Name: 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 학습하세요 단백질 기반 하이드로겔의 3차원 구조를 조작하여 세포 배양에 적합한 다공성 매트릭스를 만드는 방법을. RGD 펩타이드 기능화와 동결 건조 기법을 활용하여 세포 부착 및 증식을 촉진하는 최적화된 생체 재료를 개발할 수 있습니다.

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저자는 바 덴-뷔르템베르크 재단 "Bioinspired 소재 합성" 프레임 워크 (BioMatS-14)에 그들의 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1. 하이드로 겔 준비
<ol>
	<li>BSA의 200 mg 이온된 H2O를 20% (w/v) BSA 주식 (재고 솔루션 A)을 만드는의 1 mL와 함께 믹스.</li>
	<li>THPC 솔루션 (134 mg/mL)의 이온된 수를 만드는 THPC의 4.835 mL와 혼합 165 µ L 재고 솔루션 (재고 솔루션 B).</li>
	<li>KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) 펩 티 드 (또는 동등한 세포 접착 펩 티 드)의 1 밀리 그램의 무게 그리고 살 균 H2O 10 mg/mL 해결책 (재고 솔루션 C)를 100 µ L에 희석. 참고:이 단계는 선택 사항이 고만 경우는 히드로 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 의미는 포함 되지 해야 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 바닥을 제거 하 고 이동식 플라스틱 랩으로 대체. 참고: 여기에 사용 되는 번호판에 대 한 하단의 쉽게 제거할 수 있습니다 각 잘;의 하단에 압력을 적용 하 여 얇은 플라스틱 하단 단순히 밖으로 떨어질 것 이다.</li>
	<li>BSA 재고 솔루션의 믹스 100 µ L (A) 및 THPC의 100 µ L 재고 솔루션 (B) (선택 사항: 재고 솔루션 C 공업화, 세포 접착 hydrogels 4 µ L) 하이드로 겔의 200 µ L를 96 잘 접시에. 중 합 후 균일 한 하이드로 겔을 보장 하기 위해 5 번 이상 아래로 pipetting으로 구성 요소를 믹스.</li>
	<li>모든 hydrogels는 제대로 생산 될 때까지 약 10 분 동안 실 온 (RT)에서 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 고 천천히 접시의 아래쪽에서 플라스틱 포장을 제거 합니다.</li>
	<li>작은 스탬프를 사용 하 여 96 잘 접시에서 hydrogels 누르고 살 균 PBS, pH 7.4와 1.5 mL 튜브에 그들을 전송. 참고:는 hydrogels 약 4 mm의 직경 및 높이 8 m m의 원통형 모양이 있다.</li>
	<li>hydrogels 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 몇 개월까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>
2. 동결 된 Hydrogels
<ol>
	<li>살 균 이온된 H2O의 500 µ L와 1.5 mL 튜브와 뚜껑을 제거. 주걱을 사용 하 여 1.5 mL 반응 관에는 hydrogels 전송.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 단단히 파라핀 영화-에 적어도 3 층 각 유리병에 대 한 포장. 바늘을 사용 하 여 튜브에서 가스 릴리스 수 있도록 영화에 있는 작은 구멍을 뚫.</li>
	<li>다음 단계 중 하나를 수행 하십시오.
	<ol>
		<li>액체 질소는 물과 히드로 완전히 고정 되도록 5 분 동안 솔루션에 유리병을 전송 합니다. 즉시 제거 후 액체 질소에서 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다. 참고:이 절차 결과 모 공에 대 한 10-15 µ m 반경에.</li>
		<li>천천히는 hydrogels 동결 하룻밤-20 ° C에서 튜브를 유지. 즉시 제거 후-20 ° C에서, 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다. 참고:이 절차에 대 한 모에 결과 반지름 µ m 50-60.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 h (와 후에 하이드로 겔 주위 물의 완전 한 증발), 동결 건조 기에서 그것을 제거 하 여 소재를 녹여. 참고: 기 공 크기는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (단계 5, "하이드로 겔 시각화")와 함께 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 입자 침
<ol>
	<li>1.1-1.5 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.</li>
	<li>직접 구성 요소를 혼합 후 추가 NaCl 포화 (36 mg/mL)이 발생할 때까지. 솔트 크리스탈 흰색 침전으로 솔루션에서 볼 수 있습니다 때까지 소금을 추가 합니다.</li>
	<li>통에 96 잘 접시를 전송 하 고 중 합 일어난다 (약 10 분) 때까지 흔들어. 1.7-1.8 단계에 설명 된 대로 hydrogels는 접시에서 제거 합니다.</li>
	<li>하이드로 겔 템플릿에서 모든 소금 elute 하 통 (20 rpm)에 살 균 물에 RT에서 적어도 24 h hydrogels 품 어. 몇 개월에 대 한 PBS에 4 ° C에서 hydrogels를 저장 합니다.</li>
</ol>
4. 채널 형성
<ol>
	<li>1 단계에서 설명한 대로 hydrogels를 준비 합니다. 히드로 협공을 사용 하 여 솔루션에서 제거 하 고 높게 흡수 성 종이, 과잉의 물을 제거 드라이 아이스의 블록 위에 두십시오.</li>
	<li>고정 30 하이드로 겔의 블록에서 조심 스럽게 분리. 하이드로 겔;를 손상 하지 않습니다 조심 스럽게 주걱을 사용 하 여 블록 다쳤어요. 1.5 mL 튜브에는 히드로 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 건조</li>
</ol>
5. 하이드로 겔 시각화
<ol>
	<li>PBS의 10 ml에서 rhodamine B의 1 마그네슘을 diluting 하 여 rhodamine B 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.001 mg/mL의 농도 도달할 때까지 PBS에서 rhodamine 재고 솔루션을 diluting 하 여 직렬 희석을 준비 (희석 비율: 100)</li>
	<li>스토리지 솔루션 (예를 들어, 단계 2.4에서에서.)에서 하이드로 겔을 제거 하 고 0.01 mg/mL rhodamine B 해결책의 1 mL 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 실시간에서 rhodamine B 솔루션에 하룻밤 히드로 얼룩</li>
	<li>다음 날, PBS (pH 7.4)와 적어도 3 h에 대 한 세척의 10 mL를 시각화 하는 히드로 전송.</li>
	<li>잘 µ-슬라이드 8에 히드로 전송 및 PBS와 그것을 커버.</li>
	<li>블레이드를 사용 하 여 (약 0.5 m m에 높이) 히드로에서 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>Confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 시각화 514의 파장에서 히드로 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X).</li>
</ol>
6. 셀 문화 타당성
<ol>
	<li>멸 균 필터 모두 0.45 μ m 필터 솔루션 (A, B 및 C) 재고.</li>
	<li>1.1-1.4, 히드로 합 전에 셀 접착제 펩 티 드를 포함 하 여 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.</li>
	<li>구성 요소를 혼합 한 후 즉시 플라스틱 혼합물 µ-슬라이드 8에 하단 완전히 덮여 때까지 잘. 참고:이 단계 수행 되어야 합니다 신속 하 고 직접 부품, 후 중 합 슬라이드에 몇 분 안에 일어난다.</li>
	<li>문화 접착 세포와 통로를 표준 세포 배양 기술을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션. 미리 데워 진, 무 균 DMEM 세포 배양 소 태아 혈 청 (FBS, 10% (w/v)), 페니실린-스 (1% (w/v)), 그리고 불필요 한 아미노산 솔루션 (MEM, 1% (w/v)) 보충으로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>Neubauer 챔버 및 신중 하 게 피 펫 200 µ L 셀 (2 x 105 셀/cm2) 하이드로 겔 표면에 원하는 수의 계산 된 셀 계산.</li>
	<li>Μ-슬라이드 8 뚜껑으로 잘 커버 하 고 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 그것을 전송. 적어도 4 h 37 ° c.에 품 어</li>
	<li>세포 부착의 적어도 4 h, 후 셀 메 마른 세포 배양 PBS의 200 µ L 두 번 씻는 다.</li>
	<li>RT에서 10 분에 대 한 3.7% (v/v) 포름알데히드의 200 µ L로 셀을 수정 하 고 PBS로 두번 세척 (~ 200 µ L). 참고: 포름알데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.</li>
	<li>PBS로 두 번 5 분 세척에 대 한 0.1% 트리톤 X의 200 µ L 셀 permeabilize</li>
	<li>Phalloidin-rhodamine 셀 추가 하 여 PBS의 195 µ L methanolic 주식의 5 µ L 혼합 그것 셀에 실시간 얼룩에 20 분에 대 한 셀 어둠 속에 얼룩. PBS로 2 회 세척.</li>
	<li>514에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀 접착 속성 조사 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X). 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
</ol>
7. 하이드로 겔 속성
<ol>
	<li>붓기 비율입니다.
	<ol>
		<li>적어도 1 일 동안 37 ° C에서 hydrogels를 완전히 건조.</li>
		<li>각 히드로 무게 하 고 정확한 무게 합니다.</li>
		<li>1.5 mL의 PBS로 2 mL 반응 관을 채우십시오.</li>
		<li>이 2 mL 반응 관에는 히드로 전송 및 완전히 PBS에 몰두.</li>
		<li>PBS와 평형에 도달 하는 RT에 PBS에 적어도 이틀 동안은 히드로 둡니다.</li>
		<li>3 일 후, 솔루션에서는 하이드로 겔을 제거 하 고 히드로 표면에서 과잉의 물을 제거 하는 종이 티슈로 건조 합니다.</li>
		<li>무게는 하이드로 겔.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 붓기 비율 계산: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> 여기서 Wd 는 말린된 젤 (7.1.2 단계.)의 무게와 Ws 젖은 젤 (단계 7.1.7)의 무게입니다. 붓기 비율 %를 100으로 곱하면 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pH 및 온도 안정성입니다.
	<ol>
		<li>15 mL 반응 관에 PBS의 5 mL을 전송.</li>
		<li>NaOH와 HCl. 가져와 적절 한 온도 (예, RT, 37 ° C, 또는 80 ° C) 솔루션 솔루션 적절 한 산도 (예를 들어, : pH 2, 7, 또는 10)을 조정 합니다.</li>
		<li>적절 한 솔루션으로 안정성에 대 한 조사 하는 히드로 전송. 필요한 경우 pH를 재조정 하 고 참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 (붓기 비율 참조) 재료의 붓기 때문에 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.</li>
		<li>특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 최대 2 일 동안 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>효소 저하입니다.
	<ol>
		<li>300 U 트립 신 펩 신, 제조업체의 지침에 의하여의 재고 효소 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>적절 한 솔루션을 (예를 들어, 단계 1.8에서에서) 히드로 전송. 참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.</li>
		<li>특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

거대 다공성 매트릭스의 생산은 다양한 분야에 도움이 될 수 있습니다. 하이드로겔의 정의된 구조와 특정 재료 특성을 제어하고 조정할 수 있는 능력으로 인해 기술적, 경제적 잠재력이 높습니다. 그러나 기공이나 채널과 같은 초분자 구조 요소를 3D 템플릿에 도입하면 팽창 비율이나 강성과 같은 재료의 전반적인 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 네트워크의 원치 않는 분해, 성능 저하 또는 고장이 발생할 수 있으며, 따라서 재료가 무용하거나 단순히 원하는 응용 분야에 적용할 수 없게 될 수 있다12. 단백질은 정의된 구조, 고유한 생체 적합성(천연 공급원에서 파생되기 때문에) 및 사용 가능한 많은 변형 부위(예: 반응성 아미노기, 수산기- 또는 카르복실기)로 인해 하이드로겔에 적용할 수 있는 알려진 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 많은 단백질 기반 하이드로겔은 합성 하이드로겔에 비해 충분한 기계적 안정성이 부족합니다16. 대형...

Hydrogels는 많은 양의 물 바인딩 수 불용 성 3 차원 네트워크를 형성 하는 물자. 이러한 자료는 살아있는 세포에 대 한 우수한 환경 조건을 제공할 수 있습니다. 현재, 3 차원 하이드로 겔 구조의 세대에 그들의 화학 및 물리적 특성에 맞게 프로세스 개발에 관심이 증가 하고있다. 이 달성 되 면 세포의 성장 및 세포 행동의 조작에 대 한 템플릿이 생성된1,2,,34될 수 있습니다. 이러한 3 차원 구조 뿐만 아니라 기존의 2 차원 방법, 하지만 그들은 보다 더 자연스럽 고 현실적인 환경 또한 공개 새로운 가능성을 만들 줄기 세포의 성장에 대 한 또는 종양 모델5. 다른 재료는 젤6의 기 공 크기에 주로 의존 하는 특성의 범위를 소유한 다. 모 공 세포 문화 응용 프로그램, 조직 공학 및 줄기 세포의 감독된 성장에 중요 한 역할을 한다. 예를 들어, 매트릭스를 통해 확산 하는 산소와 영양분 그리고 충분 한 양의 세포7에 도달 할 수 있어야 합니다. 다른 한편으로, 유해한 대사 산물, 최대한 빨리 제거 되어야 한다 고 세포 성장 위한 충분 한 공간이 사용 가능한7수 있어야 합니다. 따라서, 재료의 기 공 크기, 속성 심각 하 게 영향을 미칠 행렬의 잠재적인 혜택 및 가능한 응용 프로그램. 재료의 특성에 따라, 다른 세포-성장 과정; 신경 구조의 형성을 포함 하 여 3 차원 세포 배양에서 발생할 수 있습니다. 성장과 분화의 피부 나 뼈 세포; 그리고 hepatocytes 또는 섬유 아 세포2,3,,89,10,11같은 특별 한 줄기 세포 라인의 감독된 성장. 또 다른 중요 한 포인트는 물질의 가능한 응용 프로그램에 영향을 미치는 외부 자극12쪽으로 그것의 안정성입니다. 예를 들어는 히드로 세포 배양 또는 인체에 기계적 무결성을 유지 해야 합니다.
최근 몇 년 동안, 강화, 3D 셀 문화 hydrogels에 연구와 많은 연구 시스템13의 3 차원 구조를 해결 하기 위해 실시 했다. 화학적 합성된 구성 요소 구성 Hydrogels 가장 일반적으로 쉽게 합성 및 화학적 수정 수 있고 그들은 높은 안정성을 전시 하기 때문에 조사 (주 외., 2011 리뷰 참조)5. 그러나, 단백질에는 많은 유익한 속성이:으로 소위 "정밀 고분자," 그들은 생체; 그들은 정의 길이; 그들은 상대적으로 쉽게 수정; 그리고 그들은 많은 수의 대상 사이트14,15. 이와 관련, 많은 분야에서 응용 프로그램에 대 한 매우 구체적인, 혁신적인 구조를 생성할 수 있습니다. 본이 연구에서는 단백질 기반 하이드로 겔16 자료의 3 차원 구조에 영향을 잘 설립 방법의 능력을 보여 주기 위해 사용 되었다. 또한, 능력과 기 공 세대에 적용도 조사 했다.
많은 다른 기술이 간단한 방법 및 재료 과학의 다른 분야에서 정교 하 고, 고도로 전문화 된 기술 모두를 포함 하 여 3 차원 구조를 수정할 수 있습니다. 광범위 한 기술을 잘 정의 된 구조17를 생성 하는 전기의 사용 이다. 충전된 섬유는 전기 분야에 의해 해결책에서 가져온 고 산소에 노출 시 응고. 이 방법에서는, 몇몇 미크론까지 여러 나노미터의 범위에서 섬유를 생산 수 있습니다. 추가 기술을 크기, 구조, 그리고 매트릭스 내의 숨 구멍의 배포를 조정 하는 소프트 리소 그래피, 사진 평판, 유체역학 초점, 전기 살포 바이오 인쇄18,,1920. 이러한 기술의 중요 한 결점은 특정, 비싼 장비 및 특수 화학 제품 또는 자료에 대 한 의존도. 또한, 이러한 기술을 경험 종종 단백질 기반 재료를 직접 양도 이며 화학 물질 및 방법의 많은 셀 호환 되지 않습니다.
다른 한편으로, 많은 기술을 쉽고 저렴 적용 하 고 재현 하 그들을 만드는 특별 한 장비에 의존 하지 마십시오. 구조 조작에 대 한 광범위 한 방법은 용 매 캐스팅21,,2223입니다. 입자 중 합 반응 전에 추가 되 고 솔루션 포화 homogenously 배포 됩니다. 중 합 후 희석 또는 pH 변화, 같은 조건의 변화를 모는 재료 내에서 유지 하는 동안 입자의 solvation에 지도 한다. 소금, 설탕, 파라핀, 젤라틴, 분필, 등이 기술에 사용 되는 화학 물질 저렴 하 고 쉽게 사용할 수 있다 동결에 부 어 hydrogels 동결 됩니다. 진공에서 액체 단계의 후속 승화는23,,2425수행. 네트워크에서 물 승화 만큼 부드러운 재료의 특정 3D 구조를 유지 하는. 가스 거품, 동안에 중 합, 젤21내 숨 구멍을 떠나는 해결책 가스와 스트리밍됩니다. 크기와 숨 구멍의 분포는 가스 흐름에 따라 조정할 수 있습니다.
형성 단백질 히드로, BSA는 tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 물 (THPC) 1 차 아민 4 무장 링커 분자26의 hydroxy 그룹 사이 공유 결합의 형성에 대 한 있도록 Mannich 형 반응에서으로 반작용 했다. 반응 발생 가능한 유해한 중간체 물질의 과도 한 씻기에 의해 제거 됩니다.
이 연구에서는 조작 하 고 숨 구멍의 크기에 맞게 다른 기술로 BSA 기반 소재를 치료의 가능성을 보여 줍니다. 각 기술을 사용할 수 있습니다 어떤 실험실에 전세계, 특별 한 장비는 필요 하다. 또한, 다른 매개 변수를 같은 붓기 비율, 효소 분해성, pH 안정성, 온도 감도, 검사 그리고 서로에 비해 특히 존중 다른 기술의 영향에 3D 아키텍처의 생성에. 마지막으로, 자료 했다 기능성 세포 배양 물질의 가능한 응용 프로그램을 조사 하기 위해 셀 접착제 펩 티 드와 함께. 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인 사용 되었다: A549 및 MCF7.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (high glucose)</td><td>Life Technologies / 써모 피셔&nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>생명 기술 / 써모 피셔&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA 0.05% 페놀 레드</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99.8%, verg&auml; llt</td><td>&ouml; lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>칼 로스&nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>알부민 분획 V</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>시그마 알드리치</td><td>404861-100ML</td><td>독성</td></tr><tr><td>0.1% 트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>X100-100ML</td><td>약간 독성</td></tr><tr><td>팔로이딘-로다민&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지스 / 써모 피셔&nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3.7% 포름알데히드&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지스 / 써모 피셔&nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>독성</td></tr><tr><td>로다민 B</td><td>시그마 알드리치</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>필트로푸르 S 0.2&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&마이크로; 슬라이드 8 웰</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS 펩타이드</td><td>UPEP Ulm</td><td>맞춤형 시스템</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99.8%, verg&auml; llt</td><td>칼 로스&nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 폴리스테렌 라운드-바텀 튜브&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>튜브 50 ml&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>튜브 1.5 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>튜브 2 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>FreezeDryer Epsilon 1-6D,&nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어 버전 2012 SP1, 블랙 에디션, 407 버전 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels 셀 문화 응용 프로그램 때문에 높은 수 화 셀 환경을 제공 하는 그들의 능력에 대 한 유망 자료로 인정 받고 있습니다. 3 차원 서식 파일의 필드는 자연적인 기질을 그 물질의 잠재적인 정체 때문 상승 이다. 단백질 기반 hydrogels가 있습니다 특히 유망한 functionalized 쉽게 수 있기 때문에 조정 가능한 물리 속성으로 정의 된 구조를 얻을 수 있습니다. 그러나, 천연 재료를 사용 하 여 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 macroporous 3D 템플릿의 생산 종종 합성 물질의 그들과 비교 된 그들의 약한 기계적 성질에 의해 제한 됩니다. 여기, 다른 방법을 macroporous 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 생산 하기 위해 평가 했다-하이드로 겔 시스템, 반경에서 10 ~ 70 µ m의 범위에서 조정 가능한 기 공 크기를 기반으로. 또한, 몇 백 미크론 긴은이 단백질 기반 자료 채널을 생성 하는 방법 설치 되었다. 모 공, 기 공 크기의 영향 비율, pH, 온도 안정성, 그리고 효소 저하 행동, 붓기 등의 소재 속성에 생산 하는 여러 가지 방법은 분석 했다. 기 공 크기 hydrogels confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 네이티브, 부푼 상태에서 조사 되었다. 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 타당성 단백질 시스템 및 두 개의 모델 셀 라인의 세포 접착제 RGD 펩타이드 수정을 사용 하 여 평가 했다: 인간 유방암 세포 (A549)와 adenocarcinomic 인간의 치경 기저 상피 세포 (MCF7).

하이드로젤 개발은 과학 연구 아카이브에 수천 건의 항목이 색인되어 있을 만큼 생물학 관련 재료 연구 분야에서 가장 두드러진 분야 중 하나가 되었습니다. 많은 시스템의 거동이 잘 연구되어 있음에도 불구하고, 특히 민감한 단백질 기반 재료의 3D 네트워크 조작은 재료 과학에서 종종 주요한 문제로 제기됩니다. 또 다른 흔한 과소평가 과제는 초저온 전자 현미경을 사용하여 재료의 천연 구조를 정확하게 측정하는 것입니다. 이는 시료 준비(즉, 건조) 과정에서 하이드로젤의 특성이 변하는 경우가 많기 때문입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 연구에서는 재료가 수분을 머금은 천연 상태일 때 특성 분석이 가능한 공초점 현미경을 사용하여 재료 시료를 분석하였습니다. Rhodamine B는 정전기적 상호작용을 통해 하이드로젤 골격에 결합하여 재료의 시각화를 용이하게 합니다. 이 단백질 기반 시스템을 수정하기 위한 동결 건조 방식의 타당성을 조사하기 위해, 하이드로젤을 중...

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

이 방법론의 전반적인 목표는 세포 배양 응용을 위해 다양한 기공 크기를 가진 거대 기공 하이드로젤을 제작하는 것입니다. 이 방법은 새로운 하이드로젤 소재의 3D 세포 배양 응용 가능성과 같은 3D 세포 배양 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 새로운 소재를 다양한 유형의 세포 요구 사항에 맞게 최적화하고 조정할 수 있는 일련의 기술을 제공한다는 점입니다.먼저, RGD 펩타이드 또는 그와 동등한 세포 접착 펩타이드 1 mg을 멸균수로 100 µL 희석하여 10 mg/mL 용액을 준비합니다. 다음으로, 96 웰 플레이트의 바닥면을 제거하고 제거 가능한 플라스틱 랩으로 대체합니다. 96 웰 플레이트에 BSA 스톡 용액 100 µL와 THPC 스톡 용액 100 µL를 혼합하여 200 µL의 하이드로겔을 얻습니다.중합 후 균일한 하이드로겔을 얻기 위해 피펫팅으로 최소 5회 이상 성분을 혼합하십시오. 모든 하이드로겔이 적절하게 중합될 때까지 96웰 플레이트를 상온에서 약 10분 동안 둡니다. 중합이 완료되면 플레이트 바닥의 플라스틱 랩을 조심스럽게 천천히 제거하십시오.작은 도구를 사용하여 96웰 플레이트에서 하이드로겔을 밀어내고, pH 7.4의 멸균 PBS가 담긴 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔을 인산완충생리식염수(PBS)에 넣어 4 °C에서 최대 수개월 동안 보관하십시오. 하이드로겔을 동결 건조하려면, 먼저 1.5 mL 튜브에 500 µL의 멸균 탈이온수를 채우고 캡을 제거합니다.포셉을 사용하여 하이드로젤을 1.5 milliliter 반응 튜브로 옮깁니다. 1.5 milliliter 튜브를 파라핀 필름으로 최소 3겹 이상 단단히 감쌉니다. 바늘을 사용하여 필름에 작은 구멍을 뚫어 튜브 내의 가스가 배출될 수 있도록 합니다.물과 하이드로겔이 완전히 얼 수 있도록 바이알을 액체 질소 용액에 5분 동안 넣어 둡니다. 액체 질소에서 꺼낸 즉시 바이알을 동결 건조기로 옮겨 물질이 녹는 것을 방지합니다. 대안적인 동결 단계로, 바이알을 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하여 하이드로겔을 천천히 동결시킵니다.-20°C에서 꺼낸 즉시, 재료가 녹는 것을 방지하기 위해 바이알을 동결 건조기로 옮깁니다. 24시간이 지나 하이드로겔 내부와 주변의 물이 완전히 증발하면, 동결 건조기에서 꺼내 재료를 해동합니다. 입자 용출을 위해 하이드로겔 성분을 이전과 동일하게 혼합합니다.혼합 후, 포화 상태가 될 때까지 염화나트륨을 즉시 첨가합니다. 용액 내에 흰색 침전물 형태의 염 결정이 보일 때까지 소금을 추가하십시오. 사용 전 염 결정을 분쇄하여 공극 크기를 조절할 수 있습니다.96웰 플레이트를 쉐이커로 옮겨 중합이 일어날 때까지 흔들어 줍니다. 약 10분 후, 이전과 동일하게 플레이트에서 하이드로겔을 꺼냅니다. 하이드로겔 템플릿에서 모든 염을 용출시키기 위해, 멸균수에 담아 로테이터 위에서 상온으로 최소 24시간 동안 배양합니다.하이드로겔을 PBS 내에서 4°C로 최대 수개월 동안 보관하십시오. 완만한 형성을 위해, 설명된 대로 하이드로겔을 준비하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 용액에서 하이드로겔을 꺼내십시오.흡수력이 매우 높은 종이로 과잉 수분을 제거하고 드라이아이스 블록 위에 올려놓으십시오. 하이드로젤을 30초 동안 냉동시킨 후 블록에서 조심스럽게 분리하십시오. 이때 하이드로젤이 손상되지 않도록 주의하십시오.스패튤라를 사용하여 블록에서 조심스럽게 긁어냅니다. 하이드로겔을 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 건조합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 Rhodamine B 스톡 용액과 단계 희석 용액을 준비합니다.저장 용액에서 하이드로겔을 꺼내 0.01 mg/mL Rhodamine B 용액 1 mL가 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 Rhodamine B 용액으로 하이드로겔을 하룻밤 동안 염색합니다. 다음 날, 시각화할 하이드로겔을 10 mL PBS로 옮겨 최소 3시간 동안 세척합니다.블레이드를 사용하여 하이드로젤을 작은 조각으로 절단합니다. 그런 다음 하이드로젤을 8웰 현미경 슬라이드로 옮기고 PBS로 덮습니다. 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 514 nanometers 파장에서 하이드로젤을 시각화합니다.모든 스톡 용액을 0.45 micron 필터로 멸균 여과합니다. 하이드로겔 준비를 시작하고, 하이드로겔 중합 전에 세포 접착 펩타이드를 첨가합니다. 구성 성분을 혼합한 후, 바닥면이 완전히 덮일 때까지 혼합물을 8-웰 현미경 슬라이드에 즉시 피펫팅합니다.세포를 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum), 페니실린 스트렙토마이신 및 비필수 아미노산 용액이 첨가되어 미리 데워진 멸균 DMEM 세포 배양 배지로 옮깁니다. Neubauer 계산 챔버로 세포 수를 센 후, 원하는 수의 세포 200 µL를 하이드로젤 표면에 조심스럽게 피펫팅합니다. 8-웰 현미경 슬라이드를 덮개로 덮고 배양기로 옮깁니다.세포가 최소 4시간 동안 부착된 후, 200 µL의 멸균 세포 배양용 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 다음으로, 실온에서 200 µL의 3.7% formaldehyde로 10분 동안 세포를 고정한 후 PBS로 2회 세척합니다. 200 µL의 0.1% Triton X로 5분 동안 세포를 투과화시킨 후, 다시 PBS로 2회 세척합니다.메탄올 스톡 5 µL를 PBS 195 µL와 혼합하여 세포에 첨가하고 상온에서 Toluidine Rhodamine으로 세포를 염색합니다. 암실에서 20분 동안 세포를 염색한 후 PBS로 2회 세척합니다. 514 nm 파장의 공초점 현미경을 사용하여 세포 접착 특성을 조사합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하이드로젤의 특성을 분석하십시오. 여기에서 볼 수 있듯이, 중합 및 염색된 하이드로젤은 뚜렷한 구조를 가지고 있지 않습니다. 서로 다른 온도에서 하이드로젤을 동결 건조한 후, 하이드로젤 내 기공의 평균 크기를 최대 60 microns까지 확장할 수 있습니다.염 용출법을 통해 공극 크기가 약 10 microns인 균일한 네트워크를 얻을 수 있습니다. 이 크기는 사용 전 염 결정을 분쇄하여 추가로 조절할 수 있습니다. 드라이아이스 블록 상에서 구배 동결 방식을 사용하면 직경 약 20 microns, 길이 수백 microns의 채널을 형성할 수 있습니다.세포 접착 작용기를 이용한 기능화 이전에는 세포가 하이드로젤 표면에 부착되지 못하며 둥근 형태를 보입니다. 재료에 세포 접착 펩타이드를 제공한 후에야 세포는 초점 접착 지점을 찾아 재료 위에 적절하게 부착될 수 있습니다. 이는 3D 세포 배양 응용 분야에서 새로운 재료를 사용하는 데 매우 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 간단한 방법으로 하이드로젤의 구조를 조절하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 대부분의 새로운 하이드로젤 시스템에 적용 가능하며, 이를 통해 세포 배양에서의 활용법을 익히고 의도한 용도에 따라 하이드로젤의 구조를 최적화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산도와 온도 안정, 유기 솔벤트와 함께, 쉽게 기능을 구형 단백질을 포함하고 있습니다.

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

학습하세요 단백질 기반 하이드로겔의 3차원 구조를 조작하여 세포 배양에 적합한 다공성 매트릭스를 만드는 방법을. RGD 펩타이드 기능화와 동결 건조 기법을 활용하여 세포 부착 및 증식을 촉진하는 최적화된 생체 재료를 개발할 수 있습니다.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

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