Vestibular Schwannoma 연구를위한 통합 방법론 체계

본 절차의 전반적인 목적은 수술실에서 수령한 인간 전정신경초종 샘플을 처리하여 일차 세포 배양 및 종양 분비물을 수집하는 것입니다. 이 방법은 다수의 생체 분자 분석에 사용할 인간 일차 종양 샘플을 수령, 보관 및 처리하는 최선의 방법에 관한 전정신경초종 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소 조작 배양법을 사용하여 인간 일차 전정신경초종 세포를 증식시킨다는 점입니다.

이 기술의 함의는 배양된 세포에서 유망한 치료 후보 물질을 직접 테스트할 수 있기 때문에 전정신경초종 치료로 확장됩니다. 수술실에서 운반 시 사용한 얼음에서 실험실의 층류 후드로 갓 채취한 전정신경초종 또는 대이개신경 샘플이 담긴 검체 용기를 옮기는 것으로 시작하십시오. 멸균 집게를 사용하여 검체를 1.4 mL의 1배 외액 PBS가 채워진 3개의 1.5 mL 튜브 중 첫 번째 튜브로 조심스럽게 옮기십시오.

검체가 담긴 각 튜브의 뚜껑을 닫고 가볍게 흔들어 세척합니다. 샘플을 건조한 60 millimeter 페트리 접시에 놓고 핀셋을 사용하여 혈관이 뚜렷한 부위의 모든 괴사 조직을 제거합니다. 핀셋이나 메스 칼날을 사용하여 샘플을 RNA 보존, 단백질 추출, 분비물 수집, 고정 및 세포 배양을 위한 별도의 조각으로 나눕니다.

세포 배양용으로 지정된 검체 조각을 5~8 mL의 차가운 보충 DMEM F12 배지가 들어 있는 새로운 60 mm 배양 접시에 옮깁니다. 분비물 수집용으로 지정된 전정신경초종 또는 대이개신경 조각을 빈 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 먼저 FBS가 보충되지 않은 DMEM 500 µL를 두 개의 1.5 mL 튜브에 피펫팅하여 넣습니다.

첫 번째 튜브는 종양 분비물을 수집하는 데 사용하고, 두 번째 튜브는 대조군으로 사용합니다. DMEM이 담긴 튜브 하나를 교정된 디지털 저울 위에 올립니다. 저울의 영점을 맞춘 후, 분비물 수집용으로 지정된 시편 조각을 튜브에 넣고 무게를 잽니다.

결과값을 기록하며, 이는 조직만의 무게를 나타냅니다. 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서, 튜브 내 DMEM의 부피를 시료 10 mg당 100 µL가 되도록 조정하십시오. 조직 샘플과 그에 대응하는 대조군이 담긴 튜브를 인큐베이터에 넣으십시오.

종양 또는 신경 분비물의 생물학적으로 유용한 양을 수집하기 위해 최소 72시간 동안 배양합니다. 72시간 배양 후, 1 mL 피펫을 사용하여 검체에서 분비물이 포함된 배지를 제거합니다. 반복적인 동결-해동 사이클을 방지하기 위해, 계획된 후속 분석에 따라 배지를 새 튜브에 분주합니다.

후속 응용 단계가 시작될 때까지 원래의 조직 조각, 분비물 및 대조군 DMEM을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 양손에 핀셋을 하나씩 잡고 전정신경초종 조직을 약 1 mm³ 크기의 조각으로 분리하여 배양 절차를 시작하십시오. 그런 다음 10 mm 세롤로지컬 피펫으로 배지와 종양 조각을 흡입하여 모든 내용물을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기십시오.

25 °C에서 1000G로 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리하는 동안, 60 mm 배양 접시에 보충된 DMEM F12 배지 4.7 mL와 콜라게나제(collagenase) 250 µL, 히알루로니다제(hyaluronidase) 50 µL를 혼합하여 조직 분해 배지를 준비합니다. 원심분리가 끝나면 종양 조각들이 원추형 튜브 바닥에 펠렛(pellet) 형태로 형성됩니다.

상층액을 조심스럽게 피펫으로 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 갓 제조한 효소가 포함된 붕해 배지 2 mL를 종양 부위에 첨가합니다. 조직이 이동할 수 있도록 피펫팅을 여러 번 반복한 후, 이를 60 mm 배양 접시로 옮깁니다.

배양 접시를 인큐베이터에 넣고 18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM F12 배지를 37 °C 항온 수조에서 가온합니다. 전정 신경초종 배양물이 담긴 접시를 인큐베이터에서 꺼내 클린벤치(flow hood)로 옮깁니다. 6 mL 시린지에 22게이지 바늘을 장착하여 배지가 포함된 배양액을 흡입한 후, 새로운 15 mm 원추형 튜브로 옮깁니다.

37°C에서 1000G로 5분 동안 원심분리합니다. 그동안 멸균 핀셋을 사용하여 필요한 수의 폴리델리신(polydelycine) 및 라미닌(laminin) 코팅 유리 커버 슬립을 24웰 배양 플레이트에 넣습니다. 1cm³ 크기의 종양 하나로 24~32개의 웰을 배양할 수 있으므로, 대부분의 작은 종양의 경우 8~16개의 웰에 세포를 배양하도록 계획하는 것이 적절합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고, 계획된 웰당 1mL의 세포 현탁액이 되도록 미리 데워둔 배지에 잔여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 5mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포 현탁액 2mL를 흡입한 후, 24웰 플레이트의 웰 하나에 1mL를 분주합니다. 모든 준비된 웰에 종양 세포 현탁액이 동일하게 나누어질 때까지, 2mL씩 흡입하여 각 계획된 웰에 1mL씩 분주하는 과정을 반복합니다.

24-웰 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 플레이트를 확인하여 웰 바닥에 상당한 부유물이 관찰되면, 부착 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 각 웰의 배지를 새로운 보충제 함유 DMEM F12 배양 배지로 조심스럽게 교체합니다. 부유물이 없으면 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고, 5일째에 처음으로 배지를 교체한 후 이후 3일마다 교체합니다.

이 명시야 이미지는 배양된 전정 신경초종 세포의 전형적인 조직 패턴을 보여줍니다. 일차 인간 전정 신경초종 배양물의 이 면역형광 이미지들은 녹색으로 표시된 GFP 발현 ink 80에 48시간 동안 노출시킨 후 촬영되었습니다. 적색 형광은 세포골격을 염색하는 phalloidin F actin 면역 염색이며, 청색 형광은 핵을 염색하는 dapi입니다.

삽입도는 저배율 이미지의 특정 영역을 고배율로 촬영한 이미지입니다. 이 절차를 수행할 때, 이후 단계들이 정확한 배양 기간 후에 진행될 수 있도록 분비물 샘플과 배양 샘플을 인큐베이터에 넣은 시간을 기록하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 바이러스 형질도입, 고정, 면역형광법, 약물 처리 및 RNA 추출과 같은 다른 방법들을 수행하여, 서로 다른 바이러스가 세포 내에서 어떻게 발현되는지 또는 약물 처리 후 유전자 발현이 어떻게 변화하는지와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 전정신경초종 연구 분야의 연구자들은 수술을 받은 실제 환자의 생체 내에서 일차 인간 세포가 다양한 약물에 어떻게 반응하는지 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.