Name: 생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 생체 외 현미경 기반 분석법으로 HeLa 세포의 초기 엔도솜에서 F-actin 중합을 재구성하는 방법입니다. 이 기술은 막 수송 및 액틴 역학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 및 참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여.
Divalent 양이온 (PBS-) 없이 <ol><li>준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압력가 마로 소독 (1 개 주기 121 ° C에서 15 분)으로 소독 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>이미 300 mM의 재고 솔루션을 준비: ddH 2 O.Adjust HCl. 여과기 소독 0.22 μ m를 사용 하 여 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH 크기 필터 기 공 및 4에서 저장의 10 mL에 이미의 0.204 g ° c.</li>
	<li>준비 균질 버퍼 (HB; 준비 약 100 mL): 250 m m 3 m m 이미에 자당. PH 미터를 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH를 조정 합니다. 필터-0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 4에서 저장 protease 억제제 10 m m leupeptin, 1 mM pepstatin A, 및 10 ng/mL aprotinin에 해당 하는 최종 농도에서 칵테일 ° C. 보수는 HB 사용 직전.</li>
	<li>단계 부양 그라디언트에 대 한 준비 62%, 39%, 및 35% 자당 해결책 3mm 이미, pH 7.4, 아래 설명 된 대로. 굴절 계를 사용 하 여 모든 자당 솔루션의 최종 농도 정확 하 게 결정.
	<li>준비 100 mL 3 m m 이미, pH 7.4에에서 62% 자당 해결책의 <ol>. DdH 2 O 80.4 g 자당의 감동에 의해 해산 사전 예 열 300mm 이미 재고 솔루션 및 ddH 2 O. 조정 100 mL를 채우기의 35 ° C. 추가 1 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터 및 저장소를 사용 하 여 4 ° c.에</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 35% 자당 해결책의 100ml 준비합니다. 40.6 g 300 밀리미터 이미 재고 솔루션의 ddH 2 오 추가 1 mL에 자당의 감동에 의해 해산 하 고 ddH 2 O. 조정 100 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터를 소독을 사용 하 여 0.22 μ m 기 공 크기 필터와 4에 저장를 채우기 ° c.</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 39% 자당의 50 mL를 준비합니다. 35% 자당 해결책으로 62% 자당 해결책을 희석. 4 ° c.에 게</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde (PFA)의 3 세대 dropwise 1 M NaOH를 추가 하는 동안 60 ° C에 100 ml의 PBS-사전 warmed 감동에 의해 해산, NaOH를 사용 하 여 7.4에 최종 pH를 조정. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 및 저장-20 ° c. 
	주의: 3 %PFA 독성 시 약.</li>
	<li>1 M KCl 준비 재고 솔루션입니다. DdH 2 O. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 50 mL에 감동 하 여 KCl의 3.73 g을 녹이 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>준비 50 X 집중 재고 솔루션-20에서 ddH 2 오 약 수 및 저장소에 pH 7.0과 75 mM MgOAc 2에 0.625 M Hepes 포함 ° c.</li>
	<li>준비 설치 미디어입니다. 글리세롤의 6 g 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (PVA)의 교 반에 의해 혼합. DdH 2 O 6 mL을 추가 하 고 실 온에서 2 h 이상 떠나. 추가 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)와 약 53 ° c는 PVA 해산 했다 때까지 가끔 저 어 열.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히합니다. 상쾌한을 수집 하 고 2.5% (w/v) 1, 4 추가-diazabicyclo-[2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 형광 탐지 동안 photobleaching를 방지 하기 위해. 약 30 소용돌이 해산 s. Aliquot 1.5 mL 플라스틱 튜브와 스토어-20 ° c.</li>
</ol> 2. 세포 배양 <ol><li>문화 헬러 셀 Dulbecco &#39; s 10% 태아 종 아리 혈 청, 10% 비 본질적인 아미노산, 보완 수정이 글 중간 10 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스. 37 ° c 5% CO 2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>Transfect 세포 GFP RAB5 10, 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 실험 하기 전에 24 시간 &#39; s 지침.</li>
	<li>필요할 때, 준비 endosomal 분수와 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심의 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing 단백질의 고갈에서 cytosol.</li>
</ol> 3. Endosomal 분수 준비 참고: endosomes 및 다른 가벼운 막 subcellular 분수의 간단한 준비가이 프로토콜에 설명 합니다. 필요한 경우, 순화 된 endosome 분수는 사용된 11 수 있습니다. GFP RAB5 시작 물자로 표현 confluent 셀 2 접시 (10 cm 외경; 57 c m 2)를 준비 합니다. 2 접시에 confluent HeLa 세포의 총 수는 대략 2.5 x 10 7 셀에 해당합니다. 때, 필요는 endosomes 또한 준비 될 수 있다 세포 관심 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 그리고/또한 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing, 항상 표현 GFP-RAB5의 단백질의 고갈에서.
 주의: 얼음에 분별 법 프로토콜의 모든 단계를 수행 해야
<ol><li>평평한 얼음 양동이에 젖은 금속 접시에 배양 접시를 놓고 즉시 두 번의 얼음 처럼 차가운 PBS-5 mL로 세포 세척.</li>
	<li>모든 PBS-마지막 세척에서 제거 하 고의 얼음 처럼 차가운 PBS-접시 당 3 mL를 추가 합니다. 셀 처리 동안 건조 하지 한다: 필요한 경우 적절 하 게 커버 액체와 셀 락 플랫폼에 얼음 양동이 놓습니다.</li>
	<li>는 기계적으로 유연한 고무 경찰관 (즉, 직접 만든 셀 긁는 도구)를 사용 하 여 배양 접시에서 PBS에서 셀을 제거 합니다. 빠르고, 원형 모션 접시, 접시 중간 하강 운동 뒤의 외부 주위에 먼저 요리에서 세포를 다쳤어요. 부드럽게 긁어 &#34; 시트 &#34; 연결 된 세포의. 부드럽게 얼음에 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 전송</li>
	<li>175 x g에 5 분 동안 원심 분리기와 4 ° C</li>
	<li>부드럽게 상쾌한 (SN)을 제거 하 고 펠 릿에 HB의 1-3 mL를 추가 합니다. 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 아래로 한 번 셀 resuspend 하.</li>
	<li>X g와 4 ° C. 부드럽게 제거 SN 1,355에서 7-10 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>셀 균질 수행. 
	참고: 조건 해야 부드러운 셀의 플라즈마 막 끊어집니다는 endosomes 그대로 남아 있도록 합니다.
	<li>추가 각 셀 펠 릿 (약 100 μ 셀 펠 릿 당)에 protease 억제제와 HB의 알려진된 볼륨 <ol>. 사용 하 여 1000 µ L micropipette, 부드럽게 플라스틱 아래로 셀 resuspended 때까지. 안 함 공기 방울을 소개.</li>
		<li>1 mL 투베르쿨린 주사기 22 G 바늘 HB와 미리 씻어 서와 공기 또는 거품의 무료 준비.</li>
		<li>주사기 셀 서 스 펜 션 상대적으로 천천히 ()을 피하기 위해 공기 방울을 만드는, 튜브의 벽에 바늘의 경사진된 끝 배치를 신속 하 게 연결 된 셀의 플라즈마 막에서 전단에 세포 현 탁 액을 추방.</li>
		<li>는 Homogenate (약 3 µ L)의 작은 약 수를가지고 고 유리 슬라이드에 HB의 50 µ L로 희석. 혼합 그리고 덮개 유리 coverslip로. Homogenate X 20 또는 40 X 목표 단계 대조 현미경 검사. 
		참고: 최적의 조건에서 대부분의 세포는 고장, 하지만 핵, 어두운 회색으로 표시 하 고 라운드 구조, ( 그림 1).</li>
		<li>반복 단계 3.7.3 대부분 셀까지 3.7.4 깨집니다; 일반적으로 3-6는 바늘을 통해 위아래 선 필요 하다. 단백질 결정에 대 한 homogenate의 작은 약 수 (10-30 µ L) 유지.</li>
	</ol></li> <li>1,355 g x 4에서 7 분 동안 원심 분리기 homogenate ° c. 
	참고: 후 원심 분리, 펠 릿 (핵 펠 릿;로 정의 핵 및 (postnuclear 상쾌한;으로 정의 하는 상쾌한 NP) 포함 PNS)는 cytosol와 균질 그리고 무료에 출시 세포 포함.</li>
	<li>신중 하 게 PNS를 수집합니다. 단백질을 위한 PNS와 NP의 작은 aliquots (10-30 µ L)를 유지 하 고 삭제는 NP.</li>
	<li>는 PNS PNS:62% 자당의 1:1.1 비율을 사용 하 여 함께 62% 자당 해결책을 diluting 하 여 40.6% 자당을 PNS를 조정 합니다. 공기 거품을 만들지 않고 부드럽게 하지만, 철저 하 게 혼합. 자당 농도 굴절 계를 사용 하 여 확인 하십시오.</li>
	<li>는 Ultracentrifugation 튜브의 하단에 40.6% 자당에서 PNS를 놓습니다. 신중 하 게 35% 자당 해결책의 2.5 mL와 오버레이 및 HB 원심 분리기 튜브 채울. 
	참고: 인터페이스는 명확 하 게 볼 수 있도록 계층 되어야 한다 자당 솔루션.</li>
	<li>Ultracentrifuge ̴165, 000 x g 4에서 1 시간에 대 한 그라디언트 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 지질 그라데이션 위에 흰색 레이어를 제거합니다. 다음, HB와 200 μ micropipette 컷된 팁을 사용 하 여 35% 자당 사이 endosomes를 포함 하는 인터페이스를 수집. 
	참고: endosomal 분수 체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>PNS와 endosomal 분수의 단백질 농도 결정. 
	참고:이 농도 적어도 100 µ g/mL 해야 합니다. 적어도 100 µ g/mL와 PNS를 약 2.5 x 10 7 셀 2 페 트리 접시에 성장 필요 (위의 참고 참조).</li>
</ol> 4. Cytosol 준비 참고: 준비 2 접시 (10 cm 직경; 57 cm 2) 시작 물자로 confluent HeLa 세포의. 필요할 때는 cytosol 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심 wildtype 또는 관심사의 단백질의 돌연변이 형태를 overexpressing의 단백질의 고갈에서 준비 또한 수 있습니다. Endosome 분별 프로토콜에 관해서는 얼음에 모든 단계를 수행
<ol><li>반복 단계 3.1-3.8.</li>
	<li>PNS는 원심 분리기와 ultracentrifuge ̴250, 000 x g, 4 시 45 분에 대 한 배치 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 위에 흰색 레이어를 제거 하 고 microsome 펠 렛을 방해 하지 않고 SN (cytosol 분수)를 수집 합니다. 단백질을 위한 cytosol 분수의 약 수를 유지. 
	참고:는 cytosol 생체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>는 cytosol의 단백질 농도 결정. 
	참고: 3 mg/mL 이상 이어야 한다.</li>
</ol> 5. 시험 측정 Endosome 종속 말라 합 체 외에서 참고: Endosome 종속 말라 합 두 가지 대체 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 접근 방법에서 자료는 테스트 튜브에 혼합, 고정 및는 coverslip로 전송 하며 분석 여기서 설명 하는 두 번째 방법은에서 분석 결과 수 이미징 챔버에 직접 실시 하 고 고정 고 기계적 섭 동 ( 그림 2C) 없이 분석. 이 두 번째 방법에서는, 분석 결과 혼합 하는 coverslip 테스트 튜브에서 전송 되지 않습니다 그리고 이렇게 교란, F-말라 네트워크 전송 하는 동안 물리적으로 교란 되 고의 위험을 감소 남아 있습니다. 또한,이 두 번째 방법은 F 걸 중의 시간 경과 분석와 호환 됩니다. 어느 방식으로 F-말라 합 분석에 차이가 관찰 했다에 주목 한다. 
참고: 사용 하 여 잘라 프로토콜에 걸쳐 팁.
<ol>에 테스트 튜브에 <ol><li>부드럽게 혼합 차가운 순화 GFP RAB5 endosomes (3 단계)는 얼음 처럼 차가운 1.5 mL 원뿔 테스트 튜브에 (단백질 농도)를 1시 10분의 비율로 cytosol (4 단계)와 <li>. 
		참고: 일반적인 실험은 실시 약 40-50 µ L.</li>
		<li>125 m m KCl (1 개 M KCl 재고 솔루션을 사용 하 여), 12.5 mM Hepes, 및 1.5 m m MgOAc 2 (재고 솔루션 x 50를 사용 하 여)의 최종 농도에 얼음 처럼 차가운 반응 혼합물을 조정 합니다. 다음, 10 m m leupeptin, 1 m m pepstatin, 그리고 10 ng/mL aprotinin의 최종 농도 protease 억제제와 혼합을 조정 합니다. 모든 구성 요소를 부드럽게 혼합.</li>
		<li>테스트 튜브 없이 떨고, 37 ° C에서 반응 혼합물을 포함 하 고 원하는 시간에 품 어. 
		참고: 일반적으로, 그것을 감지 말라 합 endosomes와 광범위 한 네트워크의 형성에 대 일 분에 약 3 분.</li>
		<li>원하는 시간에 (즉, 3 분 또는 30 분), 얼음에 테스트 튜브를 배치 하 여 반응을 중지 하 고 precooled 3 %PFA 솔루션의 1/10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>Polymerized 말라 얼룩 레드 오렌지 염색에 활용 된 200 단위/mL (~6.6 μ M) phalloidin의 0.3:10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>12에 혼합물의 장소 12 μ μ 마이크로 유리 슬라이드에 PVA 장착 매체의. 18 x 18 m m 2 유리 coverslipon 상단에 넣어.</li>
		<li>Confocal 현미경 검사 법으로 샘플 분석.</li>
	</ol></li> <li>이미징 챔버에 <ol><li>현미경 이미징 챔버를 사용 플라즈마 청소기 1 분 라운드 18 m m 직경 coverslip 및 라운드 35 m m 직경 20 m m 유리 바닥을 갖춘 페 트리 접시를 청소 (0.16 0.19 m m).</li>
		<li>1% β-카 세 인 단백질 바인딩 유리를 최소화 하기 위해 20 분에 있는 청소 표면 품 어. 3mm 이미와 두 번 세척.</li>
		<li>추가 endosome 고 cytosol, 같은 단계 5.1.1, 5.1.2, precooled 1.5 mL 테스트 튜브에서 혼합물 분석 결과 분석 결과 혼합물 0.1 μ g/μ rhodamine-걸을 보완.</li>
		<li>최종 굴절률 1.375 (26.5% 자당) 혼합물의 39% 자당 해결책을 사용 하 여 조정. 
		참고: 일반적으로, 동일한 볼륨 추가 됩니다; 그러나, 이것은 경험적으로 다시 자당 농도 약간 실험에서 실험을 변경 될 수 있습니다 이후는 refractomer를 사용 하 여 결정 하는 수집 된 분수의 자당 농도에 따라 조정 되어야 합니다.</li>
		<li>청소용된 35 m m 접시 (5.2.1 단계)에 혼합물을 놓고 청소용된 18 m m coverslip (5.2.1 단계)으로 커버.</li>
		<li>동요 없이 37 ° C에서 챔버 장소.</li>
		<li>형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 샘플 분석.</li>
	</ol></li></ol> 6. 이미지 Acquisition 및 분석의 말라 네트워크 <ol><li>이미지 수집 <ol><li>거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집. 
		참고: 이미지 수집 설정 63 X 1.25 나 오일 목적으로 거꾸로 스캔 confocal 현미경에 최적화 했다. 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 레이저 전원 (일반적으로 약 50%)을 조정.</li>
	</ol></li> <li>말라 네트워크의 정량화 <ol><li>형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
		<ol><li>먼저, GFP RAB5 신호를 사용 하 여 기본 개체 endosomes 식별. 그런 다음 F-말라 말라 신호 전파를 사용 하 여 개별 endosomes와 관련 된 계량 (레드 오렌지 염색 활용 Phalloidin) 보조 개체로.</li>
			<li>평균 제어 조건에 각 개체에 대 한 관련된 자료의 수를 정규화.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li>
<li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+Maturation%2C+Transport+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li>
<li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting%3A+all+WASHed+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).</li>
<li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+bodies%3A+co-ordinated+progression+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ESCRT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li>
<li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li>
<li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li>
<li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4%2C+Rab5%2C+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li>
<li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li>
<li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li>
<li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li>
<li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).</li>
<li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9,,1115쪽으로 다운스트림 전송 방지 합니다. 특히, 우리는 초기 endosomes에 F-말라 합의 순차적 단계를 분석 하 고 특성을 분자 수준에서 과정을 설명한 분석 결과 사용 합니다.
<p class="jove_content...

높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.
말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.
여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>아크로스 유기물</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH<>2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros 유기물</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun 아세테이트 테트라하이드레이트</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>플루카</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>머크 밀리포어</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>로슈</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>분자 프로브</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>폴리(비닐 알코올), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>필터 0.22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 원형 10cm 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 22G 블랙 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>멸균 Luer-slip 1mL 주사기 없음 바늘</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 유리 슬라이드</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm 유리 커버슬립</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 원심분리기 튜브</td><td>Beckman 쿨터</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 원심분리기 튜브</td><td>Beckman 쿨터</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L 옐로우 팁</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&mu; L 블루 눈금 팁</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL 시험관</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18mm 직경 원형 커버슬립</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>20mm 유리 바닥(0.16 - 0.19mm)이 있는 35mm 직경 원형 접시In</td> <td>vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>굴절계</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 초원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 초원심분리기</td><td>Beckman 쿨터</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 로터</td><td>Beckman 쿨터</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 로터</td><td>Beckman 쿨터</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼</td> 현미경 <td>칼 Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 시약 A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 시약 B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 시약 S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>수제</td><td></td><td>약 2cm의 실리콘 고무 조각, 매우 날카로운 각도로 자르고 금속 막대에 부착하거나 집게로 고정</td></tr><tr><td>굴절계</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FCS Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 f-말라 초기 endosomes에의 합

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.

초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 의해 중단 됐다. 샘플 수집 그리고 현미경 슬라이드에 입금 했다. 마지막으로, F 걸 phalloidin (그림 3A)으로 밝혀졌다. 다음 중 합 과정 뿐만 아니라 초기 endosomal 막에 F 걸의 nucleation 급속 하 게 발생 했습니다. 실제로, F 걸 수 이미 구상 될 endosomes 1 분 이내에 반응 (<strong class="xfig...

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

이 현미경 기반 인비트로(in vitro) 분석의 전반적인 목표는 인비트로 환경에서 엔도좀의 액틴 중합을 연구하는 것입니다. 이 방법은 산성 경로 내 액틴의 역할과 같이 막 수송 및 액틴 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 기술의 주요 장점은 시험관 내에서 초기 엔도좀 막 위의 F-actin 핵 형성 중합을 재구성할 수 있다는 점입니다.이를 통해 이 복잡한 일련의 반응들을 화학적으로 조작할 수 있게 됩니다. 해당 절차의 시연은 연구실의 Jorge Larios와 Olivia Muriel이 진행하겠습니다. 먼저 HeLa 세포가 담긴 배양 접시를 평평한 아이스 버킷 안의 젖은 금속판 위에 올려놓는 것으로 시작하십시오.그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5 mL로 세포를 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후 PBS를 제거하고, 디쉬당 얼음처럼 차가운 PBS 3 mL를 추가합니다. 그런 다음 유연한 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하여 디쉬 바깥쪽을 따라 빠르게 원을 그리며 세포를 긁어냅니다.이어서 디쉬 중앙에서 아래 방향으로 움직입니다. 부착된 세포 시트를 얻기 위해 부드럽게 긁어냅니다. 다음으로 입구가 넓은 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 얼음 위에 놓인 15 milliliter 원추형 폴리프로필렌 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.175 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛에 1~3 mL의 균질화 버퍼를 첨가합니다. 입구가 넓은 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 재현탁시키기 위해 부드럽게 한 번 피펫팅합니다.그런 다음 1,355 ×g, 4 °C에서 7~10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 각 세포 펠릿에 프로테아제 억제제가 포함된 균질화 버퍼를 정해진 양만큼 첨가합니다. 그리고 세포가 다시 현탁될 때까지 공기 방울이 생기지 않도록 파이펫으로 조심스럽게 상하 혼합합니다.1mL 투베르쿨린 주사기를 균질화 완충액으로 헹구고 공기나 기포가 없는지 확인합니다. 그 다음, 기포가 생기지 않도록 세포 현탁액을 주사기에 천천히 채웁니다. 바늘의 사면 팁을 튜브 벽면에 밀착시킨 후, 세포 현탁액을 빠르게 밀어내어 부착된 세포의 세포막을 전단합니다.그런 다음 각 균질액의 소량을 취해 유리 슬라이드 위의 homogenization buffer 50 µL로 희석하고 혼합합니다. 그 후 유리 커버 슬립으로 덮고, 2

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질 성분을 사용하여 구슬 표면에 액틴 혜성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 시스템은 세포에서 발견되는 돌출 구조를 모방하고 단순화 된 방식으로 힘 생산의 생리적 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

배우세요 생체 외 현미경 기반 분석법으로 HeLa 세포의 초기 엔도솜에서 F-actin 중합을 재구성하는 방법입니다. 이 기술은 막 수송 및 액틴 역학 연구에 활용됩니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

더 많은 동영상 탐색