셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 방법론의 전반적인 목표는 세포 배양 응용 분야를 위한 다양한 공극 크기를 가진 거대다공성 하이드로겔을 만드는 것입니다. 이 방법은 3D 세포 배양 응용 분야를 위한 새로운 하이드로겔 물질의 기본 실현 가능성과 같은 3D 세포 배양 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 다양한 유형의 세포 요구 사항에 맞게 새로운 물질을 최적화하고 조정할 수 있는 다양한 기술을 제공한다는 것입니다.

먼저 RGD 펩타이드 1mg 또는 이에 상응하는 세포 접착 펩타이드를 100마이크로리터의 멸균수에 희석하여 1밀리리터당 10밀리그램 용액을 얻습니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 바닥을 제거하고 제거 플라스틱 랩으로 교체합니다. 96웰 플레이트에 100마이크로리터의 BSA 원액과 100마이크로리터의 THPC 원액을 혼합하여 200마이크로리터의 하이드로겔을 얻습니다.

중합 후 균일한 하이드로겔을 보장하기 위해 최소 5회 피펫팅을 위아래로 피펫팅하여 구성 요소를 혼합합니다. 모든 하이드로겔이 적절하게 중합될 때까지 약 10분 동안 실온에서 96웰 플레이트를 놓습니다. 중합 후 접시 바닥에서 플라스틱 랩을 조심스럽게 천천히 제거합니다.

살짝 찔러 96웰 플레이트에서 하이드로겔을 밀어내고 멸균 PBS pH 7.4의 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔을 섭씨 4도의 인산염 완충 식염수에 최대 몇 달 동안 보관하십시오. 하이드로겔을 동결 건조하려면 먼저 1.5ml 튜브에 500마이크로리터의 멸균 탈이온수를 채우고 캡을 제거합니다.

겸자를 사용하여 하이드로겔을 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 1.5ml 튜브를 각 바이알에 최소 3겹을 사용하여 파라핀 필름으로 단단히 감쌉니다. 바늘을 사용하여 필름의 작은 구멍을 뚫어 튜브에서 가스가 방출될 수 있도록 합니다.

물과 하이드로겔이 완전히 얼도록 하려면 바이알을 액체 질소 용액에 5분 동안 옮깁니다. 액체 질소에서 제거한 직후 바이알을 동결 건조기로 옮겨 재료가 해동되는 것을 방지합니다. 대체 동결 단계로, 바이알을 하룻밤 동안 섭씨 영하 20도에서 유지하여 하이드로겔을 천천히 동결합니다.

영하 20도에서 꺼낸 직후 바이알을 동결 건조기로 옮겨 재료가 해동되는 것을 방지하십시오. 24시간 후 하이드로겔 내부와 주변의 물이 완전히 증발한 후 동결 건조기에서 재료를 제거하여 재료를 해동합니다. 입자 침출을 위해 하이드로겔의 성분을 이전과 같이 혼합하십시오.

혼합 후에는 즉시 포화가 발생할 때까지 염화나트륨을 첨가하십시오. 용액에서 소금 결정이 흰색 침전물로 보일 때까지 소금을 첨가하십시오. 기공 크기는 사용하기 전에 소금 결정을 분쇄하여 변경할 수 있습니다.

96웰 플레이트를 셰이커로 옮기고 중합이 이루어질 때까지 흔듭니다. 약 10분 후 이전과 같이 플레이트에서 하이드로겔을 제거합니다. 하이드로겔 템플릿에서 모든 염을 용리하기 위해 로테이터의 멸균수에서 실온에서 최소 24시간 동안 하이드로겔

하이드로겔을 섭씨 4도의 PBS에서 최대 몇 달 동안 보관하십시오. 부드러운 형성을 위해 설명된 대로 하이드로겔을 준비하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 용액에서 하이드로겔을 제거합니다.

흡수성이 뛰어난 종이로 여분의 물을 제거하고 드라이 아이스 블록 위에 놓습니다. 하이드로겔을 30초 동안 얼리고 블록에서 조심스럽게 제거합니다. 하이드로겔을 손상시키지 마십시오.

주걱을 조심스럽게 사용하여 블록에서 긁어냅니다. 하이드로겔을 1.5ml 튜브에 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 건조시킵니다. Rhodamine B 원액과 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 연속 희석액을 준비합니다.

저장된 용액에서 하이드로겔을 제거하고 1밀리리터의 0.01밀리리터 로다민 B 용액이 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔을 실온의 로다민 B 용액에 밤새 염색합니다. 다음 날, 시각화할 하이드로겔을 PBS 10ml로 옮기고 최소 3시간 동안 세척합니다.

칼날을 사용하여 하이드로겔에서 작은 조각을 자릅니다. 그런 다음 하이드로겔을 8웰 현미경 슬라이드로 옮기고 PBS로 덮습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 514나노미터의 파장에서 하이드로겔을 시각화합니다.

멸균 필터는 0.45미크론 필터가 있는 모든 스톡 용액을 사용합니다. 하이드로겔 준비를 시작하고 하이드로겔 중합 전에 세포 접착 펩타이드를 포함시킵니다. 성분을 혼합한 후 바닥이 완전히 덮일 때까지 혼합물을 8웰 현미경 슬라이드에 즉시 피펫으로 분사합니다.

세포를 소 태아 혈청, 페니실린 스트렙토마이신 및 비필수 아미노산 용액이 보충된 예열된 멸균 DMEM 세포 배양 배지로 옮깁니다. Neubauer 카운팅 챔버로 세포를 계수한 후 원하는 수의 세포 200마이크로리터를 하이드로겔 표면에 조심스럽게 피펫팅합니다. 8개의 우물 현미경 슬라이드를 뚜껑으로 덮고 인큐베이터로 옮깁니다.

세포 부착 후 최소 4시간 후, 200마이크로리터의 멸균 세포 배양 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 3.7 % 포름 알데히드로 실온에서 10 분 동안 셀을 고정하고 PBS로 2 회 세척합니다. 200마이크로리터의 0.1%Triton X로 세포를 5분 동안 투과한 후 PBS로 두 번 더 세척합니다.

5마이크로리터의 메탄올 스톡과 195마이크로리터의 PBS를 혼합하고 실온에서 세포에 첨가하여 Toluidine Rhodamine으로 세포를 염색합니다. PBS로 두 번 씻기 전에 어둠 속에서 20분 동안 세포를 염색합니다. 514나노미터의 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 접착 특성을 조사합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하이드로겔 특성을 분석합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 중합 및 염색된 하이드로겔은 독특한 구조를 가지고 있지 않습니다. 다양한 온도에서 하이드로겔을 동결 건조한 후 하이드로겔 내 공극의 평균 크기는 최대 60미크론까지 확장될 수 있습니다.

염 침출은 약 10미크론의 공극 크기를 가진 균일한 네트워크를 생성합니다. 크기는 사용하기 전에 소금 결정을 분쇄하여 추가로 조정할 수 있습니다. 드라이 아이스 블록에 구배 동결 방법을 사용하면 직경이 약 20 미크론이고 길이가 수백 미크론 인 채널이 형성됩니다.

세포 접착 부분으로 기능화하기 전에는 세포가 하이드로겔 표면에 부착되어 둥근 형태를 보일 수 없습니다. 재료에 세포 접착 펩타이드를 제공한 후에만 세포는 세포가 재료에 적절하게 접착될 수 있도록 하는 초점 접착점을 찾습니다. 이는 3D 세포 배양 응용 분야에서 새로운 재료를 사용하는 데 매우 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 간단한 방법으로 하이드로겔의 아키텍처를 조작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 대부분의 새로운 하이드로겔 시스템에 적용하여 세포 배양에서의 사용에 대해 배우고 의도된 용도에 따라 하이드로겔의 아키텍처를 최적화할 수 있습니다.