이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

이 시계 방향 스캔(clock scan) 프로토콜의 전반적인 목표는 선택된 관심 영역(region of interest) 내부, 경계 및/또는 외부의 평균 픽셀 강도를 빠르게 특성화하는 것입니다. 이 방법은 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 이미지 분석가에게 특정 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도에 대해 교육할 수 있습니다. 여기서 시계 방향 스캔 기술의 주요 장점은 궤도 상에서 단일 또는 다중 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 빠르게 특성화하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.

표준 클락 스캔 분석을 위해, 해당 ImageJ 프로그램의 파일(File) 메뉴에서 열기(Open)를 선택하여 분석하고자 하는 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기서는 특정 단백질이 표지된 뉴런이 포함된 조직 절편을 분석합니다. 적절한 그리기 도구를 선택하여 관심 영역(ROI)의 외곽선을 그립니다.

파일(File) 메뉴에서 플러그인(Plugins) 및 클락 스캔(Clock Scan)을 선택하여 표준 클락 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니다. 이때 외곽선이 자동으로 추가된 관심 영역 관리자(region of interest manager) 창도 함께 열립니다. 플러그인 옵션 창에서 스크롤 바를 사용하여 관심 영역 중심의 x 및 y 좌표를 적절하게 변경하십시오.

객체 외부의 배경 영역을 어느 정도까지 스캔 범위에 포함할지에 따라, 스캔 제한 스크롤 바를 사용하여 스캔 제한 범위를 조정하십시오. 실험적 적절성에 따라 실제 반경, 배경 제거, 극좌표 변환 및/또는 표준 편차 포함 플롯 체크 박스를 선택하십시오. 그 다음, 확인을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오.

분석이 완료되면, list 명령어를 사용하여 추가 분석을 위한 수치 데이터에 액세스하십시오. 여러 영역에 대한 클록 스캔 분석을 수행하려면, 여러 관심 영역이 포함된 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기서는 앞서 시연한 것과 같이 동일한 조직 절편 내에서 캡처된 프레임 패널을 분석하겠습니다.

Analyze를 클릭한 다음 Tools, 이어서 Region of Interest Manager를 선택하고, 적절한 그리기 도구를 사용하여 각 관심 영역의 외곽선을 그립니다. 분절선(segmented line) 도구는 비대칭 관심 영역을 선택하거나 배경 라벨링을 제외할 때 유용합니다. 관심 영역을 선택할 때마다 Region of Interest Manager 창에서 Add를 클릭하여 각 영역을 관리자에 추가합니다.

Plugins 메뉴에서 Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 열고, 필요에 따라 스캔 제한(scan limit)을 재설정하십시오. 실험 상황에 맞게 표준 편차 표시 및/또는 배경 제거(subtract background) 확인란을 선택하십시오. 그런 다음 OK를 클릭하여 프로토콜을 실행하면 두 개의 결과 그래프 창이 생성됩니다.

이미지 스택의 클록 스캔 분석을 위해, 관심 있는 이미지 스택을 엽니다. 여기서는 세포 내 전극 자극 전후로 촬영된, 칼슘 민감성 형광 물질로 라벨링된 단리된 후근신경절(dorsal root ganglion)의 이미지 스택을 분석합니다. 이미지 스택 내에서 관심 영역을 지정합니다.

방금 시연한 것과 같이 선택한 이미지 스택을 관심 영역 관리자에 추가하고, Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니다. 필요에 따라 스캔 제한을 재설정하고, 실험 조건에 적절하게 표준 편차 플롯 확인 및/또는 배경 제거 상자 항목을 체크합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로토콜을 실행하면 두 개의 출력 플롯 창이 생성됩니다.

형광 표지된 뉴런의 조직 절편에 대한 이 대표 분석에서, 관심 단백질의 밝은 신호를 따라 관심 영역(region of interest)을 설정하고, 표준 클록 스캔(clock scan) 분석을 수행하여 관심 영역의 중심부터 설정된 스캔 제한선까지의 방사형 픽셀 강도 스캔 데이터를 수집하였습니다. 방사형 스캔 값은 스캔 방향의 관심 영역 반지름을 기준으로 정규화되었습니다. 이를 평균하여 통합 방사형 픽셀 강도 프로파일을 생성한 결과, 관심 단백질의 대부분이 세포의 세포막에서 측정되었음을 확인하였습니다.

본 분석에서는 표준 편차 플롯을 선택했으므로, 수직 표준 편차 선은 스캔 원점으로부터 특정 거리에서의 개별 방사형 스캔 프로파일 간 픽셀 강도 차이를 나타냅니다. 본 분석에서는 앞서 시연한 것과 같이 뉴런 조직 샘플 내의 여러 관심 영역을 스캔하였으며, 이를 통해 관심 영역 관리자에 추가된 순서대로 각 스캔 객체에 대한 적분 픽셀 강도 프로파일과, 선택된 각 관심 영역에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일을 생성하였습니다.

따라서 이 표준 편차 막대는 개별 방사형 스캔이 아니라 개별 객체의 적분 스캔 간의 변동성을 나타냅니다. 여기에서는 세포 내 전극을 통해 자극 전후의 서로 다른 시간에 캡처된 단일 후근 신경절 뉴런의 이미지 스택 분석을 수행하였습니다. 분석이 끝나면, 스택 내 서로 다른 이미지에 나타난 관심 객체 개별 인스턴스의 적분 픽셀 강도 프로파일과 해당 객체의 모든 인스턴스에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일이 표시되었습니다.

또한, 클락 스캔 이미지 스택의 표준 편차 분석은 이미지 스택 전체의 적분 스캔 간 데이터 변동성을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 클락 스캔 플러그인을 사용하여 픽셀 강도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 플러그인을 개발한 목적은 모든 연구자가 이러한 유형의 이미지 분석을 자유롭게 이용할 수 있도록 하기 위함이었습니다.

우리는 클락 스캔(clock scan) 프로토콜이 생물학적, 화학적, 물리적 이미징 응용 분야를 포함하여 다양한 연구 영역에서 활용될 것이라고 믿습니다. 이러한 클락 스캔 플러그인을 지속적으로 개발하고 운영함에 있어, 이 도구들을 개선하는 방법에 대한 관심 있는 분들의 모든 피드백과 제안을 감사히 받겠습니다.