Name: 병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 배우세요 유선 전체 장착 조직에서 병변을 식별하는 조직병리학적 기법을 마우스 모델에서. 이 방법은 생식 및 발달 연구에서 유선 평가의 정확성을 높여줍니다.

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저자는이 프로젝트에 대한 기술적 전문성과 지원으로 Pam Ovwigho, Tenette Jones 및 NIEHS의 Natasha Clayton을 인정하고자합니다.

이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물 보살핌 및 사용위원회와 협회의 평가 및 인정 협회에서 실험 동물 관리 인증 시설. 1. 유방 전체 마운트 준비 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> 참조 3에 설명 된대로 임신하지 않은 CD - 1 암컷 마우스의 한쪽에서 사타구니의 유선을 제거하고 정전기가있는 슬라이드에 올려 놓습니다. </li><li> 글 랜드를 붙지 않는 종이 또는 필름으로 덮고 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 글 랜드가 슬라이드에 고정되어 고정되도록 글 랜드를 평평하게 펼치기 위해 슬라이드에 압력 ( 예 : 물 무게)을가하십시오. </li><li> 슬라이드를 고정액 ( 예 : 100 % 에탄올, 클로로포름, 빙초산 6 : 3 : 1 비율)에 담근다.실온에서 하룻밤. </li><li> 정착액에서 땀샘을 제거하고 에탄올에서 15-30 분 동안 씻으십시오. 30 분 세척 후에 에탄올 1/3을 붓고 물을 가하여 서서히 물로 변합니다. 매번 약 5 분 동안 씻으십시오. 그리고 물을 3 번 더 가하여 반복하십시오. </li><li> 12-24 시간 동안 얼룩 ( 예 : 카민 연금 용액). 참고 : 두꺼운 조직은 더 긴 염색 시간을 필요로합니다. 자세한 염색 방법은 참고 문헌 3 을 참조하십시오. </li><li> 할당 된 시간 후에 얼룩을 털어 내고 슬라이드를 30 초 동안 물에 헹구십시오. 95 % 에탄올에서 15 분 씻고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 최종 씻음을 수행하여 15 분 동안 70 % 에탄올에서 슬라이드를 세척하여 조직을 탈수. </li><li> 조직을 두껍게하면 최소 24 시간 이상 자일 렌에 넣고 조직에서 지방을 제거하여 불투명 한 부분이나 흰색 부분을 제거합니다. </li><li> 자일 렌에서 티슈를 제거하고 신속하게 m조직 탈수증을 피하기 위해 슬라이드에 매체를 ounting; 상단에 coverslip을 놓으십시오. 적어도 48 시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다. </li><li> 2 에서 설명한대로 전체 장착 된 조직을 비정상 상태로 평가하십시오. 참고 : 병변이 전체 마운트에서 감지되고 신원 확인을 위해 절편이 필요한 경우 다음 단계를 따라야합니다. </li></ol> 2. 유리 슬라이드에서 유방 전체 마운트 제거 <ol><li> 유성 전체 마운트 슬라이드를 자일 렌으로 가득 찬 유리 얼룩 항아리에 담그고 coverslip 및 장착 매체를 제거하십시오. 참고 : 과도한 장착 솔루션으로 두꺼운 조직과 슬라이드는 커버 슬립 제거에 추가 시간이 필요할 수 있습니다. </li><li> 초기 밤새 담가 준 다음, 슬라이드를 신선한 크실렌에 넣고 6 시간 동안 담그십시오. 신선한 크실렌에 마지막으로 한 번 담근다. 참고 : 커버 슬립은 마지막 담금 후 슬라이드에서 쉽게 떨어집니다. </li><li> ag손을 사랑, 슬라이드를 잡고 조심스럽게 한 조각에 제거되도록 포셉 한 쌍의 coverslip을 제거하십시오. 참고 : coverslip 여전히 유리 슬라이드에 첨부 된 경우, 약간의 노력으로 제거 할 수있을 때까지 몸을 담그기를 계속하십시오. </li><li> coverslip가 제거되면, 자일 렌을 포함 유리 페트리 접시에 수직으로 슬라이드를 잡고 신중하게 날카로운, 일회용 면도날을 가지고 슬라이드 아래로 단일 운동에 블레이드를 슬라이드. </li><li> 일단 조직이 제거되면, 유분 패드를 크실렌이 채워진 유리 페트리 접시에 신속히 잠기 게하여 조직이 공기 건조하지 않도록하십시오. 참고 :이 단계에주의하십시오. 전체 마운트는 얇고 (≤ 1 mm) 크실렌 가공으로 인해 깨지기 쉽습니다. 모든 인상이나 눈물이 조직의 형태를 변화시키고 나중의 평가를 복잡하게 만들 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 처리 <ol><li> 일단 조직이 페트리 접시에 있으면 신중하게 그것을 전송표지 된 조직 학 카세트에. 뭉툭한 코 모양의 톱니 모양의 집게로 지방 패드의 가장자리를 잡고 조직 손상을 최소화하십시오. <ol><li> 면도칼을 사용하여 더 큰 조직 (특히 쥐의 경우)을 반으로 잘라내어 조직 크기를 수용 할 수있는 두 개의 별개의 분류 된 카세트에 두십시오. 조직을 오른쪽면을 위로 향하게합니다 (참조로 림프절을 사용하십시오). 림프절이없는 조직을 카세트로 옮길 때 똑바로 세우십시오. </li></ol></li><li> 카세인을 키 실렌 용기에 넣고 최대 2 시간 동안 티슈 프로세서에 넣습니다. 참고 : 샘플을 카세트에 넣은 당일에 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. 크실렌에 장시간 담그는 것은 테스트되지 않았습니다. </li><li> 최대 수의 카세트를 손으로 티슈 프로세서에 넣으십시오. </li><li> 시작하기 전에이 프로세스에 사용될 모든 시약을 프로세서의 시약 목록에 프로그래밍하십시오. 이동을 자동화하려면한 스테이션에서 다른 스테이션으로 이동하려면 메뉴 옵션을 사용하여 새 프로그램을 작성하십시오. 모든 단계가 완료되면 &#39;확인&#39;을 선택하여 계속 진행하십시오. 참고 : 프로세서는 시작하기 전에 모든 스테이션 세부 정보를 검토 할 수 있습니다. <ol><li> 37 ℃에서 30 분 동안 크실렌에 카세트를 담그도록 프로세서를 자동화 한 다음 동일한 조건에서 새 크실렌에 두 번째 담그십시오. 프로세서를 자동화하여 자일 렌 용액에서 카세트를 제거하고 조직을 60 ° C에서 30 분 동안 1 : 1 크실렌 : 용융 파라핀 혼합물이 들어있는 다음 스테이션으로 옮깁니다. 참고 : 프로세서는 용융 된 파라핀이 들어있는 새 챔버에 카세트를 1 시간 동안 옮깁니다. 1 시간 후 시료는 새로운 용융 파라핀의 새로운 챔버로 자동 이송되어 2 시간 더 처리됩니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다. </li><li> 프로세서는 용융 된 파라를 포함하는 스테이션으로 카세트를 이송합니다1 시간 동안 ffin. 그런 다음 샘플을 자동으로 새로운 용융 파라핀 최종 스테이션으로 옮기고 추가 2 시간 동안 가공합니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 가공 유방 조직 삽입 <ol><li> 몰드에 조직을 삽입 할 준비가 될 때까지 삽입 스테이션의 58 ° C 파라핀 고정 탱크에 카세트를 놓습니다. </li><li> 카세트 커버를 제거하여 조직의 최적 금형 크기를 결정하십시오. 곰팡이가 조직을 수용하기에 충분히 큰 지 확인하고 조직이없는 경계선 주위에 파라핀이없는 충분한 공간을 남겨 둡니다. </li><li> 용융 된 파라핀 3 ~ 4mm를 금형에 넣고 유리 슬라이드의 하단과 카세트의 바닥에 인접한 유성체 전체 표면을 금형에서 위로 향하게합니다. </li><li> 금형을 냉각 판에 옮기고 필요에 따라 금형과 평행이되도록 조직을 신속하게 조정하십시오. b오트밀. 참고 : 파라핀이 경화되면 조직이 제자리에 고정됩니다. </li><li> 따뜻한 포셉을 사용하여 카세트의 아래쪽 절반을 금형 위에 놓습니다. 포셉을 사용하여 단단히 누르십시오. </li><li> 연속 카세트 전체를 덮기 위해 추가로 용융 파라핀을 몰드에 추가하십시오. 몰드를 따뜻한 판에서 차가운 판으로 이동시켜 블록의 경화를 완료하십시오. </li><li> 파라핀이 완전히 응고되어 균열이나 공기 방울이 생기지 않는 경우 금형에서 블록을 제거합니다. 참고 : 파라핀 묻힌 조직을 준비가 될 때까지 실내 온도에 보관하십시오. </li></ol> 5. Microtome에 파라핀 묻힌 유방 조직 단면도 <ol><li> sectioning하기 전에 -20 ° C에서 1 시간 파라핀 블록을 품어. 참고 : 원래 덮개가 달린 전체 장착 티슈에서 블록에 잔여 장착 매체가 있습니다. 블록을 차게하면 블록 세분화 및 리핑이 향상됩니다. </li><li> 마이크 준비하기신선한 증류수가 들어있는 수조를 켜고 42-45 ° C로 온도를 조절하여 로토메를 얻는다. 신선하고 얇은 날을 마이크로톰 위에 놓고 4 μm로 설정하십시오. 참고 : 조직에 잔여 장착 매체가 있기 때문에 단면 품질이 4 μm보다 두꺼운 부분은 줄어 듭니다. </li><li> 왁스가 블레이드를 마주하고 수직면과 정렬되도록 블록을 마이크로톰에 삽입하십시오. 그런 다음 차가운 물에 거즈 패드 부분을 적신 다음 몇 분 동안 블록 위에 놓습니다. </li><li> 거친 고급 휠과 함께 시계 방향으로 커다란 바퀴를 돌리면서 블록의 전체면이나 대표 부분을 얻을 때까지 블록을 분할하십시오. 참고 : 조직은 전체 장착 과정에서 크실렌 제거 때문에 얇습니다. 블록을 블레이드와 올바르게 정렬하여 대표 섹션을 얻는 데 필요한 절단 수를 최소화합니다. </li><li> 리본을 선택하십시오.섹션을 손으로 조심스럽게 뜨고 (45 ° C) 따뜻한 물통 (사전 준비)에 리본을 조심스럽게 올려 놓고 조직 주름이 흩어 지도록 조심스럽게 섹션을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 띄웁니다. </li><li> 과도한 물을 제거하기 위해 슬라이드를 건조 랙에 똑바로 세웁니다. 37 ° C에서 약간 열린 슬라이드 상자에 슬라이드를 품어주십시오. </li></ol> 6. 단면 유방 조직의 자동 및 수동 H &amp; E 염색 <ol><li> 얼룩이지기 전에 슬라이드는 실온에서 보관됩니다. </li><li> 자동 염색의 경우 기본 메뉴의 얼룩 옵션에서 H &amp; E를 선택하십시오. 탈 파라핀 화, 염색 및 탈수는 모두 자동화 된 염색기에서 완료됩니다. 장착 매체와 coverslip을 사용하여 섹션을 마운트하십시오. </li><li> 수동으로 슬라이드를 염색 경우, 5 분 동안 자일 렌에 슬라이드를 immersing하여 섹션을 deparaffinize. 신선한 크실렌으로 옮기고 5 분 동안 반복하십시오. </li><li> thers immersing하여 슬라이드 rehydrateem 100 % 에탄올에서 2 분씩 3 분간 처리 한 후 95 % 에탄올에서 2 회 반복하고 5 분마다 1X 세척 완충액에서 2 회 세척한다. </li><li> 슬라이드를 증류수로 헹구십시오. </li><li> 1-2 분 동안 hematoxylin에 슬라이드를 추가합니다. 슬라이드를 꺼내 5 분 동안 흐르는 수돗물로 헹굽니다. 참고 : 사용 전 헤 마톡 실린을 걸러냅니다. </li><li> 슬라이드를 1 % 빙초산에 넣고 30 초간 분화를 촉진시킨 다음 1 분 동안 수돗물로 헹구십시오. </li><li> 30 분 ~ 1 분 동안 1X PBS에 슬라이드를 추가하여 조직 절편을 파란색으로 한 다음 수돗물로 5 분간 헹구고 15 ~ 20 초 동안 95 % 알코올로 헹군다. </li><li> 30 초에서 1 분간 에오신 용액으로 대조 염색하십시오. 다음에, 신선한 95 % 에탄올에서 두 번 탈수 해 100 % 에탄올에서 2 번 반복합니다. 각 세척을 5 분 동안 수행하십시오. </li><li> xylene에있는 슬라이드를 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오. </li><li> Coverslip장착 매체와 조직 섹션과 상온에서 하룻밤 건조 플랫. </li></ol>

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</ol>

저자는이 기사의 연구, 저자 및 / 또는 출판과 관련하여 선언 할 수있는 이해 관계가 없습니다.

유선의 전체 마운트는 내분비 교란 물질을 포함한 화학 물질에 노출 된 후에도 발생할 수있는 정상적인 유방 발달 및 형태 학적 변화를 설명하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 동일한 동물의 전체 산과 H &amp; E 섹션을 함께 평가하면 조기 변경에 대한 정확한 시각적 스냅 샷을 제공 할 수 있으며, 이는 더 병이있는 상태로 진행될 수 있습니다. 이 유용한 정보를 얻을 수있는 능력은 조직을 제거 할 때 선 형태를 보존하고 손상시키지 않도록주의를 기울이는 데 있습니다. 설치류가 등쪽 벽을 따라 양측에 위치하는 여러 유선 위치를 가지고 있지만 근육 조직 회복을 최소화하기 위해 4 th 및 5 th 땀샘을 수집하는 것이 좋습니다. 젖꼭지 부착 영역과 림프절도 유용한 형태 학적 지표로 사용되어야합니다. 글 랜드도 펼쳐져 있고 스트레칭되어야합니다.평평한 표면 ( 예 : 유리 슬라이드, 카드지 또는 천)을 가로 질러 붙어서 조...

mammary whole mountis는 정상적이고 화학적으로 유도 된 비정상적인 발달을 이해하기 위해 많은 쥐와 마우스 연구에서 구현 된 유용하고 저렴한 방법입니다. 일반적으로 설치류 개발 단계 ( 예 : 사춘기, 사춘기, 중기 - 후기 및 출생기)에 여러 단계로 수집 된 유선은 우상, 내분비 및자가 분비 인자에 의해 영향을받는 조직 및 세포 구조의 형태 학적 변화를 보여줍니다 1 . 노화 된 쥐에서, 선의 상피 및 간질 부분이 점차적으로 밀도가 높아져서 전체적인 형태로 형태 학적 매개 변수를 측정하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 미시적 수준의 변화를 확인하기 위해 조직 학적 평가를 위해 림프를 수집하는 것이 일반적입니다. 두 공정 모두 화학적 노출 ( 즉, 환경 적 또는 약학 적)과 관련된 연구 또는 유전 적 변화에 따른 형태 학적 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다ations. 위험 평가에서 유선을 사용하기위한 기술과 기능은 계속 진화하고 있습니다. 전체 장착 준비가 일상적이고 표준화되어있는 반면, 절편 수정은 2 , 3 단계로 이어 집니다. 일부 실험실은 아직 피부 사를 통해 크로스 컷 섹션을 사용하는 동안 다양한 배경 (즉, 학계, 정부 및 업계)에서 많은 연구 그룹은, 바람직한 방법으로 유방 조직의 종 방향 / 코로나 섹션을 채택했다. 후자의 방법은 관심있는 조직 (유선 상피 2 )보다는 표피 (피부)를 과도하게 표현합니다. 코로나 또는 종단면 인해 증가 된 표면적 및 본 구조물의 개수 이상 병변의 검출을 향상 크게 정상 조직 5 특징과 더 유용하다. 전반적으로 이것은 전체 mo를 만듭니다.유선의 비교 조직 병리학 적 평가를위한 적절한 방법 1 , 2 . 사타구니 동맥 번째 마우스 또는 래트, 검색하고, 4 번째 및 5의 보존을 사용하는 것은 매우 전체 비교 추천 여부 반대측 H &amp; E 부분에 장착. H &amp; E 섹션과 전체 마운트는 환경 노출로 인한 세포 및 형태 학적 변화에 대한 정확한 설명을 제공합니다. 이는 모델이 종양 형성에 대한 감수성이 낮거나 종양이 현저하게 보이지 않는 특정 설치류 계통에서 특히 그러하다. 경우에 따라 두 가지 기술 ( 즉, 부족한 조직의 양, 자원 또는 예기치 않은 실험 결과)을 사용하여 필요한 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않을 수도 있습니다. 우리의 경우, 유방 전체에서 이상이 관찰되었지만, 조직 병증대 측성 H &amp; E 글 랜드의 논리적 발견은 대체로 정상적이었다. 반대쪽 샘 사이의 압도적 인 불일치로 인해 우리는 전체 산에서 이상을 확인하는 경제적이며 효율적인 절차를 개발하게되었습니다. 변형 된 가공 및 삽입 절차를 사용하여 고품질의 H &amp; E로 염색 된 섹션을 파라핀 내장형 마운트에서 준비했습니다. 우리는이 프로토콜이 화학 물질 노출 효과를위한 강력한 탐지 도구가되어 실험실 간 비교를 향상시킬 수 있다고 생각합니다.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>마운팅 미디어는 전체 마운트 및 H&를 커버슬립합니다. E 섹션</td></tr><tr><td>Leica 자동화 프로세서</td><td>Leica Biosystems</td><td>모델 # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S 자동 마이크로톰</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>정전기 충전</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>커버슬립</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES 자동 슬라이드 염색기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>액체 접착제; 수조에서 사용됨</td></tr><tr><td>Modified Harris Hematoxylin 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific의 일부)</td> <td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>리튬 카보네이트</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>열 Fisher Scientific</td><td>A38-500</td>은 <td>Carnoy의 고정액</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td>에 <td>필요함 Carnoy의 고정액</td></tr><tr><td>100% 에탄올</td>에 필요한 <td>Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>Carnoy의 고정액 및 세척 슬라이드에 필요</td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 황산칼륨 수화물, 시그마 울트라</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>자동화 세척 버퍼, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

정상적인 유선 분비는 환경 독성 물질 및 의약품에 노출되거나 호르몬에 과도하게 노출되거나 유전 적 변형이 일어날 수 있습니다. 유선 전체 마운트는 노출 후에 발생할 수있는 형태 학적 변화의 진행을 포착하기위한 저렴한 방법입니다. 그러나 비정상 성이 더 많이 발생하기 시작하는 나중의 삶에서,이 한 가지 방법에 대한 단독 신뢰가 항상 이상의 적절한 진단을 내리기에 충분한 정보를 제공하지 못할 수도 있습니다. 역사적으로, 화학 테스트 가이드 라인 연구에서 단일 유선이 부검시 제거되고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)으로 염색 된 섹션으로 준비됩니다. 반대쪽 유방 전체 수집 및 분석의 통합은 위음성 평가의 가능성을 줄입니다. 전체 마운트의 평가는 슬라이드에 하나 또는 두 개의 전체 유선이 존재하는 경우에 제한적이며 경우에 따라 전체 마운트에서 관찰 된 이상은 없습니다.t는 H &amp; E 섹션에서 균일하게 표현됩니다. 이 연구의 목표는 달리 덮어 버렸거나 진단하기 어려운 병변을 식별 할 수 있도록 coverslpped mammary 전체 마운트를 H &amp; E로 염색 된 절편으로 변환하기위한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 여기서는 처음에 전체 마운트로 준비된 유선으로부터 고품질의 파라핀이 포함 된 H &amp; E 섹션을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. H &amp; E 절단을 위해 의도적으로 준비된 조직과 비교하여, 전체 마운트는 조직 제거 및 처리를위한 추가 준비를 필요로합니다. 그러나이 방법은 일반적인 실험용 시약과 약간의 추가 시간이 필요하기 때문에 값이 싸다. 결과적으로,이 방법은 화학적 및 환경 적 노출로 인해 정상적인 유방 발달을 어떻게 변화시키고 유전 적 변형으로 인해 발생하는 변화를 디스플레이하는지에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.

이 방법은 유방 패드의 원래 대 측성 H &amp; E 섹션에 조직 학적 변화가 나타나지 않으면 놓치기 쉬운 진단을 돕는 데 효과적입니다. 그러나 결과는 조직 학적 평가를위한 조직 준비 과정뿐만 아니라 초기 전체 마운트 준비 과정에서주의를 기울이는 경우에만 유용합니다. 파라핀 삽입은 보호를 제공하고 장래의 절개를 위해 조직을 보존하는 데 도움이됩니다. 유방 조직의 이상적인 두께를 결정하기 위해 4 μm 및 6 μm 단면을 준비했습니다. 우리는 마이크로톰에서 ± 1μm의 오차 범위보다 큰 깊이를 시험했다. 6 μm 두께의 섹션 ( 그림 1A )은 컴팩트 한 셀로 매우 밀집되어있었습니다. 전반적으로, 슬라이드에는 적절한 식별 정보를 작성하는 데 필요한 개별적인 세포 세부 정보가 부족했습니다.ication. 최적의 두께는 4 μm ( ...

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

본 절차의 전반적인 목표는 전체 마운트된 생쥐 유선 조직으로부터 고품질의 염색 절편을 제작하여 미세 수준에서 병변을 식별하는 것입니다. 이 방법은 유선 전체 마운트 시 육안으로 식별된 병변 유형의 조직병리학적 확인과 같이 유선 평가와 관련된 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전체 마운트 조직을 사용함으로써 유선 내에 존재할 수 있는 병변을 식별할 가능성을 높인다는 점입니다.우리는 동일한 동물에서 얻은 전장 표본(whole mount)의 표현형을 포르말린 고정 후 H & E 염색을 거친 대측 선(contralateral glands)의 조직병리 보고서와 비교했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 진단 결과에 차이가 있었으며, 전장 표본에서 더 많은 병변이 확인되었습니다. 전장 표본의 제거 및 임베딩 단계가 이 절차의 성공에 결정적이므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 중요합니다.이 샘은 성질이 얇고 부서지기 쉬워 매우 섬세합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 전장 장착(whole mount) 기억 샘플을 준비하고 조직의 이상 여부를 분석한 후, 자일렌(xylene)이 채워진 유리 염색병에 슬라이드를 담가 커버 슬립과 마운팅 매질을 제거하십시오. 하룻밤 또는 그 이상 동안 배양하십시오.슬라이드를 신선한 xylene으로 옮기고 샘플을 6시간 동안 담가 둡니다. 그런 다음 샘플을 다시 신선한 xylene으로 옮겨 하룻밤 동안 담가 둡니다. 다음으로, 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 잡고 핀셋을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 한 조각으로 제거합니다.마운팅 매질의 두께와 전체 마운트 후 커버슬립을 덮은 시점에 따라 커버슬립 제거의 용이성에 차이가 있을 수 있습니다. 따라서 커버슬립이 쉽게 분리될 때까지 슬라이드를 자일렌(xylene)에 계속 담가두는 것이 필수적입니다. 커버슬립을 제거한 후에는 날카로운 일회용 면도날을 사용하여 슬라이드를 따라 한 번의 동작으로 밀어내어 샘플을 제거하십시오.그런 다음 조직이 공기 중에 건조되지 않도록 메모리 패드를 자일렌이 채워진 유리 페트리 접시에 빠르게 담급니다. 면도날을 사용하여 크기가 큰 조직을 반으로 자릅니다. 그 후 조직 손상을 최소화하기 위해 뭉툭한 코와 톱니 모양의 팁이 있는 포셉을 사용하여 지방 패드의 가장자리를 잡고, 조직 크기에 맞는 두 개의 별도 라벨이 부착된 카세트에 절단된 조각들을 오른쪽 면이 위로 오도록 넣습니다.카세트를 조직 처리기에 넣기 전, 최대 2시간 동안 자일렌이 담긴 용기에 보관하십시오. 그 다음, 최대 개수의 카세트를 조직 처리기에 수동으로 넣으십시오. 시작하기 전에, 조직 처리기의 조직 처리 프로그램을 설정하십시오.절차를 자동화하려면 스테이션, 온도 및 진공 On/Off 설정을 선택하십시오. 프로세서를 자동화하여 카세트를 37 °C에서 30분 동안 자일렌에 담근 후, 동일한 조건에서 신선한 자일렌에 다시 한 번 담그도록 설정합니다. 그런 다음, 프로세서를 자동화하여 카세트를 자일렌 용액에서 꺼내 60 °C로 설정된 자일렌과 용융 파라핀의 1:1 혼합액이 들어 있는 프로세서 내 챔버로 조직을 옮겨 30분 동안 처리하십시오.모든 단계가 완료되면, 확인 또는 시작을 선택하여 진행하십시오. 카세트를 몰드에 넣을 준비가 될 때까지 58 °C 파라핀 배스의 보관 탱크에 두십시오. 카세트 덮개를 제거하여 조직에 가장 적합한 몰드 크기를 결정하십시오.주입구에서 몰드(mold)로 녹은 파라핀을 3~4mm 높이로 붓고, 유전 슬라이드 바닥 및 카세트 바닥에 인접했던 유선 전체 마운트(mammary whole mount) 표면이 몰드 위쪽을 향하도록 조직의 방향을 잡습니다. 몰드를 냉각판으로 옮기고, 조직이 몰드 바닥과 평행하도록 빠르게 조정합니다. 핀셋을 사용하여 라벨이 부착된 카세트를 몰드 위에 단단히 놓습니다.카세트 전체를 덮을 수 있도록 녹은 파라핀을 몰드에 계속 부어줍니다. 섹셔닝(sectioning)을 위해 선택한 정확한 위치에서 고정이 촉진되도록 몰드를 가열판에서 냉각판으로 옮깁니다. 파라핀 블록이 완전히 응고되면 몰드에서 블록을 분리합니다.그리고 절편 제작 전까지 실온에서 보관하십시오. 절편 제작 전, 파라핀 블록을 -20 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 신선한 증류수가 담긴 워터배스를 켜고 온도를 42 ~ 45 °C로 조절하여 마이크로톰을 준비하십시오.다음으로, 새로운 저프로파일 칼날을 마이크로톰에 장착하고 4 µm로 설정합니다. 왁스 면이 칼날을 향하도록 하고 수직 평면에 맞춰 블록을 마이크로톰에 삽입합니다. 그런 다음 거즈 패드의 일부를 찬물에 적셔 블록 위에 몇 분 동안 올려둡니다.블록의 전체 면이나 대표적인 단면이 얻어질 때까지 거친 이송 휠(course advanced wheel)과 함께 대형 휠을 시계 방향으로 돌려 블록을 절편하십시오. 그 다음, 깨끗한 슬라이드로 집어 올리기 전에 조직 절편을 손으로 따뜻한 워터배스(water bath)로 옮기십시오. 슬라이드를 건조대에 놓아 과잉 수분을 제거하십시오.그 후 조직 절편을 37 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 37 °C 인큐베이터에서 슬라이드를 꺼낸 후, 염색 준비가 될 때까지 상온에서 보관하십시오. 자동 염색의 경우, 메인 메뉴의 염색 옵션에서 H and E를 선택하여 슬라이드를 염색하십시오.탈파라핀, 염색 및 탈수 과정은 모두 자동 염색기에서 수행합니다. 마운팅 용액과 커버글라스를 사용하여 절편을 봉입합니다. 유선 조직의 최적 두께를 결정하기 위해 4 µm 및 6 µm 두께의 절편을 제작하였습니다.4 µm 두께의 절편에서 상피 및 기질 영역과 그에 해당하는 세포 유형을 쉽게 구별할 수 있어 최적의 결과를 얻었습니다. 이 사진들은 정상 선 조직의 조직학적 절편을 나타냅니다. 두 선 조직 모두 견고하고 균일한 지방세포 풍부 집단으로 둘러싸인 도관 구조를 보여줍니다.각 관은 단층 입방 상피 세포로 둘러싸여 있으며, 두 번째 층인 기저 세포에 의해 유지됩니다. 반대측 전체 표본에서는 유선관을 포함하는 불투명도가 증가한 영역이 관찰되었습니다. 하지만, 이러한 불투명함이 증식성, 염증성 또는 신생물성 변화로 인한 것인지는 불분명했습니다.대측 전체 마운트 표본이 여기에 제시되어 있습니다. 이 절편들은 유선 절편 내의 큰 혈관 주변에 림프구가 증가한 것을 통해 혈관주위 염증으로 진단되었습니다. 이 시료들에서 유선의 소엽 구조는 유지되었으나, 소엽 포상 과형성으로 인해 정상 폐포와 관의 수와 크기가 증가하여 확장된 상태였습니다.확장된 소엽에는 단백성 액체가 포함된 루멘을 형성하는, 잘 분화되고 종종 공포화된 상피 세포로 둘러싸인 폐포와 도관의 수가 증가되어 있었습니다. 이 절차를 수행할 때, 조직이 자일렌으로 인해 취약해져 쉽게 파손되어 샘플이 손상될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법을 시도하기 전에 플랫베드 스캐너를 사용하여 전체 마운트의 고화질 사진을 촬영하는 것이 권장됩니다.이는 독성 병리학 분야가 화학물질 스크리닝을 위한 전체 마운트 평가(whole mount evaluation) 방향으로 나아갈 수 있는 기회입니다. 따라서 해당 단계에서 병변이 확인되면, 이제 조직 병리학적 진단을 위해 고품질의 절편을 제작할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 병변 확인을 위해 유선 전체 마운트를 적출, 포매 및 절편 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.자일렌을 사용할 때는 실험복과 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 하며, 모든 작업은 후드 내에서 수행해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

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JoVE Journal

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