광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측

이러한 방법의 전반적인 목표는 작은 간섭 RNA 매개 유전자 침묵 효율을 예측할 수 없고 결과적인 단백질 발현 수준에 대한 제어를 공간적 시간적 방식으로 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 구조, 기능, 관계 및 자극, 반응형 배송 차량을 설명할 수 있습니다. 결합과 해제에 대한 통제력을 높이면 번역 가능한 플랫폼과 신약 개발, 재생 의학 기술을 활용할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 유전자 발현의 변화를 간단한 siRNA 방출 분석 및 운동 모델링으로 염기에서 제어하고 예측할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법은 새로운 광 반응성 폴리머를 사용하지만, 이 분석 세트는 다양한 다른 자극 반응 시스템을 테스트하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 먼저 pH 6에서 20마이크로몰 HEPES 용액에 siRNA를 추가하여 밀리리터당 32마이크로그램 siRNA 용액을 준비합니다.

그런 다음 pH 6에서 20밀리몰 HEPES 용액에 용해된 mPEG 블록 폴리아플 BMA 폴리머를 첨가하여 폴리머 용액을 준비합니다. 밀리리터당 220마이크로그램의 농도를 달성하기 위해 이 농도는 N 대 P 비율이 4가 되며, 이는 고분자에 siRNA의 인산기보다 4배 많은 아민기가 있음을 의미합니다. 다음으로, 볼텍스 기계에서 부드럽게 혼합하면서 동일한 부피의 siRNA 용액에 폴리머 용액을 적하 방향으로 첨가합니다.

폴리머 첨가 후 30초 동안 계속 와류를 계속합니다. 그런 다음 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 각 나노캐리어 용액에 STS 용액을 적음으로 첨가하면서 와류 기계에서 부드럽게 혼합합니다.

SDS 에디션 후 30초 동안 계속 소용돌이를 계속합니다. 3, 000 GS에 5 초 동안 표본을 원심 분리하고, 그 후에, 30 분 동안 실내 온도에 어두운 곳에 있는 표본을 배양하십시오. 365 나노미터 필터를 사용하여 UV 레이저를 보정하고 제곱미터당 200와트의 강도로 설정합니다.

그런 다음 고무 개스킷에 구멍을 뚫고 고무 개스킷을 세척 및 건조된 유리 슬라이드에 놓습니다. 나노캐리어 SDS 용액을 고무 개스킷 구멍 내부의 유리 슬라이드에 피펫팅합니다. 고무 개스킷과의 접촉을 피하면서 유리 슬라이드에 과도한 용액을 로드합니다.

두 번째 유리 슬라이드를 슬라이드 개스킷 위에 놓습니다. 기포 생성을 방지하려면 슬라이드의 한쪽 끝을 먼저 아래로 내린 다음 다른 쪽 끝을 천천히 내립니다. 유리 챔버의 양쪽에 바인더 클립을 부착하여 단단히 고정합니다.

365 나노미터 필터와 함께 UV 레이저를 사용하여 제곱미터당 200와트의 강도로 원하는 시간 동안 샘플을 조사합니다. 바인더 클립을 제거하고 챔버를 엽니다. 다음으로, 조사된 나노캐리어 SDS 샘플 25마이크로리터를 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.

용액을 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 5마이크로리터의 로딩 버퍼 용액을 각 나노캐리어 SDS 시료 25마이크로리터에 추가합니다. 샘플을 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 각 나노캐리어 SDS 샘플 30마이크로리터를 브롬화 에티듐으로 사전 염색된 2% 아가로스 겔에 로드합니다. 어둠 속에서 100볼트로 30분 동안 젤을 작동시킵니다. 브롬화 에티듐 필터가 있는 겔 이미징 시스템을 사용하여 겔을 이미지

겔 이미지 파일을 저장하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 bend intensity quantification을 진행합니다. 양면 접착 스페이서에서 종이 조각을 제거하여 접착 표면을 노출시킵니다. 스페이서를 유리 커버 슬립에 부착합니다.

나노캐리어 SDS 용액을 커버 슬립에 피펫으로 끼웁니다. 그런 다음 미리 세척된 유리 슬라이드를 접착 스페이서의 구멍으로 샘플 중앙에 놓고 커버 슬립 위에 놓습니다. 유리 슬라이드를 밀어 유리 슬라이드와 커버 슬립이 잘 부착되고 밀봉되었는지 확인합니다.

FCS 측정을 위해 개구수가 1.2인 40배 침수형 무감식 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용합니다. 적절한 excitation laser channel을 사용하여 샘플당 각각 10초씩 최소 30개의 측정값을 수집합니다. 그런 다음 FCS의 siRNA 방출 데이터를 kinetic 모델에 입력하여 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 유전자 침묵 반응을 예측합니다.

체외 siRNA 전달을 준비하려면 먼저 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 2ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 세포가 인큐베이터에서 24시간 동안 부착되고 회복되도록 합니다. 인산염 완충 식염수로 세포를 세척한 후 1.5ml의 혈청과 항생제 무균 전달 배지를 첨가하여 형질주입을 준비합니다.

다음으로, 각 웰에 30피코몰의 siRNA tp를 포함하는 25마이크로리터의 나노캐리어 용액을 추가합니다. 매체를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 섞습니다. 세포를 인큐베이터에 3시간 동안 넣습니다.

transvection 배지를 제거하고 PBS로 각 웰을 세척합니다. 그런 다음 1ml의 보충제 성장 배지를 추가하고 세포를 인큐베이터에 넣어 30분 동안 회복합니다. 광 자극으로 치료하기 위해 세포를 준비하려면 보충된 성장 배지를 제거합니다.

그런 다음 각 웰에 1ml의 transvection medium을 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 UV 레이저를 보정한 후 섭씨 37도로 설정된 핫 플레이트에 셀을 놓습니다. 6웰 플레이트에서 덮개를 제거합니다.

365 나노미터 필터가 있는 UV 레이저를 사용하여 평방 미터당 200와트의 강도로 원하는 시간 동안 플레이트 위에서 세포를 조사합니다. 형질주입 배지를 제거하고 2ml의 보충 성장 배지를 추가합니다. 추가 분석이 있을 때까지 세포를 인큐베이터에 넣습니다.

365나노미터의 빛을 완전히 차단하고 반사를 최소화하는 포토 마스크를 준비하려면 먼저 포토 마스크를 원하는 모양으로 자르고, 펀칭하고/하거나 기계로 가공합니다. 포토 마스크를 6웰 플레이트의 바닥에 붙이고, 패턴은 세포가 포함된 웰의 중앙에 있고 반사 방지 면은 플레이트를 향하도록 합니다. 약 25미터 떨어진 곳에 두 개의 링 스탠드를 설치하고 플랫폼이 동일한 높이가 되도록 각 링 스탠드에 플랫폼을 분리합니다.

플랫폼 위에 플레이트를 올려 놓아 두 스탠드 사이에 셀 플레이트를 매달아 놓습니다. 365 나노미터 필터가 있는 UV 레이저를 사용하여 평방 미터당 200와트의 강도로 원하는 시간 동안 샘플 아래에서 세포를 조사합니다. 형질주입 배지를 제거하고 2ml의 보충 성장 배지를 추가합니다.

그런 다음 세포를 인큐베이터에 넣어 최소 24시간 동안 회복합니다. 앞에서 설명한 대로 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다. 여기에 표시된 것은 유전자 침묵 역학의 간단한 운동 모델링의 예입니다.

이 모델은 광유도 siRNA 방출 후 시간의 함수로 mRNA, 단백질 및 siRNA의 농도를 예측하기 위해 실행되었습니다. 다른 빛의 투여량에 따라 방출되는 siRNA의 상대적인 양은 kinetic model에서 초기 siRNA 농도로 입력되었습니다. 단백질 발현 수준에 대한 결과 모델 예측은 웨스턴 블로팅을 통해 얻은 실험적으로 결정된 발현 수준과 일치했습니다.

시각화를 위해 GFP 발현 세포를 siRNA를 표적으로 하는 GFP로 처리하고, 원형 패턴을 생성하기 위해 방사선 조사 전에 항문 포토 마스크를 플레이트에 배치했습니다. 빛으로부터 보호된 세포는 siRNA와 빛으로 처리되지 않은 대조군 샘플과 구별할 수 없는 형광 강도를 보였습니다. 그러나 원형 패턴 내의 거의 모든 세포는 GFP 발현을 나타내지 않았으며, 이는 효율적인 siRNA 방출 및 유전자 녹다운을 나타냅니다.

더욱이, 빛의 사용은 세포 길이 척도에서 제어될 수 있는 유전자 발현을 가능하게 하는 방아쇠입니다. 요약하면, 이 방법을 사용하면 조사 조건을 신속하게 결정하여 siRNA 방출을 시공간적으로 제어하고 선험적으로 유전자 침묵을 예측할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 나노 캐리어 안정성과 효능을 지배하는 구조, 기능 관계를 설명하는 데 도움이 될 것입니다.

이 기술은 유전자 발현에 대한 시공간 제어가 필요한 재생 의학에 응용할 수 있습니다. 이러한 제형은 또한 피부암과 같은 국소 질환 및 피부 질환의 치료에 매우 적합합니다.