중간 규모의 Drosophila 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

이 실험의 전반적인 목표는 중간 규모로 초파리 배아를 수집하기 위한 간단하고 저렴한 접근 방식을 제공하는 것입니다. 그리고 친화성 정제 질량 분석법과 같은 다운스트림 단백질체학 응용 분야에 사용할 수 있는 단백질 추출물을 준비합니다. 이 방법은 세포 신호 전달 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 특정 단백질, 단백질 상호 작용이 유기체 발달 중에 세포 통신을 수행하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 초파리 배아 용해를 생성하는 쉽고 저렴한 방법이라는 것입니다. 단백질 친화성 정제와 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

전통적으로 연구자들은 매우 큰 집단 케이지에서 초파리 배아를 수집했습니다. 그러나 우리는 모든 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 중간 크기의 케이지에서 배아를 수집할 수 있는 사용자 친화적인 절차를 제시합니다. 5 리터 용기를 준비하고 25 x 25cm 정사각형의 나일론 메쉬를 자른 후 텍스트 프로토콜에 따라 용기 위에 메쉬를 놓고 뚜껑으로 누릅니다.

메쉬가 단단히 조여져 있고 뚜껑이 기울어지지 않았는지 확인하십시오. 이제 새장에 파리가 서식할 준비가 되었습니다. 1 리터 플라스틱 항아리와 18 x 18cm 나일론 메쉬 사각형을 준비 한 후 메쉬를 항아리의 상단 가장자리에 놓고 뚜껑을 조여 조입니다.

메쉬가 단단히 조여져 있고 뚜껑이 기울어져 있지 않은지 확인하십시오. 형질전환 플라이 라인이 관심 유형화된 단백질을 운반하는 것을 증폭합니다. 그리고 각 플라이 라인에 25-30개의 병이 쌓일 때까지 이틀에 한 번씩 병을 옮깁니다.

비슷한 방식으로 대조군을 증폭합니다. 다음으로 사과 주스 플레이트를 실온으로 가열합니다. 그런 다음 장갑을 낀 손가락을 사용하여 접시 중앙에 젖은 이스트 페이스트를 펴 바릅니다.

15cm 플레이트에 대해 약 6cm 원을 만듭니다. 그리고 10cm 플레이트에 대한 4cm 원. 파리를 마취하고 메쉬가 아래를 향하도록 준비된 우리로 옮긴 후 사과 주스 플레이트로 케이지를 덮습니다.

파리가 깨어나게 하십시오. 그런 다음 케이지를 뒤집어 실온에서 2-3일 동안 파리를 부화시킵니다. 케이지를 거꾸로 뒤집어 하루에 두 번 플레이트를 교체하고 플레이트를 케이지에 고정한 상태에서 플레이트에서 테이프를 벗겨냅니다.

벤치에 있는 케이지 전체를 부드럽게 두드리고 오래된 접시를 새 접시로 빠르게 교체하여 파리가 탈출하지 않도록 합니다. 파리가 신선한 사과 주스 접시에 하룻밤 동안 또는 원하는 다른 시간 동안 배아를 낳도록 허용합니다. 다음 날 아침, 배아 채취를 위해 메쉬 용기를 표시하고 무게를 잰다.

사용된 각 플라이 라인에 대해 하나씩. 50 ml 튜브에 10 ml의 5x 농축 Lysis Buffer에 40 ml의 물을 첨가하여 이전에 만들어진 시약을 사용하여 50 ml 튜브에 1x Lysis Buffer를 준비합니다. 1 밀리 어금니의 최종 농도에서 50 마이크로리터의 1 어금니 DTT를 추가합니다.

잘 섞어 용액을 두 개의 50 밀리리터 튜브 사이에 나눕니다. 튜브 중 하나에 프로테아제 억제제 정제 1정을 추가합니다. 그리고 튜브를 섭씨 4도의 회전기에 30분 동안 놓습니다.

정제가 용해되는 동안 케이지의 사과 주스 플레이트에 플라이 라인의 유전자형을 사용하여 배아 수집을 시작합니다. 그리고 접시를 새 접시로 교체하십시오. 각 사과 주스 접시가 잠길 만큼 물을 충분히 넣으십시오.

그런 다음 부드러운 붓으로 접시에서 배아를 부드럽게 제거합니다. 배아를 미리 무게를 측정하고 표시한 메쉬 용기에 붓고 여분의 물을 배출합니다. 그런 다음 종이 타월에 메쉬를 짧게 닦아 여분의 물을 제거합니다.

배아를 제거하려면, 6cm 페트리 접시에 50%의 표백제를 반쯤 채웁니다. 그런 다음 물과 함께 두 개의 큰 페트리 접시를 준비합니다. 배아가 든 메쉬 용기를 50% 표백제에 90초 동안 담급니다.

배양 중에 메쉬를 몇 번 부드럽게 두드려 표백제 용액에 배아를 매달아 놓습니다. 배양이 끝나면 물을 사용하여 두 접시 각각에 담긴 메쉬 용기를 약 10초 동안 씻습니다. 그런 다음 분출 병에 18.2메가옴센티미터의 물을 사용하여 측면과 외부를 포함한 메쉬 용기를 철저히 헹굽니다.

철저한 세척 후에는 표백제 냄새가 감지되지 않아야 합니다. 종이 타월에 메쉬 용기를 닦습니다. 그런 다음 배아와 함께 메쉬 용기의 무게를 측정하고 빈 용기의 무게를 뺍니다.

배아의 결과 체중을 기록합니다. 배아 추출물을 준비하려면 프로테아제 억제제가 함유된 Lysis Buffer 1ml를 Dounce glass homogenizer에 넣고 얼음에 보관합니다. 그런 다음 메쉬 용기에서 균질기로 배아를 옮깁니다.

1ml의 Lysis Buffer를 사용하여 메쉬에 남아 있는 배아를 씻어냅니다. 그리고 배아와 완충액을 균질기의 물질에 추가합니다. 그런 다음 배아를 균질기의 바닥에 가라앉히고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.

다음으로, 프로테아제 억제제가 포함된 Lysis Buffer를 균질기에 추가하여 배아 1g당 5-6ml의 Lysis Buffer를 목표로 합니다. 그런 다음 헐렁한 유봉을 삽입하여 4-6번의 스트로크로 배아를 균질화합니다. 첫 번째 스트로크 동안에는 더 많은 저항이 있을 것입니다.

용액이 튀는 것을 방지하기 위해 유봉을 연속적인 동작으로 이동하십시오. 그런 다음 꼭 맞는 유봉으로 교체하십시오. 그리고 8-10번의 스트로크로 배아를 균질화합니다.

호모지노이드를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 균질체를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그리고 13, 000 시간 G 및 15 분 동안 4 섭씨 온도에서 원심 분리기.

맨 위 지질층의 펠릿을 피하면서 상등액을 얼음 위의 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 중추화를 반복한 후 1ml 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 그리고 045 마이크로미터 필터가 부착된 10ml 주사기에 넣습니다.

얼음 위에 표시된 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 모든 용액을 밀어 넣습니다. 샘플을 액체 질소로 스냅 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 또는 단백질 정제 실험에 즉시 사용하십시오.

이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 lysates는 arm-odillo promoter의 제어 하에 EGFP-ERK 단백질을 유비쿼터스하게 발현하는 초파리 배아에서 제조되었습니다. 단백질의 발현은 총 ERK 단백질에 대한 웨스턴 블로팅(Western Blotting)에 의해 확인되어 각각 42킬로달톤과 69킬로달톤으로 이동하는 내인성 및 형질전환 EGFP-ERK의 수준을 동시에 검출했습니다. 황백색 대조선에서 태그가 지정되지 않은 내인성 ERK에 해당하는 단일 밴드가 검출되어 배아에서 ERK 및 EGFP-ERK의 성공적인 추출을 확인했습니다.

추출 프로토콜이 태그가 지정된 단백질의 후속 정제에 적합한지 여부를 테스트하기 위해 황백색 및 arm-EGFP-ERK 파리의 추출물을 GFP Agarose Beads를 사용하여 친화성 정제를 수행했습니다. 그래디언트 SDS-PAGE에서 실행된 샘플의 은 염색은 미끼 단백질 EGFP-ERK의 성공적인 정제를 보여줍니다. EGFP-ERK 외에도 실험 레인에는 대조군 샘플에서 관찰되지 않은 추가 밴드가 포함되어 있어 정제가 잠재적인 ERK 상호 작용 단백질을 회수했음을 시사합니다.

일단 숙달되면 배아 채취 및 추출 단계를 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 얼음 위에서 추출 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그리고 단백질 분해를 최소화하기 위해 프로테아제 억제제를 사용합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 중간 규모로 초파리 개체군 케이지를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 배아에서 전체 세포 단백질 추출물을 만드십시오.