Name: 전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for In Vivo 소 동물 혈관 조영술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 학습하세요 전환 가능한 음향 및 광학 해상도 광음향 현미경을 이용한 생체 소 동물 혈관 조영술을. 이 방법은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 깊은 조직 저해상도 이미징을 동일한 샘플에서 수행할 수 있어 생물의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 싱가포르 교육부 (ARC2 / 15 : M4020238)에서 후원하는 Tier 2 교부금에 대한 재정 지원을 인정하고자합니다. 저자는 Machine Shop의 도움을 주신 Chow Wai Hoong Bobby에게 감사드립니다.

모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 규정과 지침에 따라 수행되었습니다. 1. AR-OR-PAM 시스템 ( 그림 1 ) <ol><li> 시스템 구성 : AR-PAM <ol><li> 다이오드 조사 방식의 고체 상태 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559-576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템을 광 조사 광원으로 사용하십시오. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 레이저의 반복 속도를 1 kHz로 설정하십시오. </li><li> 가변 레이저 필터 (NDF1, OD = 0-4.0)를 통해 레이저 출력의 5 %를 광 다이오드로 전환하려면 레이저 앞에 45 ° 각도로 빔 샘플러를 배치합니다. </li><li> 90 °에서 빔 샘플러를 사용하여 레이저 빔을 방향 전환합니다.직각 프리즘 (RAP1)을 포함한다. </li><li> 다른 중립 밀도 프리즘 (RAP2)을 사용하여 광 중성 밀도 필터 (NDF2, OD = 0-4.0)와 멀티 모드 광섬유 (MMF)를 통과시켜 파이버 커플러 (FC) -a 목표 조합 (개구 수 (NA) : 0.25) 및 XY 변환기. </li><li> XY 변환기를 사용하여 광섬유를 스캔 스테이지에 고정하십시오. 광섬유 출력 끝에서 25mm 떨어진 평행 볼록 렌즈 (L1)를 배치하여 광섬유에서 빔을 조준합니다. </li><li> 130 °의 정점 각도를 가진 원추형 렌즈를 통해 평행 광선을 통과시켜 고리 모양의 광선을 생성합니다. cone 각이 70 ° 및 110 ° 인 수제 광학 콘덴서 (OC)를 사용하고 중앙에 구멍이있는 링 모양의 빔을 피사체에 약하게 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 집에서 만든 콘덴서의 중앙에 음향 렌즈 (AL)가있는 50 MHz 초음파 변환기 (UST)를 놓습니다. </li></ol></li><li> 시스템 구성 : OR-PAM <ol><li> 사용다이오드 펌핑 된 고체 상태의 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559 - 576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 5 kHz에서 레이저의 반복 속도를 설정하십시오. </li><li> 컴퓨터 제어 회전 스테이지 (RAP1 유지)를 90 ° 회전하여 레이저 빔을 조리개로 돌려 방향을 바꿉니다. </li><li> 빔을 따라 가변 중성 필터 (OD : 0-4.0)를 배치 한 레이저 빔을 감쇄시킨 다음 콘덴서 렌즈 (CL)로 빔을 집중시킵니다. 공간 필터링을 위해 CL에서 75 mm 떨어진 핀홀 (PH)을 통과시킵니다. </li><li> SMF에 광선을 집중시키기 위해 0.1 NA 대물 렌즈로 구성된 단일 모드 광섬유 커플러 (FC)를 사용하여 SMF (단일 모드 광섬유)로 공간 필터링 된 빔을 시작하십시오. </li><li> 최대 커플 링 효율을 얻기 위해 파이버 커플러를 조정하십시오. </li><li> 섬유를 t 위에 고정 시키십시오.그는 슬립 플레이트 (SP)를 사용하여 스테이지를 스캐닝한다. 레이저 빔을 평행하게 만들기 위해 SM 섬유에서 50mm 떨어진 색소 렌즈 (L2)를 놓습니다. </li><li> 또 다른 동일한 무색 렌즈 (L3)의 후면 구경을 채우기 위해 운동 가능한 제어 타원형 거울 (M)을 사용하여 평행 광선을 90 ° 방향 전환하십시오. 렌즈 튜브 (LT)를 사용하여 초점을 맞추는 데 사용되는 무색 렌즈를 번역 마운트 (TM2)에 놓습니다. </li><li> 사이에 실리콘 오일 (SO) 층이있는 직각 프리즘 (RA)과 편평한 프리즘 (RP)으로 구성된 수제 광 음향 빔 결합기를 통해 집속 빔을 전달하십시오. 참고 : 실리콘 오일 층은 광학적으로 투명하고 음향 적으로 반사되는 막 역할을합니다. </li><li> 마름모꼴 렌즈 (AL)를 부착하여 마름모꼴 프리즘의 바닥에 음향 집속 (초점 직경 : ~ 46 μm)을 제공하십시오. </li><li> 마름모꼴 프리즘 상단에 50 MHz 중심 주파수의 초음파 트랜스 듀서를 놓습니다. 효과적인 커플 링을 위해 에폭시 층을 사용하십시오. </li></ol></li></ol&gt; 2. 시스템 스위칭 및 정렬 <ol><li> 수제 전환 가능한 플레이트를 컴퓨터에 연결된 3 축 컨트롤러로 제어되는 3 축 전동 스테이지에 고정 (단단히 조여서). </li><li> 케이지 마운팅 브래킷을 사용하여 AR 및 OR 케이지 시스템을 홈 메이드 플레이트에 부착하면 AR 및 OR 스캔 헤드를 쉽게 전환 할 수 있습니다. 스캔 헤드를 이미징 영역의 위쪽으로 밉니다. </li><li> AR-OR-PAM 스캐너 헤드의 바닥 부분을 음향 결합을 위해 물이 채워진 아크릴 탱크 (13 cm x 30 cm x 3 cm)에 잠기 게하려면 Z- 스테이지를 사용하십시오. </li><li> 탱크 바닥 판에 직경 7cm의 이미징 창을 열고 광학 및 음향 전달을 위해 폴리에틸렌 막으로 밀봉하십시오. </li><li> 펄스 변환기 및 오실로스코프를 사용하여 초음파 변환기에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 송신 / 수신 모드에서 펄스 에코 증폭기의 이득을 24dB로 설정하십시오. </li><li> 싱크 아웃 신호 fr 사용펄스 에코 증폭기를 트리거로 사용하고 오실로스코프를 사용하여 유리 슬라이드 (물 탱크의 바닥에서 삽입)에서 후방 산란 신호를 감지합니다. 참고 : 슬라이드에는 검정색 테이프가 붙어 있어야합니다. </li><li> Z 축을 이동하여 펄스 에코 신호의 진폭을 최대화하십시오 (오실로스코프에서 확인). 참고 : 유리판에 초점이 맞춰지면 에코의 진폭은 최대가됩니다. </li></ol></li><li> 레이저를 켜고 UST를 BNC 케이블을 사용하여 각각 24dB 고정 게인의 두 개의 앰프에 연결하십시오. 참고 : 앰프의 출력은 데이터 수집 카드 (DAQ)에 연결됩니다. </li><li> 레이저 앞에있는 포토 다이오드 (PD)의 신호를 데이터 수집 시스템의 트리거로 사용하십시오. </li><li> AR-PAM에서 원추형 렌즈 (con.L)와 광학 응축기 (OC) 사이의 거리를 변경하여 검사 대상에서 생성 된 광 음향 신호의 진폭을 최대화하십시오 (유리 슬라이드에 검은 색 테이프가 붙음).최대 광 음향 (PA) 신호 진폭을 결정하여 광학 및 음향 초점이 공 초점인지 확인하십시오. <ol><li> 최대 PA 신호의 지연을 확인하십시오. 나중에 이것을 사용하여 데이터 수집 소프트웨어의 포커스를 확인하십시오. </li></ol></li><li> 스캐닝 헤드의 나사를 풀고 스캐닝 헤드를 수동으로 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오. 그런 다음 나사를 조이십시오. </li><li> OR-PAM에서 오실로스코프에 표시된 PA 신호 진폭을 최대화하려면 초점 무색 이중 복사 (렌즈 튜브 (LT) 내부)와 광 음향 합성기 사이의 거리를 변경하십시오. <ol><li> 최대 PA 신호의 지연에 유의하십시오. 참고 : 공 초점 배열을 결정하기 위해서는 파인 튜닝이 필요합니다. </li></ol></li></ol> 3. 실험 단계 <ol><li> 횡 해상도 및 영상 깊이 정량화 <ol><li> 직경 100 nm의 금 나노 입자를 사용하여 AR의 횡 방향 해상도를 결정합니다.d OR 시스템. </li><li> 동량의 물로 0.1 mL의 나노 입자 용액을 희석한다. 희석 된 용액 0.1 mL를 커버 슬립에 분배하고 탱크 아래의 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉시킨다. </li><li> 스캐닝 (단계 2.8 및 2.10) 전에 AR-PAM 및 OR-PAM이 데이터 수집 소프트웨어 (재료 표 참조)에 포커스가 있는지 확인하십시오. 참고 : 2.9 및 2.10 단계에서 샘플링 속도 (250 MS / s)를 곱한 최대 PA 신호의 마이크로 초 지연을 알면 이미지가 데이터 수집 소프트웨어에서 초점을 맞 춥니 다. 데이터 수집 중에 생략해야하는 지연은 후 처리를 위해 필요한 데이터 포인트 만 저장하도록 소프트웨어에서 결정될 수 있습니다. </li><li> AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다. <ol><li> 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도&quot;에서 &quot;4&quot;mm / s 스캐닝 속도로 설정합니다.; 탭, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm, &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;4&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복률 (이 경우 4,000 μm / 1,000 Hz = 4 μm)에서 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오. <ol><li> &quot;속도&quot;탭의 &quot;2.5&quot;mm / s 스캐닝 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭의 &quot;5&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;탭의 &quot;0.5&quot;mm에서 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭, &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;0.5&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : sy 방향의 tep 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 2,500 μm / 5,000 Hz = 0.5 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> 스캔하는 동안 데이터가 지속적으로 캡처되어 컴퓨터에 저장되는지 확인하십시오. 참고 : 데이터는 Y 스테이지의 한 방향으로 만 캡처됩니다. </li><li> 컴퓨터에 저장된 다중 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 최대 진폭 투영 (MAP) 이미지를 검색합니다. </li><li> 스캐닝의 단일 나노 입자 이미지 (여러 이미지 중 하나)를 사용하여 나노 입자 이미지의 중앙 영역을 가로 지르는 선을 수동으로 플롯하여 횡 방향 해상도를 결정하여 가우스 곡선과 같은 점 분산 기능을 얻습니다. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> Gau를 사용하여 단일 나노 입자 이미지에서 얻은 점 분산 함수를 맞추십시오.이미지 보정 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 반값 폭 (FWHM)을 측정합니다. 이것을 가로 해상도로 사용하십시오. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 깊이 이미징의 대상 개체로 얇게 썬 닭고기 조각에 검은 테이프 조각을 비스듬히 삽입합니다. 테이프가있는 티슈를 물 탱크에 넣으십시오. 참고 : 검은 테이프는 조직에 테이프를 부착하는 데 도움이되는 날카로운 팁이있는 금속판에 붙어 있습니다. </li><li> AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 데이터 수집 소프트웨어에 설정 한 다음 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 깊이를 결정합니다. <ol><li> &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;Y 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;5&quot;cm, &quot;0.1&quot; &quot;mm&quot; &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서. 세트그는 &quot;dx&quot;탭에서 &quot;0.1&quot;mm에서 x 방향의 스텝 크기를 나타냅니다. </li></ol></li><li> OR-PAM의 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 부서를 결정합니다. <ol><li> &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;5&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;에서 &quot;2&quot;cm로 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭과 &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.1&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;0.1&quot;mm로 설정하십시오. 참고 : X- 스캔 범위와 dx는 동일하므로 하나의 B- 스캔 만 캡처됩니다. 연조직 (1,540m / s)에서의 소리의 속도를 곱한 시간 분해 PA 신호는 A- 라인 이미지를 제공합니다. B- 스캔을 생성하기 위해 Y- 스테이지의 연속 동작 중에 여러 개의 A- 라인이 캡처됩니다. </li></ol></li></ol></li><li> 생체 내 &lt;/ em&gt; 마우스 귀 혈액 혈관계 영상 <ol><li> 몸무게가 25g이고 4 주령의 암컷 마우스를 사용하십시오. </li><li> 복강 내 투여 된 ketamine (120 mg / kg)과 xylazine (16 mg / kg)의 칵테일 (0.1 mL / 10 g의 복용량)을 사용하여 동물을 마취. </li><li> 제모 크림을 사용하여 동물의 귀에서 머리카락을 제거하십시오. 청소 부분을 닦으십시오. 흩어져있는 레이저 빔이 눈에 떨어지는 것을 방지하기 위해 멸균 된 안구 연고로 동물의 눈을가립니다. </li><li> 귀를 위치시키는 소형 플레이트가있는 무대에 동물을 배치하십시오. </li><li> 촬영 기간 동안 흡입 된 isoflurane (1L / min 산소에서 0.75 %)로 마취를 유지하십시오. </li><li> 맥박 산소 측정기를 마우스 다리 또는 꼬리에 고정시키고 생리적 상태를 모니터하십시오. 이미징 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 막과 접촉하도록하십시오. </li><li> AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다ing. <ol><li> 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캐닝 속도, &quot;펄스 반복률&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;10&quot; Y- 스캔 범위 &quot;탭에서&quot;6mm &quot;를 선택합니다. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;30&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 1,000 Hz = 15 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> AR-PAM 스캔을 완료 한 후, 이미징 헤드 위치를 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오 (2 절에서 설명). </li><li> OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오. <ol><li> &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도로 데이터 수집 소프트웨어의 OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도「Y- 스캔 범위」탭의 「10 mm」, 「X- 스캔 범위」탭의 「6」mm의 순서로 「스텝」사이즈를 설정합니다. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향으로 &quot;6&quot;μm로 표시됩니다. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 5,000 Hz = 2 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> 컴퓨터에 저장된 여러 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 MAP 이미지를 검색합니다. </li><li> 전체 이미징 기간 동안 동물을 관찰하십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 저자는 원고에 관련있는 금전적 이해 관계가없고 공개 할 다른 잠재적 인 이해 상충은 없다.

결론적으로, 낮은 이미징 깊이에서 고해상도 이미징과 높은 이미징 깊이에서 저해상도 이미징을 모두 수행 할 수있는 전환 가능한 AR 및 OR PAM 시스템이 개발되었습니다. 전환 가능한 시스템의 측 해상도와 영상 깊이가 결정되었습니다. 이 전환 가능한 PAM 시스템의 장점은 다음과 같습니다. (1) 엄격한 광학 초점을 사용하는 고해상도 이미징. (2) 음향 집속을 이용한 심 조직 영상; 3) 강력한 PA 신호가 피부 표면에 나타나는 것을 방지하는 AR-PAM의 암시 야 조명. 4) 서로 다른 시스템 사이에서 샘플을 옮기지 않고 한 장소에 샘플을 보관할 수있는 능력. 5) 다중 레이저 및 스캐닝 스테이지의 사용을 피할 수있는 가능성; 6) 수제 성분의 최소 사용. 이것은 샘플 / ob을 움직이지 않고 동일한 샘플의 고해상도, 얕은 깊이 이미지 및 저해상도, 심 조직 이미지를 제공하는 OR-PAM과 암시 야 AR-PAM의 최초보고 된 조합입니다ject. 동일한 스캐닝 스테이지와 레이저를 사용하면 시스템을 효율적이고 비용 효율적으로 ...

광학 결맞음 단층 촬영, 공 촛점 현미경 검사 및 다 광자 현미경 검사와 같은 고해상도 광학 이미징 양식은 많은 이점을 가지고 있습니다. 그러나 공간 해상도는 이미징 깊이가 증가함에 따라 크게 감소합니다. 이것은 연조직 1 , 2 에서의 빛 전달의 확산 성 때문입니다. 광학 여기와 초음파 검출의 통합은 깊은 조직에서의 고해상도 광학 이미징의 과제를 극복 할 수있는 솔루션을 제공합니다. Photoacoustic microscopy (PAM)는 다른 광학 이미징 양식보다 더 깊은 이미징을 제공 할 수있는 하나의 모달입니다. 그것은 성공적으로 생체 내 구조, 기능, 분자 및 세포 이미징에 적용되었습니다 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup강한 광 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 결합하여&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 연구를 수행했습니다. PAM에서 짧은 레이저 펄스가 조직 / 샘플을 조사합니다. 발색단 ( 예 : 멜라닌, 헤모글로빈, 물 등 )에 의한 빛의 흡수는 온도 상승을 일으키며 결과적으로 음향 파 (photoacoustic waves)의 형태로 압력 파를 생성합니다. 생성 된 광 음파는 조직 경계 외부의 광대역 초음파 변환기로 감지 할 수 있습니다. 약한 광학 및 타이트한 음향 집속을 이용하여 음향 해상도 광 음향 현미경 (AR-PAM) 14 , 15 , 16 에서 심 조직 영상을 얻을 수 있습니다. AR에서-PAM, 45 μm의 수평 해상도 및 3 mm까지의 이미징 깊이가 시연되었습니다. 단일 모세관 (~ 5 μm)을 음향 적으로 해결하려면 400 MHz 이상의 중심 주파수에서 작동하는 초음파 변환기가 필요합니다. 이러한 높은 주파수에서, 침투 깊이는 100μm 미만이다. 단단한 음향 집속으로 인한 문제는 엄격한 광학 집속을 사용하여 해결할 수 있습니다. 광학 해상도 광 음향 현미경 (OR-PAM)은 단일 모세관 또는 단일 셀 17 을 분해 할 수 있으며 0.5 μm의 횡 분해능은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24에 이릅니다 . 광자 나노 젯 (photonic nanojet)을 사용하면 회절 한계 해상도 이상의 해상도를 얻을 수 있습니다.n 25 , 26 . OR-PAM에서, 침투 깊이는 집속 (light focusing)으로 인해 제한되며, 생물학적 조직 ( 23) 내부에서 ~ 1.2mm까지 이미지 할 수 있습니다. 따라서 AR-PAM은 해상도는 더 높지만 해상도는 더 낮을 수 있으며 OR-PAM은 매우 높은 해상도로 이미지를 만들 수 있지만 이미지 깊이는 제한적입니다. AR 및 OR-PAM 시스템의 이미징 속도는 주로 레이저 소스 ( 27) 의 펄스 반복 속도에 의존한다. AR-PAM과 OR-PAM을 결합하면 고해상도와 깊은 이미징을 모두 요구하는 어플리케이션에 큰 도움이됩니다. 이 시스템들을 결합하기위한 노력은 거의 없었다. 일반적으로 이미징에는 2 개의 서로 다른 이미징 스캐너가 사용되므로 샘플을 두 시스템간에 이동해야하므로 생체 내 이미징을 수행하기가 어렵습니다. 그러나 AR 및 OR PAM 모두를 사용한 하이브리드 이미징을 사용하면 확장 가능한 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다.깊이. 하나의 접근법에서, AR 및 OR PAM 모두에 광을 전달하기 위해 광섬유 번들이 사용된다. 이 접근법에서는 2 개의 개별 레이저 (AR의 경우 570 nm의 고 에너지 레이저와 OR의 경우 532 nm의 저에너지, 높은 반복 속도의 레이저)가 사용되어 시스템이 불편하고 고비용이되었습니다. OR-PAM 레이저 파장은 고정되어 있으며 산소 포화도와 같은 많은 연구는이 결합 시스템을 사용하여 가능하지 않습니다. AR과 OR PAM 사이의 비교 연구는 AR과 OR 사이의 레이저 파장 차이 때문에 가능하지 않습니다. 또한 AR-PAM은 명 시야 조명을 사용합니다. 따라서 피부 표면의 강력한 광 음향 신호가 이미지 품질을 제한합니다. 이러한 이유로이 시스템은 많은 바이오 이미징 응용 프로그램에 사용할 수 없습니다. AR 및 OR PAM을 수행하는 또 다른 접근법에서는 광학 및 초음파 초점이 이동되어 광 초점 및 초음파 초점이 정렬되지 않습니다. 따라서 이미지 품질이 최적이 아닙니다. <sup class = &quot;xref&quot;&gt; 29. 이 기술을 사용하여 AR-PAM 및 OR-PAM은 각각 139 μm 및 21 μm의 해상도를 얻을 수 있기 때문에 해상도가 낮은 시스템입니다. 광섬유 및 시준 광학을 변경하는 것을 포함하는 또 다른 접근 방식은 AR과 OR PAM 사이를 전환하여 정렬 프로세스를 어렵게 만드는 것으로보고되었습니다 30 . 이 모든 경우에 AR-PAM은 암시 야 조명을 사용하지 않았습니다. 암시 야 조명을 사용하면 피부 표면에서 강한 광 음향 신호가 생성되는 것을 줄일 수 있습니다. 따라서 깊은 광 음향 신호의 검출 감도가 명 시야 조명의 감도보다 높기 때문에 링 모양의 조명을 사용하여 심 조직 촬영을 수행 할 수 있습니다. 이 연구는 동일한 레이저 및 스캐너를 사용하여 동일한 샘플을 고해상도 이미징 및 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 전환 가능한 AR 및 OR PAM (AR-OR-PAM) 이미징 시스템을보고합니다.ems. AR-OR-PAM 시스템의 성능은 가상 실험을 사용하여 공간 해상도와 영상 깊이를 결정함으로써 특성화되었습니다. 생체 내 혈액 vasculature 이미징은 생물 학적 이미징 능력을 입증하기 위해 마우스 귀에 수행되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Q-switched Nd:YAG 레이저</td><td>Edgewave</td><td>BX80-2-L</td><td>펌프 레이저&nbsp;</td></tr><tr><td>Credo-High Repetition Rate Dye Laser</td><td>Spectra 물리학</td><td>CREDO-DYE-N</td><td>염료 레이저</td></tr><tr><td>정밀 선형 스테이지</td><td>물리 기기</td><td>PLS 85&nbsp;</td><td>XY 래스터 스캐닝 스테이지</td></tr><tr><td>번역 스테이지</td><td>Physik Instrumente</td><td>VT 80&nbsp;</td><td>컨포칼 결정</td></tr><tr><td>장착된 실리콘 포토다이오드</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PD1A</td><td>트리거링/펄스 변동</td></tr><tr><td>모터화된 연속 회전 스테이지&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>CR1/M-Z7</td><td>전환 레이저 빔</td></tr><tr><td>장착 연속 가변 ND 필터</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>강도 가변</td></tr><tr><td>섬유 패치 케이블</td><td>Thorlabs</td><td>M29L01</td><td>멀티모드 섬유</td></tr><tr><td>현미경 목표</td><td>Newport</td><td>M-10X</td><td>목표&nbsp;</td></tr><tr><td>XY 변환 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td>변환 마운트</td></tr><tr><td>Plano 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LA1951</td><td>Collimating lens</td></tr><tr><td>Conical lens&nbsp;</td><td>Altechna</td><td>APX-2-B254</td><td>링 모양 빔</td></tr><tr><td>번역 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>CT1</td><td>변환 스테이지</td></tr><tr><td>광학 콘덴서</td><td>홈 메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 트랜스듀서</td><td>Olympus-NDT</td><td>V214-BB-RM</td><td>50MHz 트랜스듀서</td></tr><tr><td>Plano 오목 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LC4573</td><td>음향 렌즈</td></tr><tr><td>펄서/수신기</td><td>Olympus-NDT</td><td>5073PR</td><td>펄스 에코 증폭기&nbsp;</td></tr><tr><td>장착 된 표준 아이리스</td><td>Thorlabs</td><td>ID12 / M</td><td>빔 형성</td></tr><tr><td>Plano 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LA4327</td><td>집광 렌즈</td></tr><tr><td>장착 정밀 핀홀</td><td>Thorlabs</td><td>P50S</td><td>공간 필터링</td></tr><tr><td>단일 모드 광섬유 패치 케이블</td><td>Thorlabs</td><td>P1-460B-FC-1</td><td>단일 모드</td></tr><tr><td>광섬유 커플러</td><td>Newport</td><td>F-91-C1</td><td>단일 모드 커플 링</td></tr><tr><td>무채색 이중선 렌즈</td><td>Edmund Optics</td><td>32-317</td><td>무채색 이중선</td></tr><tr><td>보호 실버 타원형 미러</td><td>Thorlabs</td><td>PFE10-P01</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>직각 키네마틱 미러 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>미러 마운트</td></tr><tr><td>Z축 변환 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>z 변환기</td></tr><tr><td>렌즈 튜브</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>SM05L10</tr><tr><td>UV 용융 실리카 직각 프리즘</td><td>Thorlabs</td><td>PS615</td><td>직각 프리즘</td></tr><tr><td>마름모 프리즘</td><td>Edmund Optics</td><td>47-214</td><td>전단파</td></tr><tr><td>디메틸 폴리 실록산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>DMPS1M</td><td>실리콘 오일</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>미니 회로</td><td>ZFL-500LN</td><td>증폭기</td></tr><tr><td>16 비트 고속 디지타이저</td><td>스펙트럼</td><td>M4i.4420</td><td>데이터 수집 카드</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Agilent Technologies</td><td>DS06014A</td><td></td></tr><tr><td>마우스&nbsp;</td><td>InVivos Pte.Ltd</td><td>ICR</td><td>동물 모델</td></tr><tr><td>초음파 젤&nbsp;</td><td>프로그레스 / 파커 아쿠아 소닉 젤</td><td>PA-GEL-CLEA-5000</td><td>음향 커플 링</td></tr><tr><td>물 탱크</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>번역 무대</td><td>수제</td><td></td><td>스위칭 AR-OR</td></tr><tr><td>골드 나노 입자</td><td>시그마 알드리치</td><td>742031</td><td>측면 해상도</td></tr><tr><td>멸균 안구 연고</td><td>Alcon</td><td>Duratears</td><td>동물 이미징</td></tr><tr><td>1951 USAF 해상도 테스트 대상</td><td>Edmund Optics</td><td>38257</td><td>컨포칼 정렬</td></tr><tr><td>데이터 수집 소프트웨어</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Home은 Labview</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어를</td> 사용하여 만든 소프트웨어 <td>Mathworks</td><td>Matlab</td><td>Home은 Matlab을 사용하여 프로그램을 만들었습니다</td></tr></tbody></table>.

전환 가능한 음향 및 광학 해상도 photoacoustic microscopy for<em&gt; in vivo</em&gt; 소 동물 혈관 조영술

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM)는 광학 및 초음파를 모두 결합한 빠르게 성장하는 인비 보 이미징 양식으로 고해상도 의 광학 평균 자유 경로 (~ 1 mm 피부)를 넘어서는 침투를 제공합니다. 광학 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 단일 양식으로 결합함으로써이 기술은 심부 조직을 투과 할 수 있습니다. 광 음향 현미경 검사 시스템은 음향 해상도가 낮고 탐침 깊이가 크거나 광학 해상도가 높고 탐침을 얕게 가질 수 있습니다. 단일 시스템으로 높은 공간 해상도와 큰 깊이의 침투를 달성하는 것은 어려운 일입니다. 이 작품은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 생체 내 동일한 샘플의 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 AR-OR-PAM 시스템을 제시합니다. 음향 집속을 사용하여 광학 집속을 사용하는 1.4 mm 이미징 깊이와 7.8 mm 이미징 깊이로 45 μm의 측면 해상도를 사용한 4 μm의 측면 해상도결합 된 시스템을 사용하여 시연되었습니다. 여기서 생체 내 소 동물 혈관 조영술은 생물학적 이미징 능력을 입증하기 위해 수행됩니다.

AR-OR-PAM 시스템의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 이 설정에서 모든 구성 요소는 광학 케이지 설정에서 통합되고 조립되었습니다. 케이지 시스템을 사용하면 AR-OR-PAM 스캐닝 헤드를 소형으로 만들 수 있으며 단일 조립 단계로 쉽게 조립, 정렬 및 통합 할 수 있습니다. 이미지 획득 중에 이미징 헤드의 2 차원 연속 래스터 스캐닝이 사용되었습니다. 시간 - 분해 된 PA 신호는 소리의 속도 (1,540 m / s)로 곱해 져서 A- 라인을 얻습니다. Y- 스테이지의 연속 동작 중에 캡처 된 여러 개의 A- 라인은 2 차원 B- 스캔을 생성했습니다. 이미징 영역의 여러 B- 스캔을 캡처하여 컴퓨터에 저장하고 MAP 광 음향 이미지를 처리하고 생성하는 데 사용되었습니다. <p class="j...

여기에는 생체 내 동일한 샘플 에서 심도 깊은 곳에서의 고해상도 이미징과 저해상도 깊은 조직 이미징이 가능한 스위칭 가능한 음향 해상도 (AR) 및 광학 해상도 (OR) 광 음향 현미경 (AR-OR-PAM) 시스템이 시연됩니다.

전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In Vivo</em&gt; 소 동물 혈관 조영술

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내 소동물 혈관 영상화를 위한 전환 가능한 음향 및 광학 해상도 광음향 현미경 시스템을 시연하는 것입니다. 광음향 현미경은 광학과 초음파를 결합하여 광학 경로 이상의 영상 깊이를 고해상도로 제공하는 빠르게 성장하는 생체 내 영상 기법입니다. 본 연구에서는 동일한 생체 시료에 대해 얕은 깊이에서의 고해상도 영상화와 더불어 심부 조직의 저해상도 영상화가 가능한 전환식 음향 및 광학 해상도 광음향 현미경 시스템을 제시합니다.시연은 제 실험실의 연구원인 Dr. Mohesh Moothanchery와 박사 과정 학생인 Arunima Sharma가 진행하겠습니다. 먼저, 다이오드 펌핑 고체 Nd:YAG 레이저와 559에서 576 나노미터 범위의 이중 가변 레이저를 사용하여 나노초 가변 레이저 시스템을 구축하십시오. 이중 가변 레이저를 570 nm로 설정하십시오.바닥면에 7cm 폴리에틸렌 이미징 창이 있는 아크릴 탱크를 광학 테이블 위에 설치합니다. 이미징 창 아래의 광학 포스트에 이미징 스테이지를 고정합니다. 탱크 위에는 컴퓨터 제어 3축 전동 이동 스테이지에 고정된 스위칭 플레이트 위에 AR-OR-PAM 이미징 시스템이 포함된 광학 케이지를 장착합니다.AR-PAM을 위해 시스템을 구성하려면, 전동 연속 회전 스테이지에 장착된 직각 프리즘을 사용하여 빔을 가변 중성 밀도 필터를 통해 25 NA 파이버 커플러가 있는 멀티모드 파이버 케이블로 유도하십시오. 파이버 출력을 이미징 시스템의 XY 이동 스테이지에 연결하십시오. 출구에서 25 millimeters 떨어진 지점에 평볼록 렌즈를 배치하여 빔을 통과시킨 다음, 원추형 렌즈를 통과시켜 링 모양의 빔을 생성하십시오.링 형태의 빔을 트랜스듀서 출력단에 음향 렌즈가 장착된 약 50 megahertz 초음파 트랜스듀서 주변의 광학 콘덴서에 집중시킵니다. 다음으로, OR-PAM을 위해 시스템을 구성하려면 첫 번째 직각 프리즘을 90도 회전시켜 레이저 빔이 아이리스, 가변 중성 밀도 필터, 콘덴서 렌즈 및 콘덴서 렌즈에서 75 millimeters 떨어진 지점에 설치된 핀홀을 통과하도록 유도합니다. 1 NA 단일 모드 파이버 커플러와 단일 모드 파이버를 사용하여 빔을 이미징 시스템의 Z축 이동 스테이지로 전송합니다.파이버 출력단에서 50 millimeters 떨어진 곳에 설치된 색지움 이중렌즈(achromatic doublet lens)를 통해 빔을 통과시킵니다. 키네마틱 제어가 가능한 타원형 거울을 사용하여 빔을 렌즈 튜브 내의 두 번째 색지움 이중렌즈로 굴절시킵니다. 빔을 직각 프리즘에 초점을 맞추는데, 이 프리즘은 실리콘 오일 층으로 마름모꼴 프리즘과 분리되어 있으며, 마름모꼴 프리즘에는 음향 렌즈와 50 megahertz 초음파 트랜스듀서가 부착되어 OR-PAM 스캐닝 헤드를 구성합니다.시스템 정렬을 시작하기 전, 아크릴 탱크를 탈기수로 채웁니다. 그런 다음 3축 전동 스테이지를 사용하여 스캐닝 어셈블리를 탱크 위로 이동시킵니다. 두 시스템의 초음파 렌즈가 잠길 때까지 어셈블리를 내립니다.레이저를 켭니다. 초음파 트랜스듀서를 두 개의 25-decibel 고정 이득 증폭기에 연결합니다. AR-PAM 스캐닝 헤드를 이미징 창 위에 배치합니다.검은색 전기 테이프로 감싼 유리 슬라이드를 이미징 스테이지 위에 놓고, 스테이지를 올려 슬라이드가 이미징 창에 닿게 합니다. 슬라이드에서 생성되는 광음향 신호 진폭이 최대가 될 때까지 원추형 렌즈를 조정하여 광학 렌즈와 음향 렌즈가 공초점이 되도록 합니다. 그 다음 수동으로 OR-PAM 시스템으로 전환합니다.테이프로 덮인 슬라이드에서 광음향 신호 진폭이 최대가 될 때까지 색수차 보정 렌즈(achromatic doublet lens)를 조정하여 광학 렌즈와 음향 렌즈가 공초점이 되도록 합니다. 각 시스템의 가로 해상도를 결정하려면, 먼저 100 nanometer 금 나노입자가 물에 희석된 용액 1 milliliter를 커버 슬립 위에 놓습니다. 해당 슬라이드를 이미징 스테이지 위에 배치하십시오.나노입자 용액이 이미징 윈도우에 닿을 때까지 스테이지를 올립니다. 레이저와 스캐닝 헤드를 AR-PAM 시스템으로 전환합니다. 기기 소프트웨어를 AR-PAM 스캔 설정으로 구성하고 단일 래스터 스캔을 수행합니다.이 과정을 OR-PAM 시스템에 대해 반복하십시오. 그런 다음 슬라이드를 제거하고 알코올 솜으로 이미징 창을 닦아내십시오. 획득한 이미지로부터 결정된 점 퍼짐 함수를 가우시안 곡선에 피팅하십시오.반치폭(FWHM)은 해당 스캐닝 시스템의 가로 해상도입니다. 다음으로, 조직 내 최대 영상 깊이를 결정하기 위해, 먼저 검은색 테이프로 감싼 날카로운 금속판을 닭 조직의 작은 부분에 얕은 각도로 삽입하십시오. 조직을 스캐너 헤드 아래의 수조에 배치하십시오.각 시스템에 대해 단일 B-스캔 이미지를 획득합니다. 검은색 테이프가 더 이상 명확하게 식별되지 않는 조직 표면 아래의 깊이를 측정합니다. 이미징 전, 폴리에틸렌 이미징 윈도우와 동물 이미징 스테이지가 모두 깨끗한지 확인하십시오.그 다음, 마우스를 마취시킨 후 영상 촬영 절차를 위해 4주령의 25g 암컷 마우스를 준비합니다. 제모 크림을 사용하여 귀 표면의 털을 제거합니다. 건조를 방지하고 산란되는 레이저 빔을 차단하기 위해 마우스의 눈에 멸균 안연고를 도포합니다.촬영할 귀를 고정하는 플레이트가 있는 이미징 스테이지 위에 마우스를 놓습니다. 마우스의 꼬리나 다리에 펄스 옥시미터를 부착하여 생리적 상태를 모니터링합니다. 촬영할 귀에 초음파 겔을 도포합니다.이미징 스테이지를 천천히 올려 귀가 폴리에틸렌 이미징 창에 부드럽게 접촉하도록 합니다. 실험 전체 과정 동안 마우스의 생리적 상태를 모니터링하며 마우스 귀의 AR-PAM 및 OR-PAM 래스터 스캔 영상을 획득합니다. 이미징 후에는 마우스가 완전히 회복될 때까지 둡니다.여기서는 전환 가능한 AR-OR-PAM 시스템을 사용하여 마우스의 혈관계를 생체 내(in vivo)에서 촬영하였습니다. AR-PAM 이미지에서는 45 µm보다 두꺼운 혈관이 뚜렷하게 관찰되었습니다. OR-PAM 이미징으로는 너비가 약 5 µm인 단일 모세혈관까지 분해하여 확인할 수 있었습니다.결합된 AR-OR-PAM 시스템은 약 4 µm의 횡방향 해상도를 가집니다. 또한 OR-PAM의 경우 0.4 mm 깊이까지 이미징이 가능하며, AR-PAM의 경우 약 45 µm의 횡방향 해상도와 7.8 mm 깊이의 이미징이 가능합니다. 전환 가능한 결합 AR-OR-PAM 시스템을 통해 서로 다른 이미징 시스템 간에 시료를 이동시키지 않고도 이미징을 수행할 수 있습니다.개발된 시스템은 전임상 영상 촬영에 사용될 수 있습니다. 주요 전임상 응용 분야로는 안드로게네시스(androgenesis), 종양 미세환경, 미세혈류, 약물 반응, 뇌 기능, 바이오마커 및 유전자 활성 영상 촬영이 포함됩니다.

switchable-acoustic-optical-resolution-photoacoustic-microscopy-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

광학 해상도 photoacoustic 현미경 (또는 - PAM)는 영상 광학 흡수 능력이 새로운 기술을...

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Photoacoustic 안과 (PAOM), 광 - 흡수 기반 이미징 양상은 현재 안과 이미징 기술로 망막의 보완 평가를 제공합니다. 우리는 쥐의 동시 multimodal 망막 이미징을위한 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영의 (SD -10 월)와 통합 PAOM의 사용을보고합니다.

통합 Photoacoustic Ophthalmoscopy 및 스펙트럼 도메인 광 결맞음 단층 촬영 장치

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

본 연구는 쥐의 뇌에서 비침습적 고주파 초음파 및 광음향 기반 이미징을 수행하여 동물의 두개골에 자연적으로 존재하는 두개골 구멍에 신호를 전달하여 깊은 피질 하 영역과 혈관 패턴을 효율적으로 시각화하는 새로운 프로토콜을 설명합니다.

비 침습적 실질, 혈관 및 대사 고주파 초음파 및 광 음향 쥐 뇌 심부 이미징

소형 동물에서의 고속 생체 내 뇌 이미징을위한 소형 펄스 레이저 다이오드 기반 광 음향 단층 촬영 (PLD-PAT) 시스템이 시연되었습니다.

다음을위한 고성능 컴팩트 광 음향 단층 촬영 시스템<em&gt; In Vivo</em&gt; 소형 동물 뇌 영상

이미징 시스템 임상 휴대용 photoacoustic 실시간 비-침략 적 작은 동물 영상에 대 한 시연 됩니다.

휴대용 임상 Photoacoustic 실시간 비-침략 적 작은 동물 이미징을 위한 이미징 시스템

이 원고 소설 설정과 운영 photoacoustic 현미경와 토끼 같은 더 큰 동물의 비 침범 성, 레이블 없는 chorioretinal 이미징 광학 일관성 단층 촬영 듀얼 모달 시스템의 절차에 설명 합니다.

살아있는 토끼 눈에 소설 Photoacoustic 현미경 및 광학 일관성 단층 촬영 듀얼 적임 Chorioretinal 이미징

소형 펄스 레이저 다이오드 기반 데스크탑 광 음향 단층 촬영 (PLD-PAT) 시스템은 작은 동물 대뇌 피 질의 맥 관 구조의 고속 동적 생체 내 이미징에 대해 입증 되었습니다.

쥐 대뇌 피 질의 혈관 구조에서 염료의 세척 및 세척을 모니터링 하기 위한 펄스 레이저 다이오드 기반 데스크탑 광 음향 단층 촬영

이중 래스터 스캐닝 광음향 이미저를 설계하여 와이드 필드 이미징과 실시간 이미징을 통합했습니다.

혈관 시각화를 위한 이중 래스터 스캐닝 광음향 소형 동물 이미지

수술 마진 분석을 위해 수술 중 조직학적 이미지를 제공할 수 있는 고속 및 개방형 자외선 광음향 현미경이 시스템 구성, 광학 정렬, 샘플 준비 및 실험 절차를 포함하여 시연됩니다.

딥 러닝의 지원을 받는 가상 염색을 통한 조직학적 이미징을 위한 고속 자외선 광음향 현미경 검사

본 프로토콜은 생체내 인간 피부 혈관구조의 다중 스펙트럼 광음향 이미지의 획득을 설명한다. 여기에는 기능 분석을 위한 관심 발색단으로 간주되는 헤모글로빈과 멜라닌의 정량화가 포함됩니다.

혈관 연구의 기능적 이미징을 위한 다중 스펙트럼 광음향 단층 촬영

학습하세요 전환 가능한 음향 및 광학 해상도 광음향 현미경을 이용한 생체 소 동물 혈관 조영술을. 이 방법은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 깊은 조직 저해상도 이미징을 동일한 샘플에서 수행할 수 있어 생물의학 연구에 활용됩니다.

전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for

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