상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링
2017년 8월 7일
이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 점막 내막액 샘플링 방법의 전반적인 목표는 자극 절차 없이 기도의 국소 면역 신호를 연구하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 감염, 천식 및 알레르기와 같은 소아 호흡기 질환 분야의 핵심 질문을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 생체 내에서 자극되지 않은 기도 점막에서 매우 낮은 수준의 면역 매개체를 측정할 수 있다는 것입니다.
시연은 Dr.Wolsk가 수행합니다. 신생아 샘플 채취의 경우, 먼저 섬유질 수산화 폴리에스테르 필터 시트에서 최소 2개, 3 x 15mm 스트립을 절단합니다. 다음으로, 신생아를 침대에 눕히고 기도 감염 증상을 기록한다.
그런 다음 집게를 사용하여 약 1cm 크기의 여과지 한 장을 아기의 각 콧구멍의 하부 비갑개 앞쪽에 삽입하고 필요에 따라 신생아에게 설탕물을 투여하여 편안함을 제공합니다. 샘플링 기간 동안 발생하는 재채기, 지속적인 울음 또는 비명주성을 기록하십시오. 2분 동안 흡수한 후 여과지를 라벨이 붙은 튜브에 옮겨 섭씨 영하 80도에서 즉시 보관합니다.
실험 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Lisbeth Rosholm입니다. 기도 면역 매개체 정량화를 위해 섭씨 80도의 음의 얼음 위에 보관된 샘플을 최대 10개까지 놓고 식별 번호를 기록합니다. 샘플이 해동되면 피험자당 두 여과지를 여과지당 150마이크로리터의 새로 준비된 완충액에 담그고 완충지 원액 25ml당 완전한 프로테아제 억제제 정제 1정을 보충합니다.
샘플을 400rpm의 플레이트 셰이커로 5분 동안 옮깁니다. 버퍼와 여과지를 개별 셀룰로오스 아세테이트 튜브 필터의 컵으로 옮깁니다. 샘플을 원심분리하여 미세 원심분리기 튜브 바닥에 여과된 비강 추출물을 수집합니다.
그런 다음 컵을 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 비강 추출물의 150마이크로리터 분취액을 저단백질 결합 저장 플레이트의 개별 웰로 옮기고 분석할 때까지 플레이트를 섭씨 마이너스 80도에서 보관합니다. 그런 다음 표준 분석 프로토콜에 따라 고감도 전기화학발광 기반 다중화 어레이로 관심 비강 면역 매개체의 농도를 측정합니다.
620명의 신생아를 대상으로 한 이 대표적인 분석에서, 측정된 대부분의 면역 매개체들은 낮은 수준의 검출을 보였다. IFN 감마 수치는 샘플의 거의 절반에서 검출 하한보다 낮았으며, TNF 알파, CCL4 및 TGF 베타 수치는 샘플의 1% 미만에서 검출 한계 미만이었습니다. 히트 맵(heat map)에 표시된 바와 같이 20개의 감지된 매개체 수준에 대해 강력한 다중 공선성(multicollinearity)이 분명했습니다.
무증상 피코르나바이러스에 감염된 신생아에서 주로 제1형 면역 매개체가 손상된 상향 조절된 프로필이 관찰되었는데, 이는 생애 초기에 박테리아와 바이러스에 군집화하는 면역 유발 역할을 시사합니다. 출생 시 가족 내 형제자매의 존재와 특정 1형 17형 유도 점막 면역 반응 사이의 연관성도 확인되었으며, 이 현상과 마지막 출산 이후의 시간과 반비례하는 자궁 내 면역 프라이밍 효과의 상관관계에 대한 증거가 확인되었습니다. 또한, 위약 보충제를 많이 섭취한 산모에게서 태어난 자녀는 특정 면역 매개체가 상향 조절되는 특징이 있었는데, 이는 비타민 D가 바이러스, 박테리아, 형제자매 또는 모계 아토피에 의해 유발되는 반응과는 무관하게 항균 면역 반응을 촉진한다는 것을 시사합니다.
이 마이크로 샘플링 방법은 기관지 내시경을 통해 사용할 수도 있으므로 하기도의 면역 매개체를 연구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신생아 및 나이가 많은 어린이의 생체 내에서 자극되지 않은 기도 점막의 매개체를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 상기도에서 손상되지 않은 점막 내층액을 채취하기 위한 비침습적 기술을 설명합니다. 이 기술을 통해 모든 연령대의 피험자를 대상으로 사이토카인 및 케모카인과 같은 단백질 매개체의 체내 수준을 정량화할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 호흡기 질환
- 면역학
- 소아과학
배경
- 이 방법은 자극 절차 없이 기도의 국소 면역 시그니처를 연구합니다.
- 감염, 천식 및 알레르기와 같은 소아 호흡기 질환에 적용 가능합니다.
- 이 기술을 통해 in vivo 상태의 비자극 기도 점막 내 저농도 면역 매개체를 측정할 수 있습니다.
- 해당 절차의 시연은 Wolsk 박사가 진행합니다.
연구 목적
- 기도 점막의 면역 반응을 조사하기 위함입니다.
- 소아 호흡기 질환에 대한 통찰력을 제공하기 위함입니다.
- 연구를 위한 비침습적 샘플링 기술을 촉진하기 위함입니다.
사용된 방법
- 상기도 점막 내층 액체 수집.
- 시료 수집을 위한 섬유질 수산화 폴리에스테르 필터 시트 사용.
- 신생아의 기도 감염 증상 관찰.
- 수집된 시료 내 사이토카인 및 케모카인 정량 분석.
주요 결과
- 침습적 절차 없이 점막 내층액을 성공적으로 수집함.
- in vivo에서 면역 매개체를 측정할 수 있는 능력.
- 소아 환자의 면역 프로파일에 대한 통찰력 제공.
- 호흡기 질환 이해를 위한 잠재적 응용 가능성.
결론
- 비침습적 샘플링 방법은 기도 면역 연구에 효과적입니다.
- 이 기술은 소아 호흡기 건강 연구를 발전시킬 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 면역 매개체와 관련된 발견 내용을 더욱 확대하여 다룰 수 있을 것입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 비침습적 점막 내층 액체 샘플링 방법은 자극 없이 상기도 점막 내의 in vivo 면역 매개체를 직접 정량화할 수 있게 하여, 기도 면역 활성에 대한 생리학적으로 유의미한 판독 값을 제공합니다. 이 기술은 생애 초기 면역 프로파일링 및 종단적 모니터링을 지원하며, 유전적 및 환경적 노출을 면역 표현형과 연결함으로써 호흡기 치료제 개발 과정에서 기전적 리스크 감소를 용이하게 합니다. 신생아 및 소아 코호트에 적용할 경우, 특히 천식, 알레르기 및 감염성 질환 상황에서 엔도타이핑(endotyping) 및 질병 진행 모니터링을 위한 예측 가치를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 자극되지 않은 점막 조직에서 면역 매개체의 기저 수준 및 유도 수준을 측정함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 소아 집단을 대상으로 한 기능적 타겟 검증을 위해 재현 가능하고 침습성을 최소화한 매트릭스를 제공합니다.
- 예측적 가치: 매개체 프로필을 무증상 바이러스 감염 및 형제자매 노출 효과와 같은 임상적 표현형과 상관 분석함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 정량적 면역 프로파일링을 위한 고감도 전기화학발광 멀티플렉스 어레이와 호환되는 용출 단백질 샘플을 생성합니다.
- 표준화: 일관된 여과지 흡수 및 용출 프로토콜을 사용하여 피험자 및 시점 전반에 걸쳐 분석물의 재현 가능한 회복을 보장합니다.
- 확장성: 대규모 신생아 코호트(n=620)에서 타당성이 입증되어, 역학 및 중재 연구의 고처리량 스크리닝 응용을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 출생부터 아동기까지의 종단적 샘플링을 가능하게 하여, 생애 초기 면역 시그니처와 이후의 호흡기 질환 결과 사이의 연관성을 연결합니다.
- 바이오마커 일치: 무증상 피코르나바이러스(picornavirus) 감염 신생아에서 type 1 및 type 17 면역 매개체의 상향 조절을 감지하며, 이는 면역 엔도타입(immune endotypes) 식별에 유용함을 시사합니다.
- 기전적 위험 감소: 모체 비타민 D 보충과 항균 면역 반응 사이의 연관성을 밝혀, 면역 조절 중재를 위한 표적 우선순위 설정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 생체 내(in vivo)에서 면역 매개체를 직접 측정할 수 있게 함으로써, 리드 화합물 발굴 전 단계에서 타겟 선정 및 경로 규명을 가능하게 하여 발견 생물학 단계에 부합합니다.
- 발견 생물학: ex vivo 조작이나 자극 아티팩트 없이 점막 조직 내 면역 경로 활성화에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 멀티플렉스 면역 분석 판독에 적합한 표준화된 용출물을 생성하여, 처리군 또는 노출군 간의 비교 분석을 용이하게 합니다.
- 분석: 공선성, 면역 네트워크 활성 및 표현형 연관성에 대한 통계적 평가가 가능한 정량적 매개체 수준을 생성합니다.
- 중개 연구: 신생아 면역 프로파일을 아동기 호흡기 증상 및 환경 노출과 연결하여, 위험 층화 기반의 진행 결정 과정을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 호흡기 질환 모델 및 치료 양식에 적용 가능한 플랫폼 호환 샘플링 기술을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 천연 점막 미세환경에서 내인성 면역 활성을 포착함으로써 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 제공합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 수집, 용출 및 보관 절차를 통해 분석 전 변동성을 최소화하여 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 면역 조절 메커니즘을 생애 초기 면역 시그니처와 연결함으로써 호흡기 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄이고 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 관련성 있는 종단적 인간 모델에서 입증된 점막 면역 경로의 효과를 기반으로 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 피검자의 편안함과 샘플의 무결성을 보장하기 위해 신생아 기도 해부학 및 부드러운 샘플링 기술에 대한 교육이 필요합니다.
- 분석물 검출을 위해 울트라필터 튜브, 플레이트 쉐이커 및 전기화학발광 면역분석 인프라에 대한 접근이 필요합니다.
- 추출 과정 중 매개체 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제가 포함된 표준화된 완충액 조제가 필수적입니다.
- 연령이 더 높은 아동이나 다른 점막 부위에 적용할 경우 샘플링 시간 또는 필터 크기의 조정이 필요합니다.
- 분석물의 풍부함에 따라 제한이 있으며, 일부 매개체는 검출 한계 미만인 경우가 많으므로 저발현 표적에 대한 분석 감도 최적화가 필요합니다.
