Name: 생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 hiPSC에서 혈청 무 세포 배아체(SFEB)를 배양하여 3D 인간 대뇌 피질 발달을 모델링하는 방법입니다. 이 기술은 신경생물학 장애 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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기사를 교정 해 주신 Elizabeth Benevides에게 감사드립니다. 우리는 Drs. John Hussman과 Gene Blatt가 도움이되는 토론과 의견을 전했습니다.

1. 신경 전구 세포의 생성 <ol><li> 저분자가 보충 된 인간 iPSC 배지에서 γ- 조사 마우스 배아 피더 (MEF) 세포층상의 6 웰 플레이트에서 섬유 아세포 및 PBMC로부터 유래 된 hiPSC를 유지한다 (물질 표 참조). 참고 : 매일 유지 보수는 이전에보고 절차 (1), (16)의 수정 된 버전입니다. <ol><li> 플레이트 300 μL / 잘 권장 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)에 6 잘 조직 문화 등급 플레이트의 각 우물에 플레이트 6 X 10 5 MEFs. </li><li> 48 시간 후, hiPSCs를 첨가하기 전에 MEFs 배지를 300μL / 웰 hiPSC 배지로 1 시간 동안 대체한다. </li><li> 37 ° C 수조에서 hiPSC를 빠르게 녹이고 천천히 1 mL의 hiPSC 배지를 적가한다. hiPSCs와 매체를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다. 총 부피가 5 mL가되도록 매체를 넣으십시오. 129 X에서 4 분 동안 원심 분리기, supernata을 대기음1 : 1,000 농도에서 ROCK 억제제가있는 1 mL hiPSC 배지에서 펠렛을 부드럽게 재현 탁하십시오. </li><li> 플레이트를 세포 현탁액 (일반적으로 300,000 세포 / 잘시) MEF 세포 레이어와 37 ° C, 5 % CO 2 , 95 %의 습도에서 품어. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 iPSC 배양을 면밀히 모니터링하십시오. 48 시간 후, 가장자리가 고르지 않은 배양 물을 제거하고, 광학 현미경 하에서 낭성과 같은 형태 또는 황갈색의 형태로 자라서 자발적 분화를 최소화한다. 참고 : 7-10 일 후, hiPSC 콜로니가 형성되어야합니다. 식민지는 경계가 명확하고 세포 밀도가 균일해야하며 둥근 모양이어야하며 느슨하게 포장 된 불균일 한 세포가 없어야합니다. </li><li> 자발적으로 분화 된 세포의 문화를 취소 라운드 hiPSC의 식민지를 수동으로 선택합니다. 새 MEF 층에 식민지를 놓습니다. 콩쿠리 근처에있는 배양액이 얼어 붙을 때마다 1 : 3 간격으로 펼쳐보십시오 ( 1 , 16) . </li></ol></li><li> 확장 및 냉동 세포 (백업을위한) 후 50-75 % 합류에 도달 할 때까지 플레이트에 hiPSC 식민지를 자랍니다. </li><li> 7 일 후 도금 후, 신경 전구 세포 분화를위한 hiPSCs를 수확하고 준비하기 위해 온화한 효소 처리 (효소 용액 300 μL로 5-10 분) 및 부드러운 분쇄 (1,000 μL 피펫으로 2-4 회)를 사용하십시오. </li><li> 세포 현탁액을 129 xg에서 4 분간 원심 분리하고, 상층 액을 흡인하고, 5 mL 인간 iPSC 배지에서 펠렛을 재현 탁한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 코팅 5cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 옮기고 MEFs를 제거하고 hiPSC 수율을 최대화합니다. 다른 5cm 젤라틴 코팅 접시로 매체 (비 부착 세포)를 전송하십시오. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 15 ML 원심 분리기 튜브에 비 접착 세포를 전송합니다. 부드럽게 3 ML 매체와 플레이트를 씻어 15 ML 튜브에 추가하십시오. </li><li> 4 분 동안 129 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기, 대기음을 대기음원심 분리하고 부드럽게 매체에 펠렛을 resuspend. 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하십시오. 96- 웰 저 밀착 V- 바닥 플레이트에 9,000 세포 / 웰 플레이트. </li><li> 플레이트를 163 xg에서 3 분간 원심 분리하십시오. 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 플레이트를 품어. 피펫을 사용하여 배지의 절반을 제거하고이를 화학적으로 정의 된 새로운 분화 배지 1 (DM1; Figure 1 ; Table of Materials) 로 14 일 동안 대체하여 매일 50 % 배지를 교환하십시오. </li></ol> 2. 무 혈청 배아 체 (SFEB) 유도 ( 그림 2 ) <ol><li> 6 잘 접시에 삽입 40 μm의 세포 배양 삽입 및 집계의 추가 적어도 1 시간 전에 1 ML DM1 매체를 추가합니다. </li><li> 14 일째, 40 μm의 세포 배양 삽입물에 200 μL 넓은 입 끝을 사용하여 20 μL 배지로 응집체를 옮기고 배지를 DM2로 바꿉니다. <br/&gt; 참고 : 세포 배양 삽입물은 우물 바닥에서 약간 떨어져서 플라스틱 프레임을 가로 질러 매달려있는 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 막으로 구성되어 있습니다. 이 멤브레인은 생체 적합성을 지니고 있으며 상단에 놓인 SFEB로 영양분과 산소 전달을 효율적으로 유지할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 마우스 또는 쥐 7 , 17 , 18 에서 촬영 organotypic hippocampal 슬라이스 문화와 함께 사용됩니다. <ol><li> 하나의 세포 배양 삽입물에 4-6 개의 응집체를 옮기고 응집체 사이에 충분한 공간을 확보하십시오. 미세 피펫 팁 ( 예 : 200 μL 팁)을 사용하여 최대한 많은 과량의 용액을 제거하십시오. 참고 : SFEB 주위에서 제거 된 용액으로 세포 배양 삽입물을 움직일 때 SFEB를 잠시 방해하는 것은 허용됩니다. </li><li> 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 DM2 1 ML에서 문화를 유지. 피펫을 사용하여 75 %매체의 3/4을 제거하고 4 분의 3의 새로운 매체로 교체하여 격일로 배지. 예를 들어, 750 μL의 배지를 제거하고 750 μL의 새로운 배지를 첨가하십시오. </li></ol></li><li> 문화의 14 일 후, 다른 하루와 다른 16 일 동안 75 % 매체 변화와 DM3 매체로 전환합니다. </li><li> 30 일이 넘는 세포 배양 삽입물에 SFEB를 유지하려면 60, 90 및 120 일 동안 배지를 매일 교체하십시오. 참고 : SFEB는 직경이 약 1,000 μm까지 성장하며 일반적으로 100-150 μm 두께입니다 1 . </li></ol> 3. SFEB 구성 결정 <ol><li> 200 μL 와이드 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매체를 pipetting하여 삽입에서 SFEBs를 분리하십시오. SFEB를 옮기려면 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 몸체를 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하십시오. SFEB를 pipet tip에 넣은 후 부드럽게 12-well plates에 옮기고 300μL phosphate buffered saline(PBS)로 1 웰당. 참고 : SFEB는 12- 웰 플레이트에서 용액으로 현탁 될 것이다. 고정액, 블로킹 용액 및 항체를 완전히 침투시키는 것이 중요합니다. 얼룩을지게하기 위해 여러 개의 SFEB를 사용하는 경우, 12 개의 웰 플레이트에 최대 10 개의 SFEB를 추가 할 수 있습니다. 이렇게하면 용액과 항체가 보존됩니다. </li><li> 30 ~ 45 분 동안 상온에서 4 % 파라 포름 알데히드 당 300 μL로 SFEB를 고정시킨다. 300μL PBS로 고정 SFEB를 두 번 씻고 3-5 분마다 씻으십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 참고 : 표 2 참조 1, 16를 참조하십시오 추가 마커, 500 : 닭 Tuj1 1에서 사용 된이 연구에서 신경 세포를 마킹 성숙, 세포 유형 등을 결정하기 위해 마커로 면역 반응에 대한 조사. </li><li> 0.1 % Triton-X100 (PBS 및 10 % 정상적인 당나라 세럼) (blocking solution; 300 μL)로 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다. </li><li> 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1 차 항체 300 μL로 SFEB를 처리하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 0.1 % 트리톤 X를 함유 한 300 μL PBS로 SFEB를 세 번 세척 (3-5 분 / 세척)하십시오. </li><li> 2 차 항체를 블로킹 용액에 1 : 1000으로 준비한다. 2 차 항체와 실온에서 1 시간 SFEBs를 품어. SFEB를 300 μL PBS로 3 ~ 5 분씩 각각 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 SFEB는 이미징을 준비 할 수 있습니다. </li><li> 이미지하려면, 와이드 보어 피펫을 사용하여 슬라이드 슬라이드에 피펫 SFEBs. 부드러운 흡입을 사용하여 SFEB 주변의 과도한 용액을 제거하십시오. 참고 : 유사한 염색 조건의 경우 여러 SFEB를 동일한 유리 슬라이드에 둘 수 있습니다. </li><li> SFEB에 장착 매체 한 방울을 넣고 유리 커버 슬립을 놓고 가볍게 눌러 기포가 없는지 확인하십시오. 장착 매체를 굳히고 이미징 및 부량 화 (단계 3.8)로 진행하십시오. <br/&gt; 참고 : 장착 매체가 단단 해지면 SFEB를 이미징 할 수 있습니다. </li><li> 표준 공 촛점 현미경 (standard confocal microscope)에서 각 ROI를 통해 최대 투영 이미지와 결합 된 z- 스택을 사용하여 SFEB에서 여러 관심 영역 (ROI)을 가져 와서 참고 1 , 16에 설명 된대로 세포 정량화를 수행하십시오. 참고 : 전체 SFEB는 이미지 기반 타일링을 사용하여 정량화 할 수 있습니다 (자세한 내용은 참조 1 , 16 참조). SFEB가 약 100 μm로 얇기 때문에 조직에 빛의 산란이 최소화되므로 2- 광자 현미경 검사가 필요하지 않습니다. 섬유 아세포 유래 iPSCs 프로토콜이 이전 사용은 CGE 및 전방 전뇌 운명 1 16 닮은 전사 정체성의 interneurons의 개체군과 복잡하고 다양한 구조를 드러냈다 SFEB 운명 맵을 생성. </sup&gt; </li></ol> 4. MEAs를 사용하여 SFEBs의 연결 활동을 기록 <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 12 잘 MEA 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 2 O 깨끗하게 멸균 H 5 분간 MEA 플레이트를 3 회 반복한다. 75 % 에탄올로 5 분간 씻은 다음 100 % 에탄올로 세척하여 플레이트를 멸균하십시오. </li><li> 50 ° C에서 4 ~ 5 시간 동안 오븐에서 접시를 거꾸로 굽혀 살균 과정을 완료하십시오. </li><li> 각 우물에 500 μL 0.2 % polyethyleneimine 솔루션 (PEI)을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. PEI를 대기음으로 멸균 증류수 H 2 O로 4 번 씻으십시오. </li><li> L15 배지에 laminin 20 μL / ML 솔루션을 준비하고 각 우물의 중심에 10 μL laminin를 추가합니다. 참고 : 주변 참조 및 접지 전극을 코팅하지 마십시오. </li><li> 매체 또는 라미닌 증발을 방지하기 위해 주변 저수지에 멸균 dH 2 O를 추가하십시오.37 ° C에서 1 시간 동안 플레이트를 품어 라. </li><li> 부드럽게 그들을 넓은 입 피펫 팁으로 흡입하여 그들을 전송하여 laminin 코팅 MEA 플레이트에 SFEBs (섹션 1 및 2 참조)를 추가하고 그들을 전송합니다. 각 우물에 200 μL DM2 매체를 추가하고 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 밤새 품어. </li><li> 24 시간 후에 추가로 200 μL 매체를 추가하고, 플레이트를 읽기 전에 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO 2에서 30 분 동안 회복 할 수있다. </li><li> MEA 플레이트를 플레이트 판독기 (37 ° C로 예열 됨)에 놓아서 연결 활동을 기록하십시오. 관련 MEA 레코딩 소프트웨어로 10 분 동안 활동을 기록하십시오. 자세한 내용은 참조 19 를 참조하십시오. </li><li> 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 - 연속 스트림 및 연결 활동의 래스터 도표를 생성합니다 19 . 참고 : MEA 녹음은 SFEB 도금 7 일 후 촬영됩니다. 이 연구에서는 네트워크 버스트 활동을 감지하기 위해 10 분 동안 녹화를 수행했으며,뾰족한 자취 및 래스터 플롯이 있습니다. SFEB는 MEA 플레이트에서 장기간 유지 될 수 있으며 환경 적으로 통제 된 조건을 사용하여 장기간에 걸쳐 기록 될 수 있습니다 ( 그림 6 ). </li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 hiPSC 소스를 정면 피질의 초기 발달 단계를 반복하는 3 차원 구조로 차별화하기위한 조건을 제공합니다. 이 절차는 전기 생리학에 대해 조사 할 수있는 구조를 만들어내는 동시에 현미경 검사를 받아 들일 수 있습니다. SFEB의 최종 형태는 organotypic 두뇌 슬라이스 문화의 그것과 유사하고 고품질의 상세한 공 촛점 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 fibroblast 및 말초 혈액 mononuclear 세포 파생 hiPSCs에서 SFEBs를 성공적으로 생성 할 수 있습니다. 말초 혈액 단핵 세포 유래 hiPSC로 제조 된 SFEB는 섬유 아세포 유래 hiPSC로부터 생성 된 SFEB와 유사한 형태 학적 특성을 나타낸다. 이 과정은 다른 3-D 체계와 마찬가지로 소분자 세포 외 신호를 사용하여 세포 운명 결정을 유도합니다. 이것은 셀 - 셀 접촉의 본질적인 속성과 결합되어 더 현실적인 넷 환경을 만듭니다작업 형성과의 연결 기능. 다른보고에 ...

우리는 이전에 초기 대뇌 피질의 네트워크 개발 1의 일부 측면을 되풀이되었습니다 환자 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 생성 된 3-D 모델 시스템을보고했다. 혈청없는 배아 체 (SFEB) 인이 3-D 모델은 이전의 단순 응집 hiPSC 모델 2 , 3을 향상시킵니다. 우리의 SFEB와 같은 3D 구조가 2 차원 (2-D) / 단일 층 hiPSC 모델 4 , 5 에서 관찰 된 것보다 더 일찍 생체 내 에서 관찰 된 신경 발달의 대략적인 양상을 드러내고있다. 초기 연구는 생리 학적 복잡성을 입증하지 않고 3 차원 신체의 자기 조직화 복잡성에 초점을 두었습니다 2 . 여기에 설명 된 프로토콜은 섬유 아세포에서 유래 undifferentiated hiPSCs에 사용되었습니다<html> 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC). 이 세포는 γ 선발 마우스 배아 기 (MEFs)에서 유지됩니다. 이러한 hiPSC 콜로니를 자발적으로 분화 된 세포에서 수동으로 세척하고, 효소 적으로 수확하고, Rho 키나제 억제제 Y-27632 (ROCKi)를 함유하는 배지에 재현 탁한다. 미분화 hiPSC는 96 웰 저 접착 V 바닥 플레이트로 옮기기 전에 해리 및 원심 분리를 거친다. 도금 후, 앞쪽 전두엽의 뇌신경 - 운명 계통 6 을 구동하기 위해 이중 SMAD 억제 (dickkopf 1 (DKK-1)와 함께 SB431542 및 LDN193189)를 사용하여 신경 유도를 개시한다. 14 일 후, SFEB는 6- 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 옮겨진다. 전달 된 라운드 SFEBs는 유사한 세포 배양 삽입물 1 , 2 , 3을 사용하여 해마 기관 체적 슬라이스 배양 조제 물에서 종종 관찰되는 바와 같이 국부적 인 네트워크 연결을 유지하면서 퍼지고 얇아지기 시작한다 .ss = &quot;xref&quot;&gt; 7. 이 형식의 SFEB 기반 3-D 플랫폼의 사용은 단일 세포 기록 또는 다중 전극 배열 (MEA)과 같은 칼슘 이미징 또는 전기 생리 학적 분석과 같은 세포 기반 생리 학적 분석을 사용하여 조사 할 수있는 대뇌 피질 네트워크의 효율적 생산에 적합합니다 ) 1 . 3-D 시스템이 초기 피질 발달 지표를 지니고 있지만, 다른 연구들에 의하면 이러한 3-D 몸체는 본질적으로 인간 조직 발달 속도가 느려지도록 더 긴 배양 시간을 필요로 할 수 있습니다 8 . 이 SFEB 프로토콜은 피질의 초기 발달 양상을 파악하는 미분화 된 hiPSC로부터 3 차원 SFEB를 성공적으로 생성합니다. SFEB가 신경계 장애에서 네트워크 수차를 모델링 할 수있는 가능성은이 시스템의 강점입니다. 환자 조직으로부터 유래 된 hiPSCs는 엉덩이에 영향을받는 신경계의 세포로 성장할 수있다세포 생물학뿐만 아니라 수반되는 유전자 발현과 관련이있다. 인간 iPSCs은 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 정신 분열증 9 레트 증후군 (10), 및 알츠하이머 병 (11), (12) 복소 병인으로 신경계 장애를 변화와 개인의 큰 그룹의 유전 적 프로파일을 확인하기 위해 사용되고있다. 최근까지 iPSC 모델은 전형적으로 분자 상호 작용을 평가하는 데 능숙한 반면 생체 내에서 관찰 되는 복잡한 세포 상호 작용을 해독하는 데는 부적합한 단일 층 준비물이었습니다. 동물 모델은 전체 기관 플랫폼을 재생성하기위한 기본 대체품이었습니다. 이 동물 모델은 결과의 빈약 한 번역에 의해 괴롭혀지고, 대규모 유전 스크리닝 연구에 의해 확인 된 인간 유전 프로파일을 복제하는 능력이 제한되어있다. 따라서, iPSC로부터 3-D 시스템을 개발하면 인간에게 필요한 복잡성 계층이 추가됩니다질병 모델링 13 , 14 . 3D hiPSC 플랫폼 다음 단계는 세포 기반 분석법을 이용하여 스크리닝 15 처리량의 큰 규모의 요구 사항을 수용하기위한 것이다.

<table><tbody><tr><td>SFEB 신경 세포 분화 세포 배양 배지. 시약. 구성 요소&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 신경 유도 배지 (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>DM1 배지 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), 글루타맥스 액체, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5mL</td></tr><tr><td>글루타맥스 200mM</td><td>인비트로겐</td><td>35050061</td><td>5mL</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 10mM(100x), 액상</td><td>인비트로젠</td><td>11140050</td><td>5mL</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(1,000x), 액상</td><td>인비트로겐</td><td>21985023</td><td>900μ; L</td></tr><tr><td>Name</td><td>회사&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DM2 Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100개), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>DM3 배지 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL 배지(1x), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500mL</td></tr><tr><td>B-27 보충제에서 비타민 A(50개)를 뺀 보충제(50개), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10mL</td></tr><tr><td>글루타맥스 200mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>펜/연쇄상구균</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Small Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &mu; M)</td></tr><tr><td>도르소모르핀</td><td>줄기</td><td>04-0024</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Name</td><td>회사&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Recombinant Protiens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Components/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture inserts 0.4 &mu; M, 30mm 직경</td><td>밀리셀</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 V 바닥(뚜껑 포함)</td><td>상록수</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5 (핵 마커)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA 플레이트</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플랫 바텀</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>회사&nbsp; </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>칼레티닌</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>칼빈딘</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R& D 시스템</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 hipsc 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

많은 in vitro 질병 모델이 hiPSCs를 사용하여 개발되었지만, 한 가지 제한점은 이러한 2 차원 (2-D) 시스템이 의심되는 질병 변이를 가진 감염된 개인의 기본 세포질 및 기능적 복잡성을 나타내지 않을 수 있다는 것입니다. 기존의 2D 모델은 생체 내 유사 구조의 불완전한 표현으로 남아 있으며 뇌의 복잡성을 적절히 포착하지 못합니다. 따라서, 생체 내 시스템 에서 보이는 세포 상호 작용 및 기능을보다 잘 나타낼 수있는 3-D hiPSC- 기반 모델에 대한 필요성이 대두되고있다. 여기서는 무 혈청 배아 체 (SFEB)에 기초한 미분화 된 hiPSCs로부터 3-D 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고한다. 이 3-D 모델은 발달중인 신피질의 양상을 반영하고, 이동하는 신경 세포 및 이동성, 연결성, 통신 및 매트와 같은 손상되지 않은 조직에 필수적인 기능에 대한 연구를 허용합니다uration. 특히 우리는 우리의 프로토콜을 사용하는 SFEB가 칼슘 이미징과 같은 생리 학적으로 관련성이 높은 고농축 세포 기반 분석법 및 cryosectioning없는 다중 전극 배열 (MEA) 기록을 사용하여 조사 될 수 있음을 입증합니다. MEA 기록의 경우, 우리는 SFEB가 장기간 배양하는 동안 스파이크 활동과 네트워크 수준 파열 활동을 증가 시킨다는 것을 입증합니다. 이 SFEB 프로토콜은 초기 대뇌 피질 발달의 양상을 포착하는 3-D 모델에서 네트워크 형성을 개발하는 연구를위한 견고하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.

우리의 기술을 사용하여 성장한 SFEBs는 초기 Tuj1 양성 뉴런뿐만 아니라 신경 progenitors ( 그림 3A ) 가득한 초기 개발 피질 subventricular 영역을 닮은 형태학 특성과 조직을 굴복. SFEB ( 그림 3B )의 바깥 쪽 층과 내부 층에는 수 많은 발육 피질 로제가 관찰되었습니다. SFEB의 바깥 쪽 가장자리는 퇴행 후 뉴런을 포함하는 발달중인 피질 판과 유사합니다. 이것은 Brn2의 발현에 의해 뒷받침됩니다. Brn2는 대부분의 복근 외피층에서 신경 전구 세포의 마커입니다. 개발 피질의 바깥층에서 발현되는 Cajal-Retzius 세포 또는 그 전구 세포 인 Reelin 양성 세포도 SFEB에서 관찰됩니다 ( 그림 3C ). 이 프로토콜을 사용하여 성장한 SFEB는 혼합 꼬리 (...

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

3D 인간 iPSC 무혈청 배아체(embryoid bodies) 제작을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 약물 발견에 활용될 수 있는 인간 초기 피질 발달과 유사한 인비트로(in-vitro) 시스템을 제공하는 것입니다. 이 방법은 뉴런이 iPSC로부터 어떻게 유래하여 3D 조직 내에서 기능적 네트워크를 형성하는지와 같은 줄기세포 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 질환을 가진 개인의 유전 정보를 포함하는 인간 조직을 통해 배양 접시에서 피질 발달의 양상을 모델링할 수 있다는 점이며, 따라서 이 시스템은 확장 가능하고 다양한 신경생물학적 질환을 연구하는 데 사용할 수 있는 세포 기반의 약물 스크리닝 플랫폼 역할을 합니다.이 방법은 신경생물학적 또는 신경 발달 장애에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경면역 기능이나 신경 정보 모델에 집중하는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 먼저 태아 세포를 확립하십시오. 이 배양을 확립하려면 6-웰 플레이트의 각 웰에 300 milliliters의 배지와 함께 600, 000개의 태아 세포를 분주하십시오.태아 세포를 48시간 동안 배양한 후, 배지를 교체합니다. 줄기세포를 준비하는 동안 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 37 °C 항온 수조에서 줄기세포를 해동합니다.해동 후, 세포를 15 milliliter 원심 분리관(conical tube)으로 옮기고 배양액을 한 방울씩 떨어뜨려 5 milliliters까지 채웁니다. 다음으로, 세포를 4분 동안 조심스럽게 원심 분리하고, 상층액을 흡입하여 제거한 뒤 ROCK 억제제가 포함된 줄기세포 배지 1 milliliter로 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 세포 밀도를 정량한 후, 300,000개의 줄기세포를 피더 세포(feeder cells) 위에 플레이팅합니다.그 후 배양물을 성장 및 확장시키고, 주기적으로 건강한 세포를 선택하며, 확장 후 백업을 위해 세포를 동결합니다. 줄기세포 콜로니를 표준 플레이트에서 50%~70% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양합니다. 그런 다음, 가벼운 효소 처리와 1mL 피펫 팁을 이용한 부드러운 분쇄(trituration)를 통해 신경 전구세포 분화를 위한 hiPSC를 수확합니다.현탁액을 부드럽게 원심 분리하고, 상층액을 흡인한 후 펠릿을 5 mL의 인간 iPSC 배지에 다시 현탁합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 0.1% 젤라틴이 코팅된 5 cm 세포 배양 접시에 옮기고 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 부착되지 않은 세포를 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 플레이트를 3 mL의 배지로 가볍게 헹구고 동일한 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 가벼운 원심분리와 함께 재현탁 단계를 반복한 후, 세포 밀도를 측정하여 96-well 저부착 V-bottom 플레이트에 well당 9,000 cells의 밀도로 분주합니다. 이제 플레이트를 3분 동안 원심분리하고 세포 배양을 시작합니다.이후 14일 동안 이틀 간격으로 배지의 절반을 신선한 분화 배지 1(differentiating medium one)로 교체합니다. 세포를 2주 동안 배양한 후, 40 micron 세포 배양 인서트와 1 mL의 DM1 배지가 담긴 6웰 플레이트를 준비합니다. 배양된 세포를 추가하기 전, 이 플레이트들을 최소 4시간 동안 배양합니다.다음으로, 200 µL 광구 파이펫 팁을 사용하여 배지 약 20 µL 분량의 2주 된 세포 응집체를 수집합니다. 최소한의 용액과 함께 각각의 인서트에 4~6개의 응집체를 옮기고, 과잉분은 제거합니다. 이 단계에서는 신속하고 안정적인 손놀림으로 작업하는 것이 중요하며, SFEB 주변의 배지를 제거하는 동안 표면 장력으로 인해 SFEB가 용액 위에서 이동하는 것을 볼 수 있습니다.배지를 제거한 후 이들의 위치를 다시 조정해도 좋습니다. 모든 응집체를 인서트에 적재한 후, 배지를 1 mL의 DM2로 교체하고 격일로 세포 배양을 계속합니다. 배지의 4분의 3을 신선한 배지로 교체하십시오.14일간 배양한 후, 배양물에 DM3 배지를 추가하기 시작합니다. SFEB를 성장시키기 위해 16일 더 배양을 계속합니다. 이제 200 µL 와이드 마우스 피펫 팁을 사용하여 인서트에서 SFEB를 조심스럽게 분리합니다.SFEB을 12-웰 플레이트로 옮기며, 웰당 4~8개를 로딩합니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 염색합니다. 12-웰 및 8-웰 플레이트를 준비하려면, 먼저 멸균수로 3회 세척하십시오.그 다음, 75% ethanol로 한 번, 100% ethanol로 다시 한 번 세척합니다. 이어서 멸균 과정을 완료하기 위해 플레이트를 뒤집은 상태로 50 °C에서 4~5시간 동안 굽습니다. 베이킹 후, 각 웰에 0.2% PEI 용액 500 µL를 넣고 플레이트를 상온에서 1시간 동안 둡니다.그 후, PEI를 흡입하여 제거하고 멸균 증류수로 웰을 4회 세척한 다음, 하룻밤 동안 공기 건조합니다. 다음 날, L15 배지로 신선한 라미닌 용액을 준비하여 각 웰의 중앙에 10 µL씩 첨가합니다. 그런 다음, 증발을 방지하기 위해 주변 리저버에 증류수를 채우고 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.라미네이트를 전극 중앙에 배치하되, 접지 전극의 범위를 벗어나지 않도록 주의하십시오. 이 범위를 초과할 경우 뉴런이 접지 전극 위로 성장하여 노이즈 아티팩트가 발생하고 기록의 충실도에 영향을 줄 수 있습니다. 이제 광구 파이펫을 사용하여 부드럽게 흡입하여 준비된 SFEB를 각 웰에 하나씩 추가하십시오. 그런 다음, 각 웰에 200 µL의 DM2를 추가하고 플레이트를 하룻밤 동안 배양하십시오.이후 신경 활동을 기록하기 위해 플레이트를 플레이트 리더기에 넣습니다. 37 °C로 예열하십시오. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 활동을 10분 동안 기록합니다.SFEB은 기술된 방법을 사용하여 배양되었으며, 다수의 Tuj1 양성 뉴런과 신경 전구세포가 풍부하여 초기 발달 단계의 피질 하-뇌실 구역과 유사한 형태학적 특성을 가진 조직을 생성했습니다. 신체(bodies)의 외층과 내층에서 수많은 발달 중인 피질 로제트(cortical rosettes)가 관찰되었습니다. 신체의 외곽 가장자리는 분열 후 뉴런을 포함하는 발달 중인 피질판과 유사하며, 이는 신경 전구세포 및 가장 복측화된 외측 피질층의 마커인 Brn2의 발현을 통해 확인되었습니다.외층에는 casual gratzel 세포 또는 그 전구세포일 가능성이 있는 Reelin 양성 세포들이 포함되어 있습니다. 또한, 이 세포체들은 mixed codal 및 medial ganglionic immenants 기원과 일치하는 마커들을 발현했습니다. 이는 cooked TF2 및 Nkx2.1 마커의 발현을 근거로 합니다.배양된 SFEB에서는 CalR 및 CalB 양성 중간뉴런뿐만 아니라, VGLUT 양성 흥분성 뉴런과 Tbr1 양성 글루탐산 작동성 신경 전구세포가 생성됩니다. 다른 보고들과 일치하게, 세포체 유래 세포의 61%는 VGLUT 양성이었으며 43%는 Tbr1 양성이었습니다.세포체에서 기록한 MEM 기록은 장기간 동안 수행할 수 있으며, 이 기록을 통해 피질 네트워크 수준의 버스팅(bursting) 발달을 확인할 수 있었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 iPSC로부터 SFEB를 배양하는 방법, NSFEB를 사용하여 발달 중인 피질 로제트의 신경라(neurula) 함량을 특성화하는 방법, 그리고 성숙하는 SFEB에 대해 신경생리학적 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 iPSC의 거동과 배양액 내 iPSC의 신경세포 분화 과정에 필요한 과학적 식견을 갖추기까지 시간과 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 배양된 세포는 매일 모니터링해야 합니다. 이 절차 이후에는 약물 처리가 피질 네트워크 진동에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 칼슘 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

비디오 생물 정보학은 자동 처리, 분석, 이해하고, 미세한 동영상에서 추출한 생물 spatio - 시간적 데이터의 데이터 마이닝이다. 이 문서의 목적은 비디오 생물 정보학 방법을 사용하여 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 측정하는 방법을 설명하는 것입니다.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

이 비디오는 다양한 무혈청 분화 배지 또는 DM을 사용하여 신경 전구 세포에서 무혈청 배아체(SFEB)를 개발하는 절차를 설명합니다. DM-2는 뉴런의 성숙 및 배열을 촉진하여 SFEB를 형성하는 반면, DM-3은 추가 성장 유지를 위해 사용됩니다.

Development and Maintenance of Serum-free 배아체(Development and Maintenance of Serum-free embryoid body)

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

오가노이드는 질병 모델링을 위한 유용한 도구가 되었습니다. 세포외 기질(ECM)은 오가노이드 생성 중 세포의 운명을 안내하며, 자연 조직과 유사한 시스템을 사용하면 모델 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 이 연구는 동물 유래 ECM과 무이종 하이드로겔에서 유도만능줄기세포 유래 인간 장 오가노이드의 생성을 비교합니다.

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

배우세요 hiPSC에서 혈청 무 세포 배아체(SFEB)를 배양하여 3D 인간 대뇌 피질 발달을 모델링하는 방법입니다. 이 기술은 신경생물학 장애 약물 스크리닝에 활용됩니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

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