이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

이러한 clock scan 프로토콜의 전반적인 목표는 선택한 관심 영역 내부, 경계를 따라 및/또는 외부에서 평균 픽셀 강도를 빠르게 특성화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 주요 질문에 답하고 이미지 분석가에게 특정 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도에 대해 가르치는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 클럭 스캔 기술의 주요 장점은 단일 또는 다중 관심 영역에서 궤도의 평균 픽셀 강도를 신속하게 특성화하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

표준 클럭 스캔 분석의 경우 파일 메뉴의 해당 ImageJ 프로그램에서 열기를 선택하여 관심 있는 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기에서 관심 단백질에 대해 라벨링된 뉴런이 있는 조직 단면을 분석합니다. 적절한 그리기 도구를 선택하고 관심 영역의 윤곽을 그립니다.

파일 메뉴에서 플러그인 및 클럭 스캔을 선택하여 표준 클럭 스캔 프로토콜, 팝업 옵션 창을 엽니다. 개요가 자동으로 추가된 관심 영역 관리자 창도 열립니다. 플러그인 옵션 창에서 스크롤 바를 사용하여 관심 영역의 중심에 있는 x 및 y 좌표를 적절하게 변경합니다.

개체 외부의 배경 영역이 스캔으로 가려야 하는 정도에 따라 스캔 제한 스크롤 막대를 사용하여 스캔 제한을 조정합니다. 실제 반지름을 선택하고, 배경을 빼고, 극좌표 변환을 선택하고, 실험적으로 적절한 표준 편차 확인란을 사용하여 플롯합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 플러그인을 실행합니다.

분석이 완료되면 list 명령을 사용하여 추가 분석을 위해 숫자 데이터에 액세스합니다. 여러 영역의 클럭 스캔 분석을 위해 여러 관심 영역이 포함된 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기서, 방금 시연된 바와 같이 동일한 조직 섹션 내에서 캡처된 프레임 패널이 분석됩니다.

Analyze(분석), Tools(도구), Region of Interest Manager(관심 영역 관리자)를 차례로 클릭하고 적절한 그리기 도구를 사용하여 각 관심 영역의 윤곽을 그립니다. segmented line 도구는 비대칭 관심 영역을 선택하고 배경 레이블을 제외하는 데 유용합니다. Region of Interest Manager(관심 영역 관리자) 창에서 Add(추가)를 클릭하여 선택한 대로 각 관심 영역을 관리자에 추가합니다.

Plugins 메뉴에서 Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 열고 필요에 따라 스캔 제한을 재설정합니다. 실험적으로 적절한 경우 표준 편차 및/또는 빼기 배경 상자가 있는 플롯을 확인합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로토콜을 실행하면 두 개의 출력 플롯 창이 생성됩니다.

이미지 스택의 클럭 스캔 분석을 위해 관심 있는 이미지 스택을 엽니다. 여기서, 세포 내 전극 자극 전후에 이미지화된 칼슘에 민감한 형광등으로 표지된 고립된 등쪽 뿌리 신경절의 이미지 스택을 분석합니다. 이미지 스택 내에서 관심 영역을 간략하게 표시합니다.

방금 설명한 것처럼 선택한 이미지 스택을 관심 영역 관리자에 추가하고 Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니다. 필요에 따라 스캔 한계를 재설정하고, 실험적으로 적절한 경우 표준 편차로 플롯을 확인하거나 배경 상자를 뺍니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로토콜을 실행하고 두 개의 출력 플롯 창을 생성합니다.

형광 표지된 뉴런의 조직 절편에 대한 이 대표적인 분석에서는 관심 단백질에 대한 밝은 신호를 통해 관심 영역을 도출하고, 관심 영역의 중심에서 설명된 스캔 한계까지 방사형 픽셀 강도 스캔을 수집하기 위해 표준 시계 스캔 분석을 수행했습니다. 방사형 스캔은 스캔 방향의 관심 영역 반경으로 정규화되었습니다. 적분 전파 픽셀 강도 프로파일을 생성하기 위한 평균으로, 관심 단백질의 대부분이 세포의 원형질막에서 측정되었음을 밝힙니다.

이 분석을 위해 표준 편차가 있는 플롯이 선택됨에 따라 수직 표준 편차 선은 스캔 원점에서 주어진 거리에서 개별 방사형 스캔 프로파일의 픽셀 강도 사이의 픽셀 강도를 나타냅니다. 이 분석에서는 방금 시연한 바와 같이 뉴런 조직 샘플 내의 여러 관심 영역을 스캔하여 관심 영역 관리자에 추가된 시퀀스에서 스캔된 각 개체에 대한 통합 픽셀 강도 프로파일을 생성했습니다. 및, 각각의 선택된 관심 영역에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일.

따라서 이러한 표준 편차 막대는 개별 방사형 스캔이 아닌 개별 물체의 적분 스캔 간의 변동성을 나타냅니다. 여기서, 세포 내 전극을 통해 자극 전과 후의 서로 다른 시간에 포착된 고립된 배근 신경절 뉴런의 이미지 스택 분석이 수행되었습니다. 분석이 끝날 때, 스택 내의 다른 이미지에 대한 관심 물체의 개별 인스턴스에 대한 적분 픽셀 강도 프로파일과 물체의 모든 인스턴스에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일이 표시되었습니다.

또한, 클럭 스캔 이미지 스택의 표준 편차 분석은 이미지 스택 전반에 걸쳐 적분 스캔 간의 데이터 가변성을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 클럭 스캔 플러그인을 사용하여 픽셀 강도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 플러그인을 개발한 목적은 모든 연구자가 이러한 유형의 이미지 분석을 자유롭게 사용할 수 있도록 하는 것이었습니다.

우리는 clock scan 프로토콜이 생물학적, 화학적 및 물리적 이미징 응용 프로그램을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 연구 분야에 사용될 것이라고 믿습니다. 이러한 클럭 스캔 플러그인을 계속 개발하고 운영하면서 이러한 도구를 개선하는 방법에 대한 이해 관계자의 피드백과 제안에 감사드립니다.