Name: 중간 규모의 Drosophila 프로테옴 실험을위한 배아 추출물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 Drosophila 배아 추출물 제작 방법을 통해 중간 규모 프로테옴 실험을 수행하세요. 이 기법은 AP-MS 등 다운스트림 분석에 활용 가능하며, 발달생물학 및 세포 신호전달 연구에 필수적인 단백질 상호작용을 효율적으로 규명합니다.

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저자는 원고에 대한 도움이되는 의견과 프로토콜 개선을위한 제안에 대해 Veraksa 연구소 구성원에게 감사드립니다. AV는 NIH 보조금 GM105813 및 NS096402에 의해 지원되었습니다. LY는 University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme 박사 과정 동우회 (Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship)에서 후원했습니다.

1. 5 L 플라이 케이지의 준비 (15 cm 플레이트에 맞추기) <ol><li> 필요한 재료를 얻으십시오 : 뚜껑이있는 5 쿼트 (4.7 리터) 용기 ( 그림 1A ), 나일론 메쉬 및 면도날. </li><li> 면도날 ( 그림 1B )을 사용하여 직경 12cm의 원을 표시하고 컨테이너 바닥에 구멍을 뚫습니다. 뚜껑에 직경 15cm의 구멍을 잘라냅니다 ( 그림 1C ). </li><li> 25 x 25 cm 사각형으로 나일론 메쉬를 자릅니다. </li><li> 메쉬를 용기의 상단 가장자리 위에 놓고 뚜껑을 아래로 누릅니다 ( 그림 1C ). 메시가 단단하고 뚜껑이 기울어 있지 않은지 확인하십시오. 케이지에 파리가 채워질 준비가되었습니다 (5.3 단계 참조). </li></ol> 2. 1 L 플라이 케이지의 준비 (10 cm 플레이트에 맞추기) <ol><li> 필요한 재료를 얻으십시오 : 전기 드릴, 76mm (3 인치) 절삭 공구 ( 그림 1E 및 Figure 1F), 뚜껑, 나일론 메쉬, 면도날, 사포, 고글 및 작업용 장갑이있는 직선형 1L 플라스틱 용기. </li><li> 드릴링 중에 뚜껑을 단단히 조일 때 플라스틱 뚜껑 ( 그림 1G )의 바닥과 뚜껑에 3 인치 (76mm)의 구멍을 잘라냅니다 ( 그림 1G ). 구멍을 만들기 시작할 때 절삭 공구를 원의 중심에 놓습니다. 주의 :이 단계에서 눈 보호 장치를 착용하고 장갑을 착용하십시오. </li><li> 면도날과 사포로 구멍의 가장자리를 부드럽게합니다. </li><li> 나일론 메쉬를 18x18cm 사각형으로 자른다. </li><li> 항아리의 상단 가장자리 위에 메쉬를 놓고 뚜껑을 조여서 조입니다 ( 그림 1G ). 메시가 단단하고 뚜껑이 기울어 있지 않은지 확인하십시오. 케이지에 파리가 채워질 준비가되었습니다 (5.3 단계 참조). </li></ol> 3. 사과 주스 (AJ) 후판 준비 <ol><li> 2L 플라스크에 한천 19g과 18.2MΩ · cm 물 1L를 넣는다.교반 막대를 넣고 잠깐 섞는다. </li><li> 30 분 동안 오토 클레이브한다. 한편, 냉동 재고에서 100 % 사과 주스 농축 물을 녹이고 10 % (중량 / 부피) 메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트 용액 10 mL를 에탄올에 용해시킵니다. </li><li> 고압 증기 멸균 한 후 교반 판에 한천을 넣고 100 % 사과 쥬스 농축 물 80 mL와 10 % (중량 / 부피) 메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트 용액 10 mL를 플라스크에 넣는다. 일정한 혼합으로 상온에서 시원하게하십시오. </li><li> 각 접시의 한천 수준이 약 5mm 두께가되도록 15cm 페트리 접시 (5L 우리에 대한) 또는 10cm 페트리 접시 (1L 우리에 대한)를 부어. 실온에서 응고시키고 플라스틱 백으로 포장하십시오. AJ 플레이트는 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다. 참고 : 배양 접시는 씻고 다시 사용할 수 있습니다. </li><li> 젖은 효모 페이스트를 준비하십시오 : 쉽게 혼합 할 수있는 뚜껑이 달린 100 mL 용기에 활성 건조 효모를 약간 부어 넣고 교반하면서 소량의 물을 가하여 두껍고 완전히 혼합하십시오풀. 4 ° C에서 2 주 동안 보관하십시오. </li></ol> 4. 용해 시약의 준비 <ol><li> 5x 용해 버퍼를 준비 : 250mM 트리스 산도 7.5, 25 % 글리세롤, 1 % octylphenoxy 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올 (IGEPAL CA-630), 7.5 MM MgCl 2 , 625 MM NaCl, 125 MM NaF, 5 MM Na 3 VO 4 . <ol><li> 200 mL를 만들려면 : 지속적으로 교반하면서 71 mL 물에 1 g NaF 파우더와 184 mg Na 3 VO 4 파우더를 완전히 녹입니다. 1M Tris pH 7.5의 50 mL, 100 % IGEPAL 2 mL, 1M MgCl2 1.5 mL 및 5 M NaCl 25 mL를 첨가한다. 그런 다음 글리세롤 50 mL를 넣고 (마지막에 첨가) 1 시간 동안 계속 저어 준다. </li><li> 250 mL 필터 장치를 사용하여 필터 멸균하십시오. 이 단계는 느려질 수 있지만 용액을 여과하는 것은 불용성 미립자를 제거하는 것이 중요합니다. 50 mL 튜브에 10 mL 씩 분주하고 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 물에 1M DTT (dithiothreitol) 용액을 준비한다. -20 ℃에서 1 mL 분량으로 보관하십시오. </li><li> 단백질을 얻는다.에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)과 함께 ase 억제제 칵테일 정제. 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 10 mL 주사기 및 주사기 필터를 얻습니다 : 26 mm 직경, 계면 활성제가없는 셀룰로오스 아세테이트 (SFCA) 멤브레인, 0.45 μm 공극 크기. </li></ol> 5. 파리 태아 수집 <ol><li> 파리에있는 태그가있는 단백질을 운반하는 트랜스 제닉 플라이 라인 (병당 약 100 파리)을 증폭시키고 각 플라이 라인마다 25-30 병이 축적 될 때까지 2 일마다 병을 옮깁니다. 유사한 방법으로 제어 재고 ( 예 : yw 라인)를 증폭하십시오. </li><li> 온난 한 AJ 플레이트를 상온으로 (약 1-2 시간, 밤새도록 할 수 있음). 장갑을 낀 손가락을 사용하여 AJ 플레이트의 중앙에 약간의 젖은 효모 페이스트를 펼쳐서 약을 만듭니다. 15cm 플레이트의 경우 6cm 원, 10cm 플레이트의 경우 4cm 원입니다. </li><li> 표준 Drosophila 단계 설정을 사용하여 이산화탄소의 흐름으로 파리를 마취하고케이지 (약 5L 케이지 당 약 15 마리의 잘 자란 병, 1L 케이지 당 5 병). <ol><li> 케이지 바닥을 단계 5.2에서 준비된 AJ 플레이트로 덮고 두 개의 테이프 스트립을 사용하여 케이지에 테이프로 붙입니다 ( 그림 1D 및 1H ). 판을 교체 할 때 쉽게 벗겨 지도록 판 위에있는 테이프의 끝을 접을 때 유용합니다. </li><li> 파리가 마취에서 회복 된 후, 바닥에 접시와 케이지를 유지하고 맨 위에 메쉬. 참고 : 파리가 완전히 회복 될 때까지 기다리는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 AJ 플레이트와 효모 페이스트에 달라 붙을 것입니다. </li><li> 실험이 끝나면 새장을 준비하기 위해 새장을 냉동실에 몇 시간 동안 두십시오. 메쉬를 물에 몇 시간 동안 담그면 청소가 용이 해집니다. </li></ol></li><li> 새장을 파리와 함께 상온에서 2-3 일간 배양하고 하루에 두 번 AJ 플레이트를 교체하십시오. 번호판을 바꾸려면 새장을 거꾸로 뒤집고,접시에서 테이프를 떼어 내고 접시를 케이지에 붙이고 벤치에서 부드럽게 전체 케이지를 가볍게 두 드리며 파리를 빠져 나오지 않으려 고 새 접시를 빨리 교환하십시오. 참고 : 파리는 새장에 맞게 조정해야하며 3 일에 가장 잘 눕습니다. 약 4-5 일 동안 최고 수준으로 계속 누워 있습니다. 최고 산란 능력의 2 개 5 개 케이지는 야간 수집에서 1 g의 배아를 생산할 수 있습니다. 소규모 실험에는 1 개의 케이지를 사용하십시오. </li><li> 새 파리가 밤새 (약 16 시간) 또는 원하는 다른 시간 동안 배아를 낳도록하십시오. </li><li> 다음날 아침, 배아 채취를위한 메쉬 용기를 표시하고 계량하십시오 (사용 된 각 플라이 라인 당 하나씩). </li><li> 섹션 4의 시약을 사용하여 1x lysis buffer를 준비한다. (주의 : 즉시 사용할 수있는 1x lysis buffer는 추출 직전에 준비해야한다.) 5x 농축 lysis buffer (-80oC에서 저장 됨) 10mL에 물 40mL를 넣는다. 50 mL 튜브에 넣었다. <ol><li> 1 MD 50 μL 추가TT로 1 mM의 최종 농도로 만들고, 잘 섞어서 두 개의 50 mL 튜브, 각각 25 mL로 분리한다. 튜브 중 하나에 하나의 프로 테아 제 억제제 타블렛을 넣고 30 분 동안 4 ° C에서 회전하십시오. 타블렛이 용해되는 동안 태아를 모으고 dechorionate (5.8-6.6 단계). 정제가 완전히 용해되었는지 확인하고 완충액을 얼음에 보관하십시오. 참고 : DTT가있는 1x 버퍼의 두 번째 튜브는 -80 ° C에서 보관할 수 있으며 다음 실험 전에 태블릿을 추가하기 만하면됩니다. 25 mL의 용해 완충액으로 단백질 정제 단계에서의 세척을 고려하여 2 개 시료까지 충분합니다. </li></ol></li><li> 사용 된 플라이 라인의 유전자형으로 새장에 AJ 플레이트를 표시하고 신선한 플레이트로 교환하십시오. 참고 :이 단계에서 여분의 효모 페이스트를 플레이트에서 긁어 낼 수 있습니다. 태아는 25 ° C 또는 상온에서 원하는 발육 시간 창을 얻기 위해 플레이트에서 노화 될 수 있습니다. </li><li> 충분한 물을 넣으십시오.각 AJ 플레이트를 덮으십시오. 부드럽게 페인트 브러시 (약 10mm 너비의 플랫 헤드가 대형 플레이트에서 잘 작동 함)로 플레이트에서 태아를 부드럽게 제거합니다. 배아를 이전에 무게를 측정하고 표시된 메시 용기에 부어 과량의 물을 배출하십시오. <ol><li> 필요한 경우 모든 배아를 제거하기 위해 두 번째 헹굼과 닦기를 수행하십시오. 동일한 플라이 라인에 대한 추가 플레이트의 배아를 동일한 메쉬 컨테이너에 결합하십시오. </li></ol></li><li> 종이 수건에 메쉬를 간단히 묻혀 과도한 물을 제거하십시오. </li></ol> 6. 태아 Dechorionation <ol><li> 50 % 표백제 (물에 vol / vol 솔루션)와 6cm 페트리 접시를 절반 채워. 참고 : Table of Materials 및 Reagents에서 표백제 브랜드에 대한 중요한 설명을보십시오. 주의 사항 : 장갑을 끼고 옷에 표백제가 묻지 않도록주의하십시오. </li><li> 물로 2 큰 페트리 접시를 준비합니다. </li><li> 90 % 50 % 표백제로 배아와 함께 메쉬 컨테이너를 담그십시오. incu 도중 메쉬를 가볍게 두 드리십시오.표백제 용액에 배아를 정지시키기 위해 두 번에 걸쳐 번식하십시오. </li><li> 90 초 배양이 끝나면 2 가지 접시의 메쉬 컨테이너를 약 10 초 동안 물로 씻어냅니다. </li><li> 물병을 사용하여 메쉬 컨테이너를 18.2 MΩ · cm의 물로 완전히 헹굽니다. 또한, 메쉬 컨테이너의 측면과 외부를 씻으십시오. 참고 : 철저히 씻은 후에는 표백제 냄새가 없어야합니다. </li><li> 메쉬 컨테이너를 종이 타월로 닦으십시오. 배아와 함께 메쉬 컨테이너의 무게를 측정하고 5.6에서 얻은 빈 용기의 무게를 뺍니다. 배아의 결과 무게를 기록하십시오. 목표로하는 배아의 양은 0.5 ~ 1 g입니다. </li></ol> 7. 배아 추출물의 제조 <ol><li> 프로 테아 제 억제제 (단계 5.7의 것)가 포함 된 용해 완충액 1 mL를 dounce 유리 호 모지 나이저에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 배아를 메쉬 컨테이너에서 호모 제 나이저로 옮긴다. 참고 : 배아는 편평한 끝으로 집어 올릴 수 있습니다.fa metal spatula 또는 brush로 옮기고 완충액에 직접 옮긴다. 이 섹션의 모든 단계를 얼음 위에서 수행하십시오. </li><li> 추가 1 ML의 용해 버퍼와 메쉬에 남아있는 배아를 씻어하고 호모 제 나이저에있는 자료에 추가합니다. 배아가 균질 기의 바닥에 내려 앉게하고 조심스럽게 상층을 흡인하십시오. </li><li> 배아의 그램 당 용해 버퍼 5-6 ML을 목표로 호모 제 나이저에 프로 테아 제 억제제 (단계 5.7에서)와 용해 버퍼를 추가합니다. </li><li> 느슨한 피팅 유봉과 4-6 스트로크로 배아를 homogenize. 참고 : 첫 번째 스트로크 중에 더 많은 저항이 있습니다. 유분이 튀지 않도록 연속 동작으로 유모를 움직여보십시오. </li><li> 꽉 끼는 유봉으로 8-10 스트로크로 배아를 균질하십시오. </li><li> 얼음에서 호모 제 네이트를 20 분 동안 품어 낸다. </li><li> 최대 속도 (약 13,000 xg)에서 15 분 동안 4 ℃에서 마이크로 원심 분리 관 및 원심 분리기로 균질 액을 옮긴다. </li><li> 피하는알약과 맨 위에있는 지질 층을 옮기고 상층 액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮겨 4 ℃에서 15 분간 최고 속도 (약 13,000 xg)로 원심 분리하십시오. </li><li> 1 mL 팁으로 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 0.45 μm 필터가 부착 된 냉장 10 mL 주사기에 넣으십시오 (하나의 주사기에 같은 시료의 분취 량을 합치십시오). 모든 용액을 얼음에 표시된 15 mL 튜브에 넣으십시오. 추출물은 후속 단백질 정제 실험을 위해 즉시 사용되거나 액체 질소에서 급속 동결되며 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다. 주 : 이후 배아 해동 중에 프로테아제가 활성화되어 단백질 분해를 일으킬 수 있기 때문에 배아보다 추출물을 동결하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 중간 규모의 Drosophila 인구 케이지를 설정하고 배아에서 전체 세포 단백질 추출물을 만들기위한 간단하고 일반적인 절차입니다. 생성 된 추출물은 친 화성 수지상의 단백질 복합체의 정제와 같은 다양한 다운 스트림 적용에 사용될 수있다. 얼음에서 추출 단계를 수행하고 단백질 분해를 최소화하기 위해 강력한 프로 테아 제 억제제를 사용하는 것이 중요합니다. 설명한 바와 같이, 프로토콜은 대부분의 세포질 및 일부 막 및 가용성 핵 단백질 6 , 10 , 12 , 15의 분리에 적합합니다. 그것은 높은 소금 추출 5 를 사용하여 덜 용해 핵 단백질의 분리와 같은 다른 구획에서 단백질의보다 집중 정제를 위해 쉽게 적응할 수 ...

유전 적 스크린과 최근에 게놈 접근법은 생물학적 기능에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 중요한 세포 정보는 단백질 및 상호 작용하는 파트너의 앙상블로 인코딩됩니다. 기존의 유전체 개질제 스크린은 속도 제한 경로 구성 요소를 식별하고 간접적 인 상호 작용을 회복 할 수 있지만 proteomic 접근법의 강점은 관심 단백질의 완전한 즉각적인 상호 작용 네트워크를 확인하는 능력에 있습니다. 따라서, Proteomics는 생물 시스템을 연구하고, 유전체학, 전 사체 공학 및 전통적인 유전자 스크린을 보완하는 귀중한 직각 방법입니다. Affinity purification-mass spectrometry (AP-MS)는 세포와 조직의 고유 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs)을 연구하는 강력한 접근법으로 입증되었습니다. 이 방법은 특정 개발 단계에서 직접 또는 간접 상호 작용을 식별 할 수있게합니다여러 단계의 발달 과정에서 다수의 새로운 PPI를 확인하는데 성공적으로 사용되어왔다 (참고 문헌 1 에서 검토 됨). PPI 연구의 확실한 성공에도 불구하고, 대부분이 배양 세포에서 수행되어 관심있는 &quot;미끼&quot;단백질이 과발현되었다. 세포 배양에서 PPI를 연구하는 데는 두 가지 문제가 있습니다. 첫째, 특정 세포주는 특정 단백질의 발현 부족으로 인해 상호 작용을 완전히 제공하지 못할 수 있습니다. 둘째, 이러한 분석에서 일반적으로 사용되는 높은 과발현은 단백질 오 폴딩 또는 위양성 상호 작용의 동정과 같은 인위적인 결과를 초래할 수있다. 이러한 두 가지 한계 는 생체 내 PPI를 분석함으로써 극복 될 수 있습니다. 그러한 실험에서의 제한 단계는 단백질 복합체를 정제하기위한 출발 물질의 이용 가능성이다. Drosophila melanogaster 는 오랫동안 기능 분석을위한 모델로 사용되어 왔습니다또한 최근에는 생체 내에서 PPI를 연구하기위한 우수한 시스템으로 나타났습니다. Drosophila embryogenesis는 배아가 대량으로 쉽게 채취 될 수 있고 또한 대부분의 유전자 (&gt; 88 %)가 배아 발생 과정에서 발현되므로 관련 성을 감지하기위한 풍부한 생체 내 환경을 제공하기 때문에 PPI를 연구하기에 특히 매력적인 조직 유형을 나타낸다 PPIs 3 . 전통적으로 파리에서의 생화학 적 연구는 기능적 전사 물을 정제하는 데 필요한 것과 같이 매우 큰 규모의 배아 컬렉션 (100-150 g)을 이용했다. Drosophila의 이전 AP-MS 연구는 각 단계에서 물질의 관련 손실과 함께 tandem affinity purification (TAP)과 같은 2 단계 정제 방법에 의존했기 때문에 5-10 g의 많은 배아가 필요했습니다. 대 형제시작 물질의 ts은 많은 인구 케이지에 배아 컬렉션을 설치하는 것을 필요로했는데, 이는 상업적으로 구매할 때 비싸고 유지 보수 및 청소에 많은 시간이 소요될 수있다. 질량 분석기의 감도 증가뿐만 아니라 단일 단계 친 화성 정제 접근법의 발전에 대한 최근의 진보는 출발 물질의 필요한 양을 한 단계 줄였습니다. streptavidin 결합 펩타이드 (SBP) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 태그를 사용하여 1g 미만의 배아에서 시작하여 미끼 단백질과 상호 작용하는 성분의 양을 분리하여 식별 할 수 있습니다. 질량 분석 10 , 11 . 여기에 제시된 의정서의 목표는 연구자들이나는 생체 내 에서 PPI의 생화학 적 분석에 대한 장벽이되었다. 이를 위해 중간 규모 (0.5 ~ 1g)의 초파리 배아를 수집하기위한 간단하고 저렴한 절차를 제공하고, AP-MS 또는 기타 접근법에 의한 후속 분석에 적합한 전체 세포 단백질 추출물을 한 단계 준비합니다 . 우리의 방법은 모든 실험실에서 쉽게 생산할 수있는 맞춤형 1L 또는 5L 인구 케이지의 사용에 의존합니다. 또한, 여기에 제시된 추출 조건은 배양 된 세포와 생체 내 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 두 가지 연구에서 검증되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Leaktite 5-Qt. 자연 멀티 믹스 컨테이너 (3팩)</td><td>Home Depot</td><td>209330</td><td>5-L 케이지 제작용.</td></tr><tr><td>Leaktite 5-Qt. 자연 멀티 믹스 뚜껑 (3팩)</td> <td>Home Depot</td><td>209320</td><td>지름 8.37 인치. 5-L 케이지용 뚜껑.</td></tr><tr><td>투명한 뚜껑이 있는 Fisherbrand 페트리 접시, 100 x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>재질: 폴리스티렌. 1-L 케이지와 함께 사용됩니다.</td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 Fisherbrand 페트리 접시, 150 x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>재질: 폴리스티렌. 5-L 케이지와 함께 사용됩니다.</td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 Fisherbrand 페트리 접시, 60 x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>재질: 폴리스티렌. 배아 결핵 형성 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Sefar NITEX 나일론 메쉬</td><td>Sefar</td><td>03-180/44</td><td>180 미크론, 44% 개방 공간, 플라이 케이지에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>밀워키 3 in. Arbor</td><td>Home Depot</td><td>49-56-9670</td>이 있는 홀 도저 홀 소 <td>1-L 케이지를 만들기 위한 3인치 절단 도구.</td></tr><tr><td>흰색 폴리프로필렌 나사 마개가 있는 Nalgene 입이 넓은 직선형 PMP 항아리</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td>1-L 케이지 제작용. Thermo Scientific 고양이 # 21171000. 대체 1-L 용기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>레드 스타 액티브 드라이 이스트, 2 파운드 파우치</td><td>레드 스타&nbsp;</td><td></td><td>Amazon.com 또는 기타 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>냉동 100% 사과 주스 농축액&nbsp;</td><td></td><td></td><td>식료품점에서 구입할 수 있습니다. 캔에 "100% 사과 주스"라고 적혀 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>메틸 4-하이드록시벤조에이</td><td>트 아크로스 오가닉스</td><td>AC126965000</td><td>메틸파라벤 또는 테고셉트라고도 합니다. AJ 플레이트의 방부제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>분자생물학용 IGEPAL CA-630,</td><td>용해 완충액 제조에 사용되는</td> 100ml <td>Sigma</td><td>I8896</td>.</tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터 유닛(CN 멤브레인 포함)&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>09-740-2A</td><td>0.2 &mu; M 모공 크기. 5x 용해 버퍼를 필터링하는 데 사용됩니다. Thermo Scientific 고양이 # 1260020.</td></tr><tr><td>CO-RO ROCHE cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일</td> 시<td>그마</td><td>11697498001</td><td>20정 바이알. 용해 완충액에서 프로테아제 억제에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>코닝 SFCA 주사기 필터&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-21</td><td>SFCA 멤브레인, 직경 26mm, 기공 크기 0.45μm. 최종 추출물 샘플을 필터링하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Luer-Lok 바늘 없는 일회용 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td>는 최종 추출물 샘플을 필터링합니다. BD 고양이 # 309604.</td></tr><tr>물에서 50%(vol/vol)로 배아 탈각에 사용되는 <td>표백제</td><td>Clorox</td><td></td><td>는 모든 슈퍼마켓에서 구입할 수 있습니다. 다른 브랜드는 불완전한 탈각을 초래하거나 배아에 독성을 유발할 수 있으므로 Clorox 브랜드를 사용하는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>Corning Costar Netwell Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-213</td><td>배아 수집용 메쉬 용기. 74 &뮤; M 메쉬 크기, 6-well.</td></tr><tr><td>Wheaton Dounce 티슈 그라인더, 용량 15ml</td> 배아용 <td>Fisher Scientific</td><td>06-435B</td><td>균질화기, 느슨하고 단단한 유봉. Wheaton 고양이 # 357544.</td></tr></tbody></table>

중간 규모의<em&gt; drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs)의 분석은 세포 신호, 생물 발달 및 질병과 같은 생물학적 과정과 기전을 연구하는 데 없어서는 안될 접근법이되었습니다. 상호 작용 네트워크에 대해 가장 자연스럽고 편향된 시각을 얻기 위해 생체 내 물질을 사용하여 PPI 정보를 얻는 것이 종종 바람직합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 생체 내 에서 PPI를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼이며 생화학 실험을위한 물질 분리에 대한 직접적인 접근법을 제공합니다. 특히, 초파리 배아는이 발달 단계에서 동물을 수집하는 용이함과 대부분의 단백질이 배아 발생에서 발현되므로 대부분의 PPI를 밝힐 수있는 관련 환경을 제공하기 때문에 PPI를 연구하기위한 편리한 유형의 조직을 대표한다. 여기에 중간 규모 (0.5-1 g)의 Drosophila 배아를 수집하기위한 프로토콜을 제시합니다.이 배지는 광범위한 범위의친화도 정제 - 질량 분석법 (AP-MS)에 의한 PPI 분석을 포함한 프로테옴 응용 분야에 사용됩니다. 우리는 모든 실험실에서 쉽고 저렴하게 설치 될 수있는 배아 컬렉션을위한 1L 및 5L 케이지에 대한 설계를 설명합니다. 우리는 AP-MS와 같은 다운 스트림 응용 분야에서 직접 사용할 수있는 lysate를 생성하기위한 배아 채집 및 단백질 추출을위한 일반적인 프로토콜을 제공합니다. 우리의 목표는 모든 연구자들이 생체 내 PPI 분석을 수행 할 수있는 접근 방법을 제공하는 것입니다.

단백질 복합체 정제 실험에서이 프로토콜의 사용을 설명하기 위해, 우리는 동형 접합 된 생존 가능한 파리 라인, 팔 -EGFP -ERK를 생성 하고, 조절 하에 EGFP- 표지 된 초파리 신호 조절 키나아제 (말단 유전자에 의해 코딩되는 ERK)를 발현시켰다 유비쿼터스로 표현 된 armadillo ( 팔 ) 프로모터 18 , 19 . 팔 프로모터는 Drosophila embryogenesis의 대부분 단계에서 활성화 됩니다 19 . Lysate는 설명 된 프로토콜을 사용하여 준비되었으며 팔 -EGFP -ERK 도입 유전자의 단백질 발현은 전체 ERK 단백질에 대한 웨...

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

본 실험의 전반적인 목표는 중간 규모로 초파리 배아(Drosophila Embryos)를 수집할 수 있는 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 것입니다. 또한, 친화성 정제 질량 분석법(affinity purification mass spectrometry)과 같은 후속 단백질체학 응용 분야에 사용할 수 있는 단백질 추출물을 준비하는 것입니다. 이 방법은 세포 신호 전달 및 발생 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 유기체 발달 과정에서 특정 단백질과 단백질 상호작용이 세포 통신을 어떻게 수행하는지 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Drosophila 배아 용해물을 생성하는 쉽고 저렴한 방법이라는 점이며, 이는 단백질 친화성 정제와 같은 후속 응용 단계에 사용될 수 있습니다.전통적으로 연구자들은 매우 큰 집단 사육 케이지에서 초파리 배아를 수집해 왔습니다. 하지만 본 연구에서는 어떤 실험실에서도 쉽게 구축할 수 있는 중간 크기 케이지에서 배아를 수집하는 사용자 친화적인 절차를 제시합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 5L 용기를 준비하고 25 by 25 cm 크기의 나일론 메쉬를 절단한 후, 용기 위에 메쉬를 덮고 뚜껑으로 눌러 고정하십시오.망이 팽팽하고 뚜껑이 기울어지지 않았는지 확인하십시오. 이제 케이지에 초파리를 넣을 준비가 되었습니다. 1L 플라스틱 병과 18 by 18 cm 나일론 망 사각형을 준비한 후, 망을 병의 윗부분 테두리에 덮고 뚜껑을 돌려 조여 고정하십시오.메쉬가 팽팽한지, 뚜껑이 기울어지지 않았는지 확인하십시오. 표적 단백질을 발현하는 형질전환 초파리 라인을 증식시키십시오. 각 초파리 라인당 25~30개의 병이 모일 때까지 이틀마다 병을 옮겨주십시오.대조군 스톡을 유사한 방식으로 증폭합니다. 다음으로, 사과 주스 플레이트를 실온으로 데웁니다. 그런 다음 장갑을 낀 손가락을 사용하여 젖은 효모 페이스트를 플레이트 중앙에 펴 바릅니다.15 cm 플레이트용으로 약 6 cm 크기의 원을 만들고, 10 cm 플레이트용으로 4 cm 크기의 원을 만듭니다. 초파리를 마취시킨 후, 메쉬가 아래를 향하도록 준비된 케이지에 옮기고, 케이지를 사과 즙 플레이트로 덮습니다.파리가 깨어날 때까지 기다립니다. 그 다음 케이지를 뒤집어 실온에서 2~3일 동안 파리를 배양합니다. 케이지를 거꾸로 뒤집고 플레이트를 케이지에 고정한 상태에서 플레이트의 테이프를 떼어내는 방식으로 하루에 두 번 플레이트를 교체합니다.케이지 전체를 벤치 위에 가볍게 두드린 후, 파리가 탈출하지 않도록 주의하며 기존 플레이트를 새 플레이트로 빠르게 교체하십시오. 파리가 신선한 사과즙 플레이트에 밤새도록, 또는 원하는 시간 동안 배아를 낳도록 둡니다. 다음 날 아침, 배아 수집용 메쉬 컨테이너에 표시를 하고 무게를 잽니다.사용하는 초파리 라인당 하나씩 준비합니다. 이전에 제조한 시약을 사용하여 50 ml 튜브에 5x 농축 Lysis Buffer 10 ml와 물 40 ml를 넣어 1x Lysis Buffer를 조제합니다. 최종 농도가 1 mM이 되도록 1 M DTT 50 µL를 첨가합니다.잘 섞은 후 용액을 두 개의 50 milliliter 튜브에 나누어 담습니다. 튜브 하나에 protease inhibitor 정제 한 알을 추가합니다. 그리고 해당 튜브를 4 °C의 로테이터(rotator)에서 30분 동안 둡니다.정제가 녹는 동안, 사용된 초파리 계통의 유전자형을 케이지의 사과 주스 플레이트에 표시하여 배아 수집을 시작하십시오. 그리고 플레이트를 새것으로 교체하십시오. 각 사과 주스 플레이트가 잠길 정도로 충분한 양의 물을 추가하십시오.그런 다음 부드러운 붓을 사용하여 플레이트에서 배아를 조심스럽게 떼어냅니다. 배아를 미리 무게를 재고 표시해 둔 메쉬 컨테이너에 붓고 과잉수를 배출합니다. 그 후 메쉬를 페이퍼 타월로 짧게 눌러 남은 물기를 제거합니다.배아의 난막을 제거하려면, 6cm 페트리 접시에 50% bleach를 절반 정도 채웁니다. 그런 다음 더 큰 페트리 접시 두 개에 물을 준비합니다. 배아가 들어 있는 메쉬 용기를 50% bleach에 90초 동안 담급니다.배양 중에 메쉬를 두어 번 가볍게 톡톡 쳐서 배아가 표백액에 현탁되도록 합니다. 배양이 끝나면, 두 개의 디쉬에 있는 메쉬 컨테이너를 각각 물로 약 10초 동안 세척합니다. 그런 다음 분무병에 담긴 18.2 megohm centimeter 물을 사용하여 측면과 외부를 포함한 메쉬 컨테이너를 철저히 헹굽니다.철저히 세척한 후에는 표백제 냄새가 나지 않아야 합니다. 페이퍼 타월로 메쉬 컨테이너의 물기를 닦아냅니다. 그런 다음 배아가 들어 있는 메쉬 컨테이너의 무게를 측정하고, 빈 컨테이너의 무게를 뺍니다.결과물인 배아의 무게를 기록합니다. 배아 추출물을 준비하려면, 프로테아제 억제제가 포함된 Lysis Buffer 1 mL를 Dounce 유리 균질기에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 메쉬 용기에서 배아를 균질기로 옮깁니다.1 mL의 Lysis Buffer를 사용하여 메시에 남아 있는 배아를 씻어냅니다. 그 후 배아와 버퍼를 균질기 내의 재료에 추가합니다. 그런 다음 배아가 균질기 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.다음으로, 프로테아제 억제제가 포함된 Lysis Buffer를 균질기에 추가하며, 배아 1g당 5~6mL의 Lysis Buffer가 들어가도록 합니다. 그 다음 헐겁게 맞는 페스틀을 삽입하여 배아를 4~6회 스트로크로 균질화합니다. 처음 몇 번의 스트로크 동안에는 저항이 더 강하게 느껴질 것입니다.용액이 튀는 것을 방지하기 위해 유발봉을 연속적인 동작으로 움직이십시오. 그런 다음 밀착되는 유발봉으로 교체하십시오. 그리고 8~10회 정도 저어 배아를 균질화하십시오.균질물을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 그 다음 균질물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그리고 13,000 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.맨 위 지질층에 있는 펠렛을 피해 상층액을 얼음 위에 놓인 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 반복한 후, 1 mL 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 그리고 0.45 µm 필터가 장착된 냉각된 10 mL 주사기에 옮깁니다.모든 용액을 얼음 위에 둔 라벨이 부착된 2 mL 미세 원심분리 튜브에 옮겨 담습니다. 액체 질소에서 샘플을 급속 냉동한 후 -80 °C에서 보관하십시오. 또는 단백질 정제 실험에 즉시 사용하십시오.본 영상에서 설명한 프로토콜을 사용하여, arm-odillo 프로모터의 제어 하에 EGFP-ERK 단백질을 보편적으로 발현하는 초파리 배아로부터 용해물을 준비하였습니다. 단백질 발현은 총 ERK 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였으며, 각각 42 kilodaltons 및 69 kilodaltons에서 이동하는 내인성 ERK와 형질전환 EGFP-ERK의 수준을 동시에 검출하였습니다. 태그가 없는 내인성 ERK에 해당하는 단일 밴드가 yellow white 대조군 라인에서 검출되어, 배아로부터 ERK 및 EGFP-ERK가 성공적으로 추출되었음을 확인하였습니다.추출 프로토콜이 태그된 단백질의 후속 정제에 적합한지 테스트하기 위해, yellow white 및 arm-EGFP-ERK 파리에서 얻은 추출물을 GFP Agarose Beads를 사용하여 친화성 정제하였습니다. gradient SDS-PAGE로 분석한 샘플의 은 염색 결과, 미끼 단백질인 EGFP-ERK가 성공적으로 정제되었음을 확인하였습니다. EGFP-ERK 외에도 실험군 레인에는 대조군 샘플에서는 관찰되지 않은 추가 밴드들이 포함되어 있었으며, 이는 정제 과정에서 ERK와 상호작용할 가능성이 있는 단백질들이 회수되었음을 시사합니다.배아 수집과 추출 단계에 숙달되면, 약 2시간 만에 모든 과정을 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 추출 단계를 반드시 얼음 위에서 진행해야 하며, 단백질 분해를 최소화하기 위해 프로테아제 억제제(protease inhibitors)를 사용해야 한다는 점에 유의하십시오.이 영상을 시청하고 나면, 중규모의 초파리(Drosophila) 개체군 케이지를 설정하는 방법과 배아로부터 전세포 단백질 추출물을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 sectioning, 고정, 삽입을위한 과정을 설명하고, 늦은 단계의...

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다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

여기에서는 기존의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 초고해상도 이미징을 달성하기 위해 초기 초파리 배아에서 확장 현미경을 구현하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

배우세요 Drosophila 배아 추출물 제작 방법을 통해 중간 규모 프로테옴 실험을 수행하세요. 이 기법은 AP-MS 등 다운스트림 분석에 활용 가능하며, 발달생물학 및 세포 신호전달 연구에 필수적인 단백질 상호작용을 효율적으로 규명합니다.

중간 규모의

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