에 유전 학적 운명 매핑 ( 즉, 생체 내 혈통 추적)이 반드시 필요합니다. 평가했다. 계보 traci후보 VESC의 장기 지속성 ( 즉, 자가 갱신)과 기원 조직 ( 즉, 분화 효능)을위한 세포 유형을 생산할 수있는 능력에 대한 직접적인 증거를 제공한다. 이 프로토콜은 VESC의 혈관 생성 능력을 관찰하기위한 새로운 유방 지방 패드 이식 기술과 혈통 추적 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 현재 이용 가능한 분석법의 단점을 극복하고 VESC의 줄기 세포 특성을 최적으로 평가하는 새로운 방법을 제공합니다. 이러한 접근법은 병적 인 환경에서 혈관 세포 효능의 변화를 결정할뿐만 아니라 내피 집단의 행동 및 혈관 형성 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 효율적인 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0.05% 트립신</td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m 필터 유닛</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 & 마이크로; m 필터</td></tr><tr><td>2-메틸부탄올-2, 시약플러스</td><td>시그마-알드리치</td><td>24, 048-6</td><td>Tert 아밀 알코올</td></tr><tr><td>222, 트리브로메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>T48402-25g</td><td>222, 트리브로메탄올</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>인비트로겐</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &micro; m 세포 스트레이너</td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>유리 슬라이드</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, 클론 MJ7 / 18</td><td>1 &micro에서 FACS 분석 사용; g/mL</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD201 비오틴</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>2.5 &micro에서 FACS 분석용 사용; g/mL</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD31 PE-시아닌 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82,</td><td>1 &micro에서 FACS 분석용 클론 390; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>콜라겐분해효소 III</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>컨포칼</td></tr><tr><td>소 췌장에서 Deoxyribonuclease I</td><td>시그마</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>당나귀 anti-Rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>2 차 항체, 0.5 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Dumont 집게 - 마이크로 뭉툭한 팁</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>집게</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>FACS 분석을 위한 혈통 칵테일, 25 &micro에서 사용; L 테스트 당</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G6279</td><td>글리세롤</td></tr><tr><td>이스코프의 수정된 둘베코의 매체</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>이소렉틴 GS-IB4 그리포니아 심플리시폴리아, 알렉사 플루오라&nbsp; 647</td><td>인비트로젠</td><td>Z32450</td><td>이소렉틴-647</td></tr><tr><td>마트리겔&nbsp; Matrix (성장 요인 감소)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>마우스 스트레인 (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>마우스 스트레인 (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>마우스 스트레인&nbsp; (BALB/C누드)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c 누드</td><td>마우스</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade 시약</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>쥐 안티 CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>전체 마운트 분석, 내피 타이트 접합에 대한 안티-VE-Cadherin / Cdh5 안티bdy, 2.5 &마이크로에서 사용; 전체</td></tr><tr>마운트 analusis에 대한 g/mL<td>쥐 안티 CD31-biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>, 내피 표면 접착 분자에 대한 안티 CD31/PECAM1 항체, 10 &마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>시그마</td><td>R7767-100ML</td><td>적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>스트레이트/샤프-블런트/10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>미세 가위</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>FACS 분석용 0.5 &마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>시그마</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>왁스 코팅 브레이디드 실크 (크기 5-0 USP (1 메트릭), 18 인치 (45 cm) BLACK on C-1 Needle)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>봉합사&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 일회용 Scaplels</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>메스</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng 의료</td><td>20160101</td><td>방부제 솔루션</td></tr></tbody></table>

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

내피 세포 (EC)는 혈관 건축의 기본 구성 요소이며 혈관 성장과 개조를 매개하여 적절한 혈관 개발과 항상성을 보장합니다. 그러나 내피 계통의 계층 구조에 대한 연구 는 생체 내에서 의 행동을 직접적으로 평가할 수있을뿐 아니라 액세스를 얻기위한 도구가 없기 때문에 여전히 어려움을 겪고 있습니다. 이 결점을 해결하기 위해, 유방 지방 패드를 사용하여 혈관 신생을 연구하는 새로운 조직 모델이 개발되었습니다. 유선은 사춘기 및 임신을 포함하여 출생 후의 단계에서 주로 발생하며, 그 동안 견고한 상피 증식이 광범위한 혈관 재 형성을 동반합니다. 유방 지방 패드는 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공합니다. 또한 유방 지방 패드는 복강 외에도 위치하여 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가할 수있는 쉽게 접근 할 수있는 접목 사이트가됩니다. 이 작품은 또한 효율성in vivo에서 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 표적 집단을 특이 적으로 표지하기 위해 형광 리포터 마우스를 사용하는 nt 추적 접근법. 이 계통 추적 방법은 후속 조직 전체 장착 현미경과 결합하여 표적화 된 세포와 그 자손을 직접 시각화 할 수 있으며이를 통해 증식 능력을 정량화 할 수 있고 분화 약속을 운명 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 VESCs를 발현하는 양성 단백질 C 수용체 (Procr)의 개체군이 최근 여러 혈관계에서 확인되었다. Procr + VESCs는 새로운 EC와 혈관 주위 세포 모두를 일으키며, 발달, 항상성 및 상해 복구 중 혈관 신생에 적극적으로 기여합니다. 전체적으로이 원고는 VESC의 줄기 세포 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 새로운 유방 지방 패드 이식과 생체 내 혈통 추적 기술을 설명합니다.

유방 VESC 격리 : 결과 이식 분석을위한 내피 개체군을 분리하기 위해, 성숙한 (8 주령) 처녀 마우스 유선을 공여체 재료로서 수확했다. 내피 세포는 항체 - 기질 세포 분류 기술을 사용하여 분리 하였다. 8 주령의 C57BL / 6 유방 선되는 EC의 VESC 인구의 FACS 분석의 대표적인 플롯 (허가 유 등. (8)로부터 적응도)도 1에 나타내었다. 유방 뚱뚱한 패드 이식 : 유방 지방 패드는 혈관 신생 연구에 이상적인 사이트를 제공...

이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

본 실험의 전반적인 목표는 유선 지방 패드 이식 기술과 이후 현미경 관찰을 위한 전장 조직 표본 제작을 통해 혈관 내피 줄기세포의 증식, 분화 및 혈관 생성 잠재력을 평가하는 것입니다. 이 방법은 생체 내(in vivo)에서 혈관 내피 줄기세포의 줄기세포성 특성을 최적으로 평가할 수 있는 새로운 방식을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 사춘기 동안 유선이 새로 형성된 혈관의 생성 및 통합을 위한 이상적인 혈관 형성 환경을 제공한다는 점입니다.이를 통해 이식된 내피 세포의 기능적 평가가 가능해집니다. 이 기술의 활용 범위는 내피 기능 테스트에 국한되지 않으며, 국소 혈관 리모델링에 미치는 혈관 형성 인자의 영향을 평가하는 영역까지 확장될 수 있습니다.이러한 접근 방식은 종양 환경 내 내피 세포 집단 연구 및 세포 분화능의 변화 연구를 포함한 여러 학문 분야에 적용할 수 있는 효율적인 도구입니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Wenqian Song이 맡았습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 조직 소화 기반 배지를 준비하고 8주령의 Actin-GFP 성숙 처녀 리포터 마우스를 희생시킨 후, 먼저 하복부 중앙선에 수직으로 피부 절개를 내어 메스로 네 번째 한 쌍의 서혜부 유선을 적출하십시오.다진 조직의 무게를 측정하여 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 소화 버퍼를 조제하기 위해, 소화 기반 배지 10 milliliters당 300 units의 collagenase type three를 첨가합니다. 고르게 혼합한 후 이를 다진 조직에 추가합니다.50 mL 원심분리 튜브를 로킹 플랫폼 위에 수평으로 놓고 속도를 100 rpm, 온도를 37 °C로 설정합니다. 유선 조직을 2시간 동안 교반합니다. 소화가 완료되면 50 mL 원심분리 튜브에 미리 데워둔 멸균 PBS를 가득 채우고 튜브를 뒤집어 고르게 섞습니다.그다음 튜브를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 세포 펠렛을 풀어줍니다. 그런 다음 적혈구 용해 버퍼 3 mL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 제거합니다.멸균된 PBS 10 milliliters를 넣고 튜브를 뒤집어 균일하게 섞습니다. 그 다음 조직을 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, 미리 데워둔 0.05%trypsin 3 milliliters를 넣고 37 degrees Celsius에서 5분 동안 배양하여 남은 조직을 추가로 소화시킵니다. 이어서 미리 데워둔 IMDM 3 milliliters를 넣고, DNase I 용액 100 microliters를 추가합니다.DNA 필라멘트를 분해하기 위해 튜브를 37 °C에서 배양합니다. 그런 다음 조직 혼합물을 70 micron 셀 스트레이너에 통과시켜 세포 용액을 얻습니다. 효소 소화를 중단시키기 위해 5% FBS가 포함된 PBS 2 mL를 사용하여 스트레이너를 두 번 헹굽니다.세포 혼합물을 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 항체 염색을 위해 세포 펠릿을 1 mL의 PBS 및 5% FBS에 재부유시킵니다. 항체 염색 후, 세포에 PBS 및 5% FBS를 추가하여 채우고 샘플을 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.그 다음 상층액을 제거한 후, 5% FBS가 포함된 PBS 1 mL를 사용하여 세포를 재부유시킵니다. 이 현탁액을 40 micron 세포 체(cell strainer)로 여과합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 FACS 기반 분리법을 수행하여 protein C receptor 양성 혈관 내피 줄기세포를 분리합니다.FASC로 분리된 세포에 PBS와 5% FBS 혼합액 10 milliliters를 추가한 후, 200 times g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 튜브 바닥에 가라앉힙니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고 basement membrane matrix 혼합액으로 세포 펠렛을 재부유시켜 15 microliters당 15,000 cells가 되도록 합니다. 분리 및 계수한 세포를 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에서 연속 희석하여 필요한 투입 농도에 맞추며, 이때 최종 주입 부피가 15 microliters를 초과하지 않도록 주의합니다.그 다음, 이식 중 콘텐츠 시각화를 용이하게 하기 위해 각 튜브에 0.1% trypan blue를 추가합니다. 파이펫으로 충분히 섞어준 후, 사용 전까지 튜브를 얼음에 보관합니다. 일차 혈관내피세포 또는 ECs를 유선 지방 패드로 이식하려면, 각 마우스가 수술대 위에 등을 대고 눕도록 앙와위로 배치합니다.그 다음, 접착 테이프를 사용하여 사지를 고정합니다. 면봉을 요오드계 소독액에 적십니다. 수술 전 피부 표면을 살균하기 위해 마우스의 복부 전체 영역을 철저히 닦아냅니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 마우스의 복부 피부를 잡고 들어 올립니다. 그 후 수술용 메스로 1cm 길이의 작은 수직 절개를 가합니다. 뒷다리 방향으로 각각 약 0.5~1cm 길이의 절개를 두 번 더 가하여 역Y자 모양의 절개선을 만듭니다.포셉과 면봉을 사용하여 복부에서 피부를 조심스럽게 분리하고, 피부를 옆으로 핀으로 고정하여 서혜부 유선을 노출시킵니다. 그다음 마우스를 실체 현미경 아래에 두고 배율을 2X로 설정합니다. 27 gauge 1/2 inch 바늘을 얼음 위에 올려 미리 냉각시킵니다.주사기를 프라이밍한 후, 15 µL의 basement membrane matrix 용액을 마이크로원심분리 튜브 캡 위에 분주하고 프라이밍된 주사기로 전체 부피를 흡입합니다. 세포 내용물이 완전히 주입되도록, 프라이밍 및 세포 채취 후 바늘 안에 공기가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 정밀 핀셋을 사용하여 서혜 림프절 앞의 유선 지방 패드를 잡고, 주입이 쉽도록 약간 들어 올립니다.그런 다음 주사기 바늘의 약 1/4을 지방 패드에 조심스럽게 삽입합니다. 주사기 바늘을 고정하고 안정화하기 위해 지방 패드를 잡고 있던 핀셋을 뗍니다. 액체가 새는 것을 방지하기 위해 용액을 천천히 주입합니다.그런 다음 바늘을 몇 초 동안 제자리에 유지하여 세포 혼합물이 고형화되었는지 확인함으로써 바늘을 뽑을 때 누출을 최소화합니다. 5-0 gut 흡수성 봉합사를 사용하여 피부 플랩을 닫고 봉합하며, 외과적 매듭법으로 각 매듭 사이의 간격을 약 0.3 centimeters로 하여 상처를 폐쇄합니다. 조직을 채취하려면, PBS에 희석한 Isolectin 647 염료를 꼬리 정맥에 주입하여 수용체의 전신 순환계를 표지합니다.5~10분 동안 휴식 시간을 둡니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 희생시킨 후, 외과용 가위를 사용하여 세포를 처음 주입했던 유선 조직 부위를 절제합니다. 6cm 페트리 접시에서 외과용 메스를 사용하여 조직을 약 3~4mm³ 크기의 입방체로 잘게 자릅니다.그 후 조직 조각을 소화시키기 위해, collagenase three가 첨가되어 미리 가온된 10 mL의 소화 배지가 들어 있는 15 mL 튜브로 조직을 옮깁니다. 조직 구조를 느슨하게 하고 과도한 지방 세포 조직을 제거하기 위해, 15 mL 원심분리 튜브를 로킹 플랫폼 위에 수평으로 놓고 100 rpm, 37 °C에서 약 1시간 동안 반응시킵니다. 다음으로, 실온에서 10분 동안 PBS를 사용하여 조직을 세척합니다.그 다음 형광을 보존하기 위해, 4% PFA가 절반 정도 채워진 6cm 페트리 접시에 조직 조각들을 조심스럽게 넣어 전체 마운트 조직을 고정합니다. 페트리 접시를 로킹 플랫폼 위에 올려놓고 실온에서 30분 동안 조직을 부드럽게 흔들어 줍니다. 텍스트 프로토콜에 따라 조직을 세척하고 희석된 1차 항체에서 배양한 후, 염색액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 조직을 10분씩 3회 세척합니다.그런 다음 조직을 이차 항체와 DAPI가 포함된 용액과 함께 실온에서 4시간 동안 로킹 플랫폼 위에서 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후, 더 나은 보존을 위해 조직을 80% glycerol 또는 80% sucrose에 넣어 하룻밤 동안 탈수시킵니다. 조직을 마운팅하고 텍스트 프로토콜에 따라 공초점 현미경 관찰을 수행합니다.FACS를 이용한 세포 분리의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 혈액 계통 세포들을 게이팅하여 제외하였으며, CD31 양성 및 CD105 양성 세포를 내피세포로 정의한 후, 단백질 C 수용체 양성 내피 줄기세포를 농축하였습니다. 이 공초점 이미지는 이식 부위의 수용체 유선 지방 패드를 나타냅니다.이식된 protein C receptor 양성 내피세포로부터 형성된 혈관들이 숙주의 유선 혈관계로 통합되어 기여하였습니다. 이 그림에서는 수혜자의 유선 혈관계를 보여줍니다. 수혜자 마우스에 Isolectin을 정맥 주사한 결과, protein C receptor 양성 내피세포가 내강이 형성된 기능적 혈관을 형성했음을 확인하였습니다.이 이식 절차를 숙달하면, 적절하게 수행할 경우 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 절차를 시도하는 동안, 수술 후 수혜 동물을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 고통이나 감염 징후가 관찰될 경우 적절한 관리 절차를 제공해야 합니다.이 절차에 따라, 생체 내의 다양한 생물학적 과정 동안 표적 세포의 거동을 조사하기 위해 세포 계보 추적과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 발전은 혈관 생물학 분야의 연구자들이 생리적 및 병리적 조건 모두에서 내피 세포 하위 집단의 잠재력을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 내피 세포 집단의 혈관 형성 능력을 조사하고 형성된 혈관의 기능을 평가하기 위해 유선 지방 패드 이식 및 조직 전체 마운트 준비법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서 DeOme 킬로바이트 개발한 절차를...

내유 상피 이식 절차

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

이 논문은 혈관 줄기세포를 대동맥 혈관 벽으로 정밀하게 초음파 유도하여 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 혈관 벽을 효과적으로 표적으로 삼고 대동맥류 및 박리에서 혈관 복구를 촉진합니다.

대동맥 질환의 혈관 복구를 위한 정밀 초음파 유도 줄기세포 전달

배우세요 혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성 능력을 평가하는 유방 팻 패드 이식 기술을 통해 생체 내 줄기세포 특성을 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 혈관 재생 의학 연구에 활용됩니다.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

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