생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

3D 인간 iPSC 혈청이 없는 배아체에 대한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 신약 개발에 사용할 수 있는 인간의 초기 피질 발달에 근접한 체외 시스템을 제공하는 것입니다. 이 방법은 뉴런이 iPSC에서 파생되어 3D 조직에서 기능적 네트워크를 형성하는 방법과 같은 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 질병에 걸린 개인의 유전학을 포함하는 인체 조직에서 접시의 피질 발달 측면을 모델링할 수 있다는 것이므로 이 시스템은 확장 가능하고 다양한 신경 생물학적 장애를 연구하는 데 사용할 수 있는 약물 스크리닝을 위한 세포 기반 플랫폼 역할을 합니다.

이 방법은 신경 생물학적 또는 신경 발달 장애에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 신경 면역 기능 또는 신경 정보 모델에 초점을 맞춘 시스템과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 태아 세포를 확립하는 것으로 시작합니다. 이 배양을 확립하기 위해, 600, 000 개의 태아 세포를 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 플레이트하고 웰 당 300 밀리리터의 배지를 넣으십시오.

태아 세포를 48시간 동안 배양한 후 배지를 교체합니다. 줄기 세포를 준비하는 동안 한 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 섭씨 37도의 수조에서 줄기세포를 해동합니다.

해동되면 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 배양 배지로 5 밀리리터로 채우고 드롭 현명하게 추가합니다. 다음으로, 세포를 4분 동안 부드럽게 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, ROCK 억제제가 포함된 1ml의 줄기세포 배지에 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 세포 밀도를 정량화한 후, 300, 000개의 줄기세포를 공급세포에 플레이트합니다.

그런 다음 배양물을 성장시키고 확장하며, 백업을 위해 세포를 확장 및 동결한 후 건강한 세포를 주기적으로 선택합니다. 줄기 세포 군락이 50%에서 70% 합류점에 도달할 때까지 표준 플레이트에서 성장시킵니다. 그런 다음 약한 효소 처리와 1ml 피펫 팁으로 부드러운 분쇄를 사용하여 신경 전구 세포 분화를 위한 hiPSC를 채취합니다.

현탁액을 부드럽게 원심분리하고 상등액을 흡인하고 펠릿을 5밀리리터 인간 iPSC 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 0.1% 젤라틴으로 코팅된 5cm 세포 배양 접시에 옮기고 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 비부착성 세포를 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 3ml의 매체로 플레이트를 부드럽게 헹구고 동일한 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 온화한 원심분리를 가진 재 현탁액 단계를 반복하고, 그 후에, 세포 조밀도를 결정하고 96 우물, 9에 낮은 접착 V 바닥 판으로, 우물 당 000의 세포로 세포를 도금하십시오. 이제 플레이트를 3분 동안 돌리고 세포 배양을 시작합니다.

향후 14일 동안 격일로 배지 절반을 새로운 차별화 배지로 교체합니다. 세포를 배양한 지 2주 후, 40미크론 세포 배양 삽입물과 1밀리리터의 DM1 배지가 있는 6개의 웰 플레이트를 준비합니다. 배양된 세포를 추가하기 전에 이 플레이트를 최소 4시간 동안 배양합니다.

다음으로, 200마이크로리터 너비의 입 피펫 팁을 사용하여 약 20마이크로리터의 배지 상당의 2주 된 세포 응집체를 수집합니다. 최소 용액으로 4-6개의 응집체를 각 삽입물에 옮기고 초과분을 제거합니다. 이 단계에서는 SFEB 주변에서 매체를 제거하는 동안 표면 장력으로 인해 SFEB가 솔루션을 가로질러 이동하는 것을 볼 수 있는 동안 빠르고 안정적인 손으로 작업하는 것이 중요합니다.

매체를 제거한 후 위치를 변경해도 됩니다. 모든 응집체가 삽입물에 로드되면 배지를 1ml의 DM2로 변경하고 격일로 세포 배양을 계속합니다. 배지의 4분의 3을 새 배지로 교체하십시오.

배양 14일 후 배양에 DM3 배지를 추가하기 시작합니다. SFEB를 성장시키기 위해 16일 더 배양을 계속합니다. 이제 200마이크로리터 너비의 입 피펫 팁을 사용하여 인서트에서 SFEB를 부드럽게 분리합니다.

SFEB를 12개의 웰 플레이트로 옮기고 웰당 4-8개를 로드합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 개요로 염색합니다. 12개의 우물과 8개의 플레이트를 준비하려면 먼저 멸균수로 세 번 씻습니다.

그런 다음 75% 에탄올을 사용하여 한 번 씻고 100% 에탄올로 한 번 더 씻으십시오. 그런 다음 섭씨 50도에서 4-5시간 동안 접시를 거꾸로 굽고 살균 과정을 완료합니다. 베이킹 후 각 웰에 500마이크로리터의 0.2% PEI 용액을 넣고 플레이트를 한 시간 동안 실온에 둡니다.

그런 다음 PEI를 흡인하고 멸균 증류수로 우물을 4번 세척하고 밤새 자연 건조시킵니다. 다음날, L15 매체에 새로운 라미넌트를 준비하고 각 웰의 중앙에 10 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 증발을 방지하기 위해 주변 저장통에 증류수를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.

전극 중앙에 라미넌트를 빔하도록 하고 접지 전극의 공간을 초과하지 않도록 주의하며, 이 공간을 초과하면 접지 전극 위로 뉴런이 성장하여 노이즈 아티팩트가 발생하고 녹음의 충실도에 영향을 미칩니다. 이제 넓은 구멍 피펫으로 부드러운 흡입을 사용하여 준비된 SFEB를 각 웰에 하나씩 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 DM2를 추가하고 플레이트를 밤새 배양합니다.

나중에 신경 활동을 기록하려면 플레이트 리더에 플레이트를 넣으십시오. 섭씨 37도로 예열합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 각 우물에서 10분 동안의 활동을 기록합니다.

SFEB는 설명된 방법을 사용하여 성장하며, 광범위한 Tuj1 양성 뉴런과 신경 전구 세포로 가득 찬 조기 발달 피질 뇌실 하부 영역과 유사한 형태학적 특성을 가진 조직을 생성합니다. 수많은 발달 피질 장미가 신체의 바깥 층과 안쪽 층에서 관찰되었습니다. 신체의 바깥쪽 가장자리는 유사분열 후 뉴런을 포함하는 발달 중인 피질 플레이트와 유사하며, 이는 신경 전구 세포와 가장 복식화된 외부 피질층을 나타내는 마커인 Brn2의 발현에 의해 뒷받침됩니다.

바깥 층에는 또한 우연한 그라첼 세포 또는 그 전구 일 수있는 Reelin 양성 세포가 포함되어 있습니다. 이 기관들은 또한 혼합된 코달 및 내측 신경절 고유성 기원과 일치하는 마커를 표현했습니다. 쿠킹된 TF2 및 Nkx2.1 마커의 표현을 기반으로 합니다.

배양된 SFEB는 CalR 및 CalB 양성 인터 뉴런 모두에서 수율을 산출합니다. 뿐만 아니라 VGLUT 양성 흥분성 뉴런 및 Tbr1 양성 글루타메이트성 신경 전구세포도 있습니다. 다른 보고와 일치하게, 시신에서 채취한 세포의 61%는 VGLUT 양성이었고 43%는 Tbr1 양성이었다.

시체에서 만든 MEM 기록은 장기간 촬영할 수 있으며 기록은 피질 네트워크 수준 파열의 발달을 보여주었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 iPSC에서 SFEB를 성장시키는 방법, NSFEB가 있는 징벌적 발달 피질 로제트의 뉴럴라 함량을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 성숙한 SFEB에 대한 신경 생리학적 분석을 수행합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 iPSC와 iPSC가 배양 뉴런에 도달하는 데 필요한 과학 분야를 개발하는 데 시간과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 배양된 세포는 매일 모니터링해야 합니다. 이 절차에 따라 약물 치료가 피질 네트워크 진동에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.