Name: 이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 ImageJ 플러그인을 활용한 클록 스캔 이미지 분석 기법으로, 관심 영역 내 픽셀 강도를 신속하게 특성화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 신경과학 및 다양한 생물학적 이미징 연구에 활용됩니다.

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Fuji ImageJ Clock Scan 플러그인 버전을 우리와 공유하고이 프로그램 버전을 개발하도록 고무시켜 준 Tanja Maritzen 박사와 Fabian Feutlinske 박사 (Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Berlin, Germany)에게 감사드립니다. 우리는 또한 플 뢰즈 멜 처 박사 (Max Plck Institute for Infection Biology) 림프구 개발 부서 (Department of Fritz Melchers)에게 플러그인 테스트 및 개선 목적으로 그의 부서의 데이터베이스에서 이미지를 사용하는 것에 대한 허락감에 감사드립니다. 지원 : Translational Neurosciences 센터; NIH 교부금 : P30-GM110702-03.

1. 소프트웨어 설치 <ol><li> 번들로 제공되는 Java 및 ImageJ 또는 Fiji ImageJ의 최신 버전을 각 웹 사이트에 권장대로 설치하십시오 (해당 웹 사이트 링크는 자료 표 참조). 아래 텍스트에서 두 프로그램을 모두 &quot;ImageJ&quot;라고합니다. </li><li> Materials 테이블에 제공된 링크를 사용하여 &quot;Clock_Scan-1.0.1. jar&quot;및 &quot;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&quot;플러그인 파일을 복사하여 ImageJ 플러그인 디렉토리에 붙여 넣으십시오. 또는 &quot;플러그인 | 플러그인 설치&quot;메뉴 옵션을 사용하여 파일을 컴퓨터 하드 드라이브에 저장 한 후에 설치하십시오. </li></ol> 2. 클록 스캔 분석 <ol><li> 표준 클럭 스캔 플러그인 ( 그림 1 ) : <ol><li> ImageJ &quot;File | Open&quot;메뉴 명령을 사용하여 관심있는 이미지를 엽니 다. </li><li> &#39;다각형&#39;도구 또는 &#39;세그먼트 선 선택&#39;을 클릭하십시오.도구를 선택한 다음 이미지 위에 그려 전체 ROI 또는이 영역의 세그먼트를 윤곽으로 나타냅니다. 다각형 선택의 예는 그림 1A 를 참조하십시오 (내부 파선 테두리). 참고 : 소프트웨어에서 사용할 수있는 기타 선택 도구 (직사각형, 타원형 및 프리 핸드 라인 선택)도 사용할 수 있습니다. </li><li> 메뉴에서 &quot;Plugins | Clock Scan&quot;을 선택하여 표준 클럭 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니 다. 이 명령은 개요가 자동으로 추가 된 ROI 관리자 창을 엽니 다. </li><li> 플러그인 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 스크롤 막대를 사용하거나 해당 입력 상자의 값을 변경하여 ROI 센터의 X 및 Y 좌표 (물리적으로 매스 센터의 좌표로 자동 계산 됨)를 검토하고 변경하십시오. 그림 1B 참조. </li><li> 객체의 바깥 쪽 배경 영역의 양에 따라스캔으로 덮히려면 &quot;스캔 제한&quot;스크롤 막대를 사용하여 스캔 제한을 조정하십시오. 그림 1A를 참조하십시오. 참고 : 스캔 제한은 주어진 방향에서 개체의 경계를 넘어서 스캔이 진행되어야하는 거리를 나타내는 분수입니다. 기본값은 스캔 길이가 스캔 방향의 오브젝트 반경보다 20 % 길다는 것을 나타내는 1.20입니다. 도 1a , 바깥 쪽 점선 참조). </li><li> &quot;실제 반지름&quot;, &quot;배경 빼기&quot;, &quot;극좌표 변환&quot;및 / 또는 &quot;표준 편차가있는 플롯&quot;확인란을 사용하여 플러그인의 출력을 수정하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오. 그림 1 C-H를 참조하십시오. 참고 : &quot;표준 편차&quot;및 &quot;극좌표 변환&quot;또는 &quot;실제 반경&quot;및 &quot;극좌표 변환&quot;을 사용하는 프로토콜 출력의 예(SD) 값은 대상의 방사형 픽셀 강도 스캔 사이의 차이를 나타냅니다. 또한 &quot;ROI 선택&quot;에 유의하십시오. 또한 &quot;ROI&quot;선택 사항은 그림 1C 및 1D 와 그림 1E 및 1F 에 각각 표시됩니다. 픽셀 단위로 측정 된 ROI 개요 길이에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 &quot;길이&quot;행을 선택합니다. </li></ol></li><li> 생성 된 &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;에서 &quot;List&quot;명령을 사용하여 그레이 스케일 이미지의 X, Y 열 두 개와 RGB 이미지의 X 및 Y 열 데이터에 표시된 값을 플롯합니다.이 중 Y0, Y1, Y2 및 Y3 열은 정수 및 개별 (빨강, 녹색 및 파랑) 색상 채널 픽셀 강도 값으로 채워집니다. </li></ol></li><li> 다중 ROI 클록 스캔 플러그인 - 다중 ROI ( <strongclass = &quot;xfig&quot;&gt; 그림 2 ) : <ol><li> ROI가 여러 개인 이미지를 엽니 다. </li><li> &quot;Analyze | Tools | ROI Manager&quot;를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. </li><li> 순차적으로 개요 (단계 2.1.2 참조)하고 ROI 관리자 창에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 ROI 관리자에 각 ROI를 추가하십시오. 이미지 내의 모든 ROI에 대해이 작업을 수행하십시오. ROI 메트릭이 중요한 경우 &quot;Analyze | Measure&quot;명령을 사용하십시오. <ol><li> 다중 분할 라인 선택의 예는 그림 2A 를, 다중 다각형 선택의 예는 그림 2E를 참조 하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Plugins&quot;메뉴에서 &quot;Multi Clock Scan&quot;을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다. </li><li> 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 필요한 경우 단계 2.1.4.2에 따라 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다. </li><li> 필요한 경우 opt를 선택하십시오.표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation) &quot;상자를 선택하여 SD 막대를 사용하여 평균 클록 스캔 프로파일을 플롯합니다. 그림 2 C 와 D를 참조하십시오. 참고 : 계산 된 SD 값은 서로 다른 물체의 적분 클럭 스캔 프로파일 간의 편차를 나타냅니다. 또한 플러그인 창에서 &quot;선택한 ROI 수&quot;에 대한 정보가 표시된 행을 기록하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오. </li></ol></li><li> 생성 된 &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;에서 &quot;List&quot;명령을 사용하여 &quot;Plot Values&quot;창에 표시된 값을 플로팅하십시오. 컬러 채널 별 열 지정에 대해서는 &quot;멀티 클록 스캔 프로파일 플롯&quot;창 범례를 참조하십시오. </li><li> ROI에는 번호가 매겨지고 주어진 컬러 채널에 대한 클록 스캔 프로파일은 ROI가 윤곽이 그어지고 ROI 관리자에 추가 된 순서와 동일한 순서로 그려집니다. </li></ol></li><li> 멀ROI 클럭 스캔 플러그인 - 이미지 스택 작업 ( 그림 3 ) : <ol><li> 관심있는 이미지 스택을 엽니 다. </li><li> &quot;Analyze | Tools | ROI Manager&quot;를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. </li><li> 스택 내의 이미지의 ROI를 요약하고 2.1.2 및 2.2.3 단계에서 설명한대로 ROI 관리자에 추가하십시오. ROI 메트릭에 관심이 있다면 &quot;Analyze | Measure&quot;명령을 사용하십시오. </li><li> &quot;Plugins&quot;메뉴에서 &quot;Multi Clock Scan&quot;을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다. </li><li> 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 단계 2.1.4.2에서 설명한대로 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다. </li><li> &#39;표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation)&#39;상자를 선택하여 SD 막대가있는 평균 시계 스캔 프로파일을 플롯하는 옵션을 선택하십시오. 참고 : 계산 된 SD 값은 이미지 sta에서 선택한 오브젝트의 서로 다른 인스턴스 간 차이를 나타냅니다ck. 또한, &quot;스택의 이미지 수&quot;에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 라인을 주목하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;창에서 &quot;Plot Values&quot;창에 표시된 값을 플롯하려면 &quot;List&quot;를 클릭하십시오. 여기서 Y 열 번호는 스택 내의 이미지 위치를 나타냅니다 (1). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li>
<li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535(2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
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<li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na%2B%2FK%2B+pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li>
<li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li>
<li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).</li>
<li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na%2FK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li>
<li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).</li>
<li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4701926/">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).</li>
<li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells%3A+Application+to+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해 관계 또는 다른 이해 상충이 없다고 선언합니다.

클럭 스캔 프로토콜 : 클록 스캔 프로토콜은 이미지 분석의 빠르고 간단한 도구입니다. 선형 픽셀 강도 스캔 또는 ROI의 평균 픽셀 강도 계산과 같은 기존의 일반적인 이미지 분석 방법과 비교하여이 프로토콜의 이점은 이전 출판물 1 , 9 에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서,이 프로토콜은 물체의 경계선과 같은 ROI 중심으로부터 다른 거리에 위치한 픽셀의 강도 또는 물체 외부의 사전 결정된 위치 (배경)를 정량화하여 적분 방사형 픽셀 강도 프로파일을 생성 할 수있게합니다. 후자 때문에 각 ROI의 클럭 스캔 프로파일은 (생물학적 응용에서)이 프로파일을 로컬, 샘플 내 또는 샘플 간 비 균일성에 덜 의존하게하는 즉각적인 배경에 대해 항상 보정 될 수 있습니다 라벨링 / 염색에서뿐만 아니라현미경 광원의 강도 또는 형광 노출 시간. 시계 스캔 프로파일의 객체 크기 및 형태 독립성은 &quot...

이 작업의 목표는이 유형의 이미지 분석에 관심이있는 모든 연구원이 플랫폼없이 무료로 사용할 수있는 클록 스캔 프로토콜을 제시하는 것입니다. 클럭 스캔 프로토콜은 2006 년 1 월에 개발되었으며 볼록형 관심 영역 (ROI) 내에서 기존의 픽셀 강도 정량화 방법을 개선하기위한 목적으로 개발되었습니다.이 방법은보다 우수한 통합 용량과 향상된 공간 해상도를 제공합니다. 수집하는 동안 프로토콜은 &quot;배경&quot;픽셀 강도를 측정 할 목적으로 ROI 센터에서 경계까지 스캔 한 여러 방사형 픽셀 강도 프로파일 또는 ROI 외부의 미리 결정된 거리를 순차적으로 수집합니다. 프로토콜은 스캔 방향으로 측정 된 셀 반경에 따라 이러한 프로파일의 크기를 조정합니다. 따라서 각 개별 방사형 스캔의 중심에서 ROI 경계까지의 거리는 항상 X 축의 100 %입니다. 마지막으로,이 프로그램은이 Individualu1 개의 통합 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일로 프로파일 링된다. 스케일링 때문에 &quot;클럭 스캔&quot;프로토콜에 의해 생성 된 평균 픽셀 강도 프로필은 ROI 크기 나 ROI 모양에 대한 합리적인 범위 내에서도 결정되지 않습니다. 이 방법을 사용하면 다른 ROI의 프로파일을 직접 비교하거나 필요할 경우 평균화 또는 뺄셈을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 물체 외부에 위치한 픽셀의 평균 강도를 간단히 뺄셈하여 배경 잡음에 대한 모든 물체의 적분 픽셀 강도 프로파일을 수정할 수있게합니다. 그것은 생물학적 샘플에서만 테스트되었지만, 우리의 프로토콜은 원점 (point source)에서 물질의 확산과 같은 물리적 또는 화학적 프로세스의 이미지를 연구하는 데 사용되는 기존의 다른 이미지 분석 도구에 가치있는 추가 기능을 제공합니다 ) 1 . 그러나 원본 이미지 분석 방법의 주요 한계는 프로토콜이비주얼 베이직 6 (VB6) (코드, 따라서 플랫폼에 따라 다르고 배포하기가 어려웠습니다 (VB6 필요).)이 문제를 해결하고 다른 수사관 2 와 비슷한 최근의 노력에 동참하기 위해 VB6 클록 스캔 프로그램 코드를 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 및 플랫폼 독립적 인 이미지 분석 프로그램 인 ImageJ 3 및 Fiji ImageJ 4 와 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 통합 할 수 있습니다. 여러 개의 ROI와 이미지 스택을 처리하기위한 원래의 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 많은 이미지 분석 애플리케이션은 여러 객체의 통계 분석을 수행하는 것과 관련하여 사용자 친화적이지 않으므로 종종 대표 데이터 만 표시됩니다. 다중 Clock Scan ImageJ 플러그인을 사용하면, 동시에 여러 객체의 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 현미경 데이터의 견고한 통계적 평가,단일 셀 / 객체의 신호 강도 분포와 관련하여이 플러그인 확장을 사용하여 가능합니다. 여기에서는 클럭 스캔 플러그인을 설명하고 이미지 분석에서 해당 응용 프로그램의 예를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>컴퓨터</td><td>아래 나열된 소프트웨어와 호환되는</td><td>모든</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 또는 Fiji ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ https://fiji.sc/ 또는</td> <td>Java 1.8 이상</td></tr><tr><td>시계 스캔 플러그인</td><td>프리웨어</td><td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td> <td>Clock_Scan-1.0.1 jar 및 Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td></tr>와 함께 번들로 제공됨 <tr><td>Origin 9.0</td><td>OriginLab</td><td>미국 매사추세츠주 노샘프턴</td><td>이 프로그램은 원본 Clock Scan 데이터의 일부 그래프를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 기능을 수행하기 위해 다른 그래픽 소프트웨어를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : imagej plugins

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜은 클로즈 또는 세그먼트 화 된 볼록한 관심 영역을 테두리, 내부 및 외부 (배경) 내에서 평균 픽셀 강도를 정량화하는 효율적인 도구로서, 평균 적분 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일. 이 프로토콜은 원래 Visual Basic 6 스크립트로 2006 년에 개발되었지만 배포가 제한적이었습니다. 이 문제를 해결하고 다른 사람들의 비슷한 노력에 동참하기 위해 원본 시계 스캔 프로토콜 코드를 ImageJ 또는 피지 ImageJ와 같은 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 이미지 분석 프로그램과 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 변환했습니다. 또한 이러한 플러그인에는 관심 영역 및 이미지 스택의 여러 분석과 같은 원래 프로토콜의 기능 범위를 확장하여 몇 가지 새로운 기능이 추가되었습니다. 프로그램의 후자의 기능은 변경 사항을 결정하는 것이 중요합니다 응용 프로그램에서 특히 유용합니다시간과 위치. 따라서 생체 이미지 스택의 시계 스캔 분석은 단일 세포 내에서의 Na + 또는 Ca ++ 의 확산뿐 아니라 시냅스 집단에서의 확산 활동 ( 예 : Ca ++ 파도) 분석에 잠재적으로 적용될 수 있습니다 - 연결 또는 갭 접합 - 결합 된 전지. 여기에서는 이러한 새로운 클럭 스캔 플러그인에 대해 설명하고 이미지 분석에서 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여줍니다.

설명 목적으로 여기에 사용 된 이미지는 이전 세포 및 조직 생물학 연구 5 , 6 , 7 및 Allen Mouse Brain Atlas 8 에서 작성된 데이터베이스에서 가져온 것입니다. 두 플러그인 모두 ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 및 피지 ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 프로그램 환경을 사용하여 성공적으로 테스트되었습니다. 그림 1 은 표준 클록 스캔 플러...

이 논문은 &#39;Clock Scan&#39;이미지 분석을위한 두 가지 새로운 ImageJ 플러그인을 설명합니다. 이 플러그인은 원본 Visual Basic 6 프로그램의 기능을 확장하고, 가장 중요한 것은 ImageJ 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지와 함께 번들로 제공하여 대규모 연구 커뮤니티에 프로그램을 제공 할 수있게합니다.

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

이 시계 방향 스캔(clock scan) 프로토콜의 전반적인 목표는 선택된 관심 영역(region of interest) 내부, 경계 및/또는 외부의 평균 픽셀 강도를 빠르게 특성화하는 것입니다. 이 방법은 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 이미지 분석가에게 특정 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도에 대해 교육할 수 있습니다. 여기서 시계 방향 스캔 기술의 주요 장점은 궤도 상에서 단일 또는 다중 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 빠르게 특성화하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.표준 클락 스캔 분석을 위해, 해당 ImageJ 프로그램의 파일(File) 메뉴에서 열기(Open)를 선택하여 분석하고자 하는 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기서는 특정 단백질이 표지된 뉴런이 포함된 조직 절편을 분석합니다. 적절한 그리기 도구를 선택하여 관심 영역(ROI)의 외곽선을 그립니다.파일(File) 메뉴에서 플러그인(Plugins) 및 클락 스캔(Clock Scan)을 선택하여 표준 클락 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니다. 이때 외곽선이 자동으로 추가된 관심 영역 관리자(region of interest manager) 창도 함께 열립니다. 플러그인 옵션 창에서 스크롤 바를 사용하여 관심 영역 중심의 x 및 y 좌표를 적절하게 변경하십시오.객체 외부의 배경 영역을 어느 정도까지 스캔 범위에 포함할지에 따라, 스캔 제한 스크롤 바를 사용하여 스캔 제한 범위를 조정하십시오. 실험적 적절성에 따라 실제 반경, 배경 제거, 극좌표 변환 및/또는 표준 편차 포함 플롯 체크 박스를 선택하십시오. 그 다음, 확인을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오.분석이 완료되면, list 명령어를 사용하여 추가 분석을 위한 수치 데이터에 액세스하십시오. 여러 영역에 대한 클록 스캔 분석을 수행하려면, 여러 관심 영역이 포함된 이미지 파일을 엽니다. 예를 들어, 여기서는 앞서 시연한 것과 같이 동일한 조직 절편 내에서 캡처된 프레임 패널을 분석하겠습니다.Analyze를 클릭한 다음 Tools, 이어서 Region of Interest Manager를 선택하고, 적절한 그리기 도구를 사용하여 각 관심 영역의 외곽선을 그립니다. 분절선(segmented line) 도구는 비대칭 관심 영역을 선택하거나 배경 라벨링을 제외할 때 유용합니다. 관심 영역을 선택할 때마다 Region of Interest Manager 창에서 Add를 클릭하여 각 영역을 관리자에 추가합니다.Plugins 메뉴에서 Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 열고, 필요에 따라 스캔 제한(scan limit)을 재설정하십시오. 실험 상황에 맞게 표준 편차 표시 및/또는 배경 제거(subtract background) 확인란을 선택하십시오. 그런 다음 OK를 클릭하여 프로토콜을 실행하면 두 개의 결과 그래프 창이 생성됩니다.이미지 스택의 클록 스캔 분석을 위해, 관심 있는 이미지 스택을 엽니다. 여기서는 세포 내 전극 자극 전후로 촬영된, 칼슘 민감성 형광 물질로 라벨링된 단리된 후근신경절(dorsal root ganglion)의 이미지 스택을 분석합니다. 이미지 스택 내에서 관심 영역을 지정합니다.방금 시연한 것과 같이 선택한 이미지 스택을 관심 영역 관리자에 추가하고, Multi Clock Scan을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니다. 필요에 따라 스캔 제한을 재설정하고, 실험 조건에 적절하게 표준 편차 플롯 확인 및/또는 배경 제거 상자 항목을 체크합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로토콜을 실행하면 두 개의 출력 플롯 창이 생성됩니다.형광 표지된 뉴런의 조직 절편에 대한 이 대표 분석에서, 관심 단백질의 밝은 신호를 따라 관심 영역(region of interest)을 설정하고, 표준 클록 스캔(clock scan) 분석을 수행하여 관심 영역의 중심부터 설정된 스캔 제한선까지의 방사형 픽셀 강도 스캔 데이터를 수집하였습니다. 방사형 스캔 값은 스캔 방향의 관심 영역 반지름을 기준으로 정규화되었습니다. 이를 평균하여 통합 방사형 픽셀 강도 프로파일을 생성한 결과, 관심 단백질의 대부분이 세포의 세포막에서 측정되었음을 확인하였습니다.본 분석에서는 표준 편차 플롯을 선택했으므로, 수직 표준 편차 선은 스캔 원점으로부터 특정 거리에서의 개별 방사형 스캔 프로파일 간 픽셀 강도 차이를 나타냅니다. 본 분석에서는 앞서 시연한 것과 같이 뉴런 조직 샘플 내의 여러 관심 영역을 스캔하였으며, 이를 통해 관심 영역 관리자에 추가된 순서대로 각 스캔 객체에 대한 적분 픽셀 강도 프로파일과, 선택된 각 관심 영역에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일을 생성하였습니다.따라서 이 표준 편차 막대는 개별 방사형 스캔이 아니라 개별 객체의 적분 스캔 간의 변동성을 나타냅니다. 여기에서는 세포 내 전극을 통해 자극 전후의 서로 다른 시간에 캡처된 단일 후근 신경절 뉴런의 이미지 스택 분석을 수행하였습니다. 분석이 끝나면, 스택 내 서로 다른 이미지에 나타난 관심 객체 개별 인스턴스의 적분 픽셀 강도 프로파일과 해당 객체의 모든 인스턴스에 대한 평균 픽셀 강도 프로파일이 표시되었습니다.또한, 클락 스캔 이미지 스택의 표준 편차 분석은 이미지 스택 전체의 적분 스캔 간 데이터 변동성을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 클락 스캔 플러그인을 사용하여 픽셀 강도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 플러그인을 개발한 목적은 모든 연구자가 이러한 유형의 이미지 분석을 자유롭게 이용할 수 있도록 하기 위함이었습니다.우리는 클락 스캔(clock scan) 프로토콜이 생물학적, 화학적, 물리적 이미징 응용 분야를 포함하여 다양한 연구 영역에서 활용될 것이라고 믿습니다. 이러한 클락 스캔 플러그인을 지속적으로 개발하고 운영함에 있어, 이 도구들을 개선하는 방법에 대한 관심 있는 분들의 모든 피드백과 제안을 감사히 받겠습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

출처: Mukherjee, K., et. al. 연속 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 뇌 미토콘드리아의 분석.J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 준비 과정을 보여줍니다.  미토콘드리아 초미세 구조를 시각화하기 위해 연속 블록 페이스 주사 전자 현미경(SBFSEM)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 이미징 및 분석을 통해 축삭 및 수지상 신경 세포 구획의 형태 및 공간 분포를 정밀하게 매핑할 수 있습니다.

 Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope(직렬 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 신경 미토콘드리아의 이미징)

이 논문은 두 개의 새로운 오픈 소스 ImageJ 플러그인인 Cell Concentration Calculator 및 Migration Assay Counter를 통해 혈구계 및 이동/침입 현미경 사진의 정량화에 대해 설명합니다.  또한 이미지 획득 및 보정 프로토콜에 대해 설명하고 플러그인의 입력 요구 사항에 대해 자세히 설명합니다.

ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석

우리는 세그먼트와 배수 뼈 ImageJ 플러그인을 사용 하 여 뼈의 바깥 경계에 따라 2D 및 3D 이미지에 대 한 측정에 대 한 워크플로 제시. 이 방법은 보다 효율적이 고 정확한 현재 수동 손 윤곽을 그리는 접근 보다 이며 레이어, 레이어 quantifications, 현재 상용 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다 제공 합니다.

외부-경계 지원 세분화 및 정량화 Imagej 플러그인에 의해 배수 뼈의

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

여기 우리가 투명 neurovascular 유령 조작 및 거기에 흐름에 대 한 단순화 된 방법을 제시. 우리 여러 중요 한 매개 변수를 선택 하 고 필드 정확도에 그들의 관계를 보여 줍니다.

Meso 스케일 입자 이미지 Velocimetry 혈관 흐름에서 체 외에서 의 연구

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.

세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

이 프로토콜은 적극적으로 수축심장 trabecula ex vivo에서sarcomere, 칼슘 및 거시적 기하학적 기하학적 데이터의 컬렉션을 제공합니다. 이러한 동시 측정은 세 가지 이미징 양식의 통합에 의해 가능하게됩니다.

동시 브라이트필드, 형광, 및 수축 심장 Trabeculae Ex Vivo의 광학 일관성 지형 이미징

이 방법은 콜로니 형성 단위(CFU)를 플레이트하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 미생물 풍부도를 정량화하고 전체 파리 균질물 샘플의 초파리 마이크로바이옴에 적용됩니다. CFU는 여기에 제공된 자동 이미지 분석 소프트웨어로 계산됩니다.

초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수

배우세요 ImageJ 플러그인을 활용한 클록 스캔 이미지 분석 기법으로, 관심 영역 내 픽셀 강도를 신속하게 특성화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 신경과학 및 다양한 생물학적 이미징 연구에 활용됩니다.

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

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