세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조 Xenopus 배아 발달

이 실험의 전반적인 목표는 빛을 사용하여 온전한 세포와 제노푸스 배아에서 미토겐 활성화 단백질 키나아제 신호 경로를 제어하는 것입니다. 이 방법은 키나아제 활성의 시간적 조절이 세포 분화 및 배아 발달 중 자기 결정을 어떻게 조절하는지와 같은 세포 및 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토겐 활성화 단백질 키나아제 활성이 온전한 세포와 발달 중인 배아와 같은 다세포 유기체에서 가역적으로 제어될 수 있다는 것입니다.

이 방법은 Xenopus 배아 발달 중 신호 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 socotra, zebrafish 또는 mouse와 같은 다른 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다. 오늘은 제 연구실의 대학원생인 비슈누 크리슈나무르티(Vishnu Krishnamurthy)가 그 절차를 시연할 것입니다.

그리고 제 연구실의 포스트 스타인 오로라 터전(Aurora Turgeon)은 제노푸스(Xenopus) 배아와 관련된 모든 절차를 시연할 것입니다. 먼저, 60mm 페트리 접시의 멸균 PLL 코팅 커버 슬립에 오토클레이브 멸균 PDMS 챔버 1개를 배치하여 세포 배양 장치를 조립합니다. 다음으로, 0.5mL의 0.25%트립신을 사용하여 6웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에서 pHK21 세포를 분리합니다.

hemocymeter를 가진 세포 조밀도를 세기 후에, 200 microliters의 세포 배양 매체에 있는 20, 000의 세포를 가진 약실을 씨를 뿌린다.세포 도금 후에 24 시간, 제조자의 의정서에 의하여 PCaA X 플라스미드의 CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG의 50에서 100 nanogram로 세포를 transfection. 형질주입 3시간 후, 배지를 200마이크로리터의 신선한 배양 배지로 변경하고 섭씨 37도의 인큐베이터와 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하여 세포가 하룻밤 사이에 회복할 수 있도록 합니다.

다음 날, 먼저 세포 배양 배지를 200마이크로리터의 이산화탄소 독립 배지로 교체하여 광유전학 유도 및 이미징을 시작합니다. 그런 다음 데이터 수집 프로토콜을 설정합니다. 광유전학적 자극을 위해 488 nonometer excitation FITC 채널을 선택하고, mCherry 표지 단백질의 세포 국소화를 추적하기 위해 561 nanometer excitation CRITC 채널을 선택하십시오.

대물렌즈 창 가까이에 파워 미터를 배치하여 청색광의 세기를 측정합니다. 2마이크로와트의 총 전력은 CIBN CRY2-PHR 결합을 유도하기에 충분합니다. 5초 간격으로 타임스탬프 획득을 설정합니다.

그리고 총 획득 시간은 2분입니다. 목표 창에 적절한 인덱스 매칭 자료를 적용합니다. 세포 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 명시야 모드를 사용하여 안안대를 사용하여 커버슬립 표면의 세포에 초점을 맞춥니다.

다음으로, 현미경 스테이지를 움직여 녹색 조명 아래에서 형질 주입된 세포를 찾습니다. FITC 및 CITC 채널 모두에서 일련의 타임스탬프 이미지를 기록합니다. 기본 샘플 이미지는 원형질막에 국한된 CIBNGPCAAX를 보여줍니다.

이것은 청색광 시뮬레이션 전의 CRY2 mCherry raf1의 스냅샷이며, 이 이미지는 청색광 자극의 10회 펄스 후 CRY2 mCherry raf의 스냅샷을 보여줍니다. 색조 파란색 LED를 두 개의 브레드보드에 삽입하고 전류 제한 저항기로 연결하여 LED 어레이를 만듭니다. 브레드보드를 알루미늄 상자에 넣습니다.

두 개의 금속선을 삽입하여 보드를 전원 공급 장치에 연결합니다. 라이트 박스를 이산화탄소 인큐베이터 내부에 넣을 때 와이어의 길이가 충분한지 확인하십시오. 그런 다음 투명 광 확산기를 라이트 박스의 덮개 역할을 하도록 놓습니다.

마지막으로 전압 입력 범위에서 각 LED의 전력 출력을 보정합니다. 24시간 PC12 세포 분화 분석을 위해 제곱센티미터당 2밀리와트의 영점 전력을 사용합니다. LED 어레이를 5%의 이산화탄소가 보충된 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓습니다.

금속선을 사용하여 전원 공급 장치에 연결하고 LED의 전원을 제곱센티미터당 2밀리와트의 영점으로 설정합니다. 형질주입된 PC12 세포가 들어 있는 12웰 플레이트를 LED 어레이의 창에 놓습니다. 모든 웰이 완전히 조명되도록 플레이트를 정렬합니다.

24시간 동안 연속광 조명을 적용합니다. 차별화된 셀을 이미지화하려면 단일 스냅샷 데이터 수집을 설정합니다. GFP 및 TexasRed 채널 모두에 200밀리초를 사용합니다.

GFP 및 TexasRed 채널 모두에서 형질 주입된 세포의 이미지를 캡처하고 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. 모세관 풀러로 유리 모세관을 당겨 RNA 미세주입용 바늘을 제작하여 이 절차를 시작합니다. 0.2 XMMR에 희석한 3% 시스테인을 15분 동안 처리하여 배아에서 젤리 코트를 제거합니다.

배아를 3% 폴리슈크로스로 옮기고 미세주입을 위해 영점 5 XMMR 용액을 사용합니다. 각 배아에 1나노그램의 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA에 500피코그램을 정확하게 주입합니다. 그런 다음 미세주입된 배아를 실온의 미세주입 용액에서 배양합니다.

배아가 med gastrula 단계에 도달하면 0.2x MMR 용액으로 옮기고 원하는 발달 단계까지 배양을 계속합니다. 그런 다음 블루라이트 처리를 위해 집에서 만든 LED 어레이에 12웰 플레이트를 놓습니다. 12웰 플레이트 위에 거울을 놓아 배아의 완전한 청색광 조명을 보장합니다.

원하는 시간 동안 청색광에 노출된 후 조직학적, 웨스턴 블롯 또는 유전자 발현 분석을 위해 배아를 수확합니다. 이 이미지는 영점에서 제곱센티미터당 2밀리와트에서 24시간 동안 청색광 자극 후 CRY2-2A-2CIBN으로 형질전환된 PC12 세포의 다채널 스냅샷을 보여줍니다. GFP와 mCherry 기자가 모두 보입니다.

원은 분화된 세포를 표시하고 사각형은 분화되지 않은 세포를 표시합니다. 여기서 세포는 청색광 자극이 사용되지 않았다는 점을 제외하고는 이전 이미지와 동일한 방식으로 처리되었습니다. 구별은 보이지 않습니다.

이 세포는 구조적으로 활성화된 raf1인 raf1 GFPCaaX로 transfection한 후 대표적인 결과를 보여줍니다. 원과 사각형은 각각 차별화된 셀과 분화되지 않은 셀을 표시합니다. 이 히스토그램은 CA-Raf1로 transfection된 PC12 세포, CRY2 mCherry raf1 및 CIBN GFP Caax와 동시 transfection, CRY2A 2CIBN과 단독으로 transfection된 세포의 분화 비율을 보여줍니다.

청색광에 노출된 세포만이 유의미한 분화를 보였습니다. 이 이미지는 MRNA 주입 및 광선 처리가 없는 정상 Xenopus 배아의 형태를 보여줍니다. 이 이미지는 CRY2 2A2CIBN MRNA를 주입하고 청색광 자극을 받은 배아를 보여줍니다.

CRY2 2A2CIBN 주입 배아를 청색광으로 처리하여 raf1을 활성화하면 머리 부위에 이소성 꼬리와 같은 구조가 유도됩니다. 이 절차를 따르면 mitogen activated protein kinase pathway의 단계 특이적 활성화가 유전자 발현을 어떻게 조절하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 광유전학적 방법은 유사한 활성화 메커니즘을 가진 다른 신호 경로를 제어하기 위해 일반화될 수 있습니다.