Name: 라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 학습하세요 실시간 고처리량 cAMP 분석법을 사용하여 후각 수용체 활성화를 평가하는 방법을 배우세요. Hana3A 세포를 이용한 이 기법은 약리학적 특성 분석에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

작품은 중국 국립 과학 재단 (31070972), 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (16ZR1418300), 혁신적인 연구 팀의 상하이 시 교육 위원회, 상하이 동부에 대 한 프로그램에 의해 지원 되었다 학술 프로그램 (J50201), 그리고 중국 (2012CB910401)의 국가 기본 연구 프로그램.

1. Culturing 및 유지 보수의 Hana3A 셀 <ol><li>최소 필수 매체 (MEM)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100의 10 mL에 있는 유지 세포 µ g/mL 페니실린-스, 그리고 1.25 µ g/mL 암포 B 100 m m 5% CO 2와 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서 셀 문화 요리. 모든 다른 통로와 1 µ g/mL puromycin 플라스 (참조 소개)의 안정 되어 있는 transfection를 유지 하기 위해 추가. 
	참고: 클래스 II 생물 안전 캐비닛 되도록 무 균 환경에서에서 세포 배양과 관련 된 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>100mm 요리 2-3 일 마다 10-20%의 비율로 subculture.</li>
</ol> 2. Transfection에 대 한 셀을 도금 <ol><li>세포 생존 능력을 보장 하 고 합류 추정 단계 대조 현미경 Hana3A 세포 관찰.</li>
	<li>세포 배양 접시에서 모든 매체를 발음.</li>
	<li>접시에 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 하 고, 접시, 소용돌이, PBS 발음 하 여 세포를 씻어.</li>
	<li>접시에 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) 3 mL를 추가합니다. 믹스 1 분 또는 때까지 모든 셀이 해상. 
	참고: 필요에 따라 현미경 아래 접시의 하단에서 분리 하는 세포의 진행을 관찰.</li>
	<li>비활성화 trypsin 10 %FBS 피 펫의 덩어리 헤어를 위아래로 MEM의 5 mL을 추가 하 여 셀 미사 
	참고: transfection 전에 도금, 사용 매체 없어야 항생제 합니다. 항생제의 추가 transfection 효율 저하 될 수 있습니다.</li>
	<li>페 수에 번호판의 수에 따라 15-mLl 튜브에 세포의 적절 한 금액을 전송. 각 96 잘 접시, 접시 2 x 10 6 셀, 또는 100% confluent 100 mm 접시의 약 1/5, 주는 2 x 10의 세포 수 4 셀 잘 또는 약 15-30% 합류의 밀도 잘 당. 5 분 동안 200 x g에서 튜브 원심 및 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 
	참고: 셀 overgrowing 또는 자극 전에 셀 undergrowing을 피하기 위해 96 잘 접시에 도금 될 올바른 금액 계산.</li>
	<li>10% FBS 15 mL로 튜브 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 셀의 덩어리 헤어 대용량 메모리의 적절 한 금액을 추가 합니다. 각 96 잘 접시 resuspend 10 %MEM 6 mL와 함께 셀 FBS. 
	참고: 수 튜브에 공기 방울을 생성 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>는 저수지로 정지 셀을 추가합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 음에 셀의 50 µ L 플라스틱. 5% CO 2와 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol> 3. 플라스 미드의 transfection <ol><li>transfection, 이전 관찰 단계 대조 현미경 잘 당 약 30-50%의 적절 한 합류를 보장 하는 인큐베이터 돌아갑니다 도금된 셀.</li>
	<li>준비 미리로 태그 또는 구성 11 , 21 , , 22 28, 액세서리 요소 구성 (RTP1S 22 , 36과 M3R 23), 바이오 센서 변종 구성 29 , 30 miniprep에 의해. DNA 농도 분 광 광도 계에 의해 측정 하 고 필요에 따라 증류수와 플라스 미드 DNA 농도 (예를 들어, 100 ng / µ L을)을 조정.</li>
	<li>Transfection 혼합물의 준비 <ol><li>표 1에 따라 각 96 잘 접시 MEM의 500 µ L에 플라스 미드 transfection 혼합물 준비. 
		참고: 다른 ORs 같은 96 잘 접시에 테스트 하는 경우 transfection 혼합물 및 플라스 미드 DNA 추가 금액의 볼륨 해야 합니다 적응 주어진된 OR와 transfected 우물의 수의 기능에.</li>
		<li>준비 transfection 지질 중재 시 약 MEM.의 500 µ L에서의 18 µ L 튜브에 transfection 혼합물</li>
	</ol></li> <li>아래로 pipetting transfection 혼합물으로 플라스 미드 혼합물을 혼합. 15 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>10 %MEM 5 mL을 추가 하 여 반응을 중지 FBS.</li>
	<li>셀 문화 후드에서 무 균 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. 인큐베이터에서 셀 96 잘 접시를 가져가 라. 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월의 더미에 거꾸로 누릅니다. 
	참고: 않습니다 하지 강제로 또는 갑자기 들어오기 접시 하나의 세포를 잃을 수.</li>
	<li>결합된 transfection 혼합물의 50 µ L 96 잘 접시의 각 음을 하 고 5% CO 2와 37 ℃에서 18-24 h에 대 한 밤새 품 어. 
	참고: 시간 관리 transfection 자극 일정 앞에 야 측정 하나 이상의 96 잘 접시는 모든 접시 transfection 동시 자극 노출 시간 후 측정 하기 위해서는 한 실험에서 테스트 했을 때.</li>
</ol> 4. 자극 및 측정 또는 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 활동 <ol><li>transfected 세포를 잘 당 50-80%의 적절 한 합류 보장 인큐베이터에 단계 대조 현미경 관찰.</li>
	<li>5 m m 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)를 추가 하 여 행 크에 포도 당 자극 매체를 준비 &#39; s 균형 소금 솔루션 (HBSS).</li>
	<li>녹여 얼음에 실시간 캠프 분석 결과 기질 시 약 aliquots. PCR 튜브에 기질 시 약 55 µ L 튜브 당에서-80 ° C에 저장 합니다. 접시 당 1 튜브 사용.</li>
	<li>2750 µ L HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 기판 시 약 55 µ L를 혼합 하 여 2% 재래식 솔루션 준비.</li>
	<li>벤치에 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. Transfection 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월에 거꾸로 누릅니다.</li>
	<li>각 잘 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 pipetting 50 µ L로 세포 세척.</li>
	<li>부드럽게 하 고 반복적으로 96 잘 접시에서 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션에 밖으로 두드리는.</li>
	<li>각 2% 재래식 솔루션의 피 펫 25 µ L 고 2 헤 대 한 어둠 속에서 실 온에서 품 어</li>
	<li>준비 사전에 1 M DMSO에-20 ° C까지 사용에서 저장소 odorant 재고 솔루션.</li>
	<li>이전 보육 시간의 끝에 희석 HBSS/HEPES/포도 당 자극 매체에서 작업 농도 odorant 재고 솔루션. 
	참고:이 단계에서 준비 odorant 희석 농도 각 잘에서 올바른 최종 농도를 두배로 한다.</li>
	<li>플레이트 리더는 화학을 사용 하 여 및 odorant 추가 하기 전에 잘 34 당 1000 밀리초의 속도에서 2 연속 번 접시의 기저 발광 수준 측정.</li>
	<li>는 플레이트 리더에서 접시를 신속 하 게 제거를 각 잘을 25 µ L odorant 희석을 추가 하 고 즉시 20 사이클에 대 한 모든 우물의 연속 발광 측정을 시작 30 분 이내 
	참고: 피 펫 주변 오염 방지 하려면 신중 하 게 우물 같은 접시의 다른 odorants 또는 동일한 odorants의 다른 농도 사용 하 여 때.</li>
</ol> 5. 데이터 분석 <ol><li>화학 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.</li>
	<li>계산 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에 대 한 응답 또는 정규화 
	(발광 N &#8211; 발광 기저) / (발광 높은 &#8211; 발광 기저) 어디 N = 특정의 발광 값 잘; 기저 기저 2의 평균 발광 값 = 발광 값; 최고 = 접시의 가장 높은 발광 값 또는 격판덮개의 세트. 
	참고: 실험의 목적에 따라 대체 그래픽 표현은 채택 될 수 있다. 심사 분석 ( 그림 1 참조) 예를 들어 고 농도-응답 곡선, 최대값 등 운동 측정 중 원하는 시간에 특정 잘 발광 값을 생성 또는 최종 값을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

특정 odorant에 노출 시 OR의 활성화를 정확 하 게 측정 하는 것은 후 각 정보의 코딩을 해독에 첫걸음 이다. 어떻게 하나의 예로 식별할 수는 생체 외에서 사용 하 여이 연구 대표 OR 식 시스템, 관심 및 이후에 수용 체의 향기가 있는 화학에 대 한 인간의 또는 레 퍼 토리 가운데 응답 ORs 에서처럼 실험 약리학은 화학 물질의 다양 한 농도 사용 하 여입니다. 우리의 결과 muscone에 대 한 진실 fide 수용 체로 OR5AN1를 확인합니다. 이것은 이전 보고서39 와 일치 하 고 수용 체 수가 적은 사향 냄새27,40감지에 관련 된 추측에 대 한 추가 증거를 제공 합니다. 사토-Akuhara 그 외 여러분 luciferase 분석 결과 유사 하거나 분리 식 시스템에 의해 생성 되는에서 심사 데이터와 비교, 검사 결과 약...

냄새의 감각을 음식을 얻기, 육 식 동물 및 위험 방지, 종, 구분 선택 메이 트1,2의 후 각 능력에 의존 하는 그들은 동물의 생존에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 기능의 실현 odorant 수용 체 (ORs), 후 각 상피 (OE)에 위치한 후 각 감각 신경 (OSNs)의 속눈썹 표면에 개별적으로 표현 되는에 따라 다릅니다. ORs 구성 최대 약 400와 1200 다양 한 OR 유전자 인간에서 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) superfamily의 가족 및 마우스, 각각3,4,5. ORs odorants에 의해 활성화 후 각 G-단백질 (Golf)의 순차적 활성화를 통해 증가 시킨된 세포내 캠프 수준 이어질 고 III adenylyl 있고 (ACIII)를 입력 합니다. 세포내 캠프의 결과 증가 수준 두 번째 메신저, 세포 표면에 뉴클레오티드 개폐 통로 열어, 트리거링 양이온 등 캘리포니아2 + 활동 전위, 그리고 궁극적으로 시작의 유입으로 작동할 수 있습니다. 신경-잠재적인 전송 그리고 후 각 지 각입니다. 감지 하 고 ORs로 odorants의 많은 수를 감 별 하는 과정은 후 각 지 각6,7의 첫 번째 단계로 간주 된다.
때문에 벅과 악 셀8 먼저 성공적으로 복제 odorant 수용 체 ORs에서 시작 하는 후 각 인식의 메커니즘을 해명, 또는 가족의 deorphanization이이 필드에 핫스팟 중 하나가 되었다. 다양 한 에 비보, ex vivo 생체 외에서 메서드와 OR 활성화를 측정 하는 보고 된9,10,,1112되었습니다. 캘리포니아2 + 영상 단일 셀 RT-PCR OSNs에 다음을 사용 하는 전통적인 방법 지방 족 odorants13,,1415다른 ORs의 식별을 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 대규모 transcriptome 분석의 등장 더 많은 비보에 높은 처리량 방법의 개발 추진. 켄터키 분석 결과 eugenol 및 muscone 응답 마우스 ORs S100a5 tauGFP 기자 마우스 긴장과 microarray 분석9를 사용 하 여 식별합니다. Odorant 노출 후 또는 mRNA 수준에서 감소에 따라, 꿈의 기술 고용 모두 척추 및 비 척추 동물16OR 활성화 프로필을 확인 하려면 transcriptomic 접근. Matsunami 신경 활성화에 s 6의 인 산화를 감안할 때, 응답 ORs12식별 phosphorylated 리보솜 immunoprecipitations에서 시퀀스 된 mRNAs를 유사 하 게, 그룹. 마지막으로, 파인 그룹 슈퍼 스니퍼 쥐 냄새에서 vivo에서, MouSensor 기술17로 알려진 코딩을 공부 하는 플랫폼으로 서 역할을 수 있는 보고.
생체 외에서 영역에서 OSNs 경작의 도전은 OR 기능 식에 vivo에서 모방 분리 식 시스템 ORs 향기로운 화학 제품의 대규모 심사를 실시 하 이상적인 솔루션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 네이티브 OSNs에서 다 비 후 각 근원의 경작된 셀 라인 또는 단백질 바인딩과 그물에 원형질 막에 트래픽을 수 없습니다 유지 됩니다, 또는 저하 및 수용 체 기능18 의 손실에 결과 , 19.이 문제를 해결 하려면 광범위 한 작품을 만들어왔다 OR 기능 식 분리 세포의 세포 막에 복제. Krautwurst 외. 먼저 연결할 rhodopsin (Rho-태그)의 처음 20 아미노산 또는 단백질의 N 맨끝 그리고이 승진 (HEK) 인간 미 발달 신장 세포20일부 ORs의 세포 표면 표현. 단일 OSNs에서 진 식 (세이 지) 도서관 분석의 직렬 분석을 실시 하 여 사이토 외. 먼저 수용 체 수송 단백질 (RTP) 가족 구성원, RTP1, RTP2, 및 수용 체 식 증강 단백질 1 (REEP1) 또는 세포 막에 매매를 촉진 하 고 ORs에서 HEK293T 셀 의 응답 odorant 중재 하는 복제 21. 이러한 결과에 따라, Matsunami 그룹 Hana3A 세포 라인을 설립 성공적으로, 안정적으로 HEK293T에서 RTP1, RTP2, REEP1, 및 Gαolf 와 페 고 뚜렷이 효율적인 또는 기능에 대 한로 태그 ORs와 페 식입니다. 후속 연구 1) 짧은 형태의 RTP1, RTP1S, 홍보 하거나 원래 RTP1 단백질과 2) 유형 3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (M3R) β-arrestin-2의 억제를 통해 또는 활동을 향상 시킬 수 있는 보다 기능 더 견고 하 게 수 있는 공개 모집, 둘 다 최적화 실험을 분리 표현 시스템에 도입 되었다22,23출력.
여러 가지 검색 방법은 분리 시스템에서 수용 체 활성화를 계량에 사용 되었습니다. 은닉 placental 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP) 분석 결과 또는 활성화를 평가 하기 위한 매력적인 옵션을 기자 효소 transcriptionally 캠프 응답 요소 (CREs)에 의해 규제로 작동 합니다. 형광은 SEAP 검출 시 약24를 가진 외피 후 문화 매체의 샘플에서 쉽게 감지 된다. 이 메서드를 사용 하 여 아민 관련 수용 체 (TAARs) 되어 OE는 추적 표현 chemosensory 수용 체의 보조 클래스 ORs의 기능25,,2627특징. 또 다른 일반적인 방법은, luciferase 분석 결과, 야영지 응답 성분 (CRE)의 제어에서 반딧불 luciferase 취재 원 유전자를 사용합니다. Luciferase 생산에 의해 생성 된 발광 측정 또는 활성화10,,1128측정의 효율적이 고 강력한 수단을 제공 합니다.
실시간 캠프 분석은 또한 널리 사용 되었습니다 분리 또는 생 GPCRs의 함수를 동적으로 모니터링. 이러한 고급 분석 실험의 한 예로 유전자 인코딩된 바이오 센서 변종, 돌연변이 형태의 luciferase 융합 캠프 바인딩 도메인을 보유 하 고 활용 합니다. 캠프 묶을 때 구조적 변화 luciferase, 있는 발광 다음 화학 리더29,30으로 측정 될 수 있다의 활성화에 지도 한다. 실시간 캠프 기술 드 HEK293 NxG 108CC15 세포에 인간의 odorant 수용 체의 분리에 적합 보고 되었습니다.엉덩이 = "외부 참조" > 31,,3233, 뿐만 아니라 HEK293T에서 파생 된 Hana3A34,35세포로. 또한 Krautwurst 그룹 양방향 대규모 또는 검사 방법32,33에 적합 하도록 실시간 캠프 기술을 자세히 설명 합니다.
여기는 Hana3A 세포에서 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 또는 활성화를 측정 하기 위한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에서 미리 equilibrated 라이브 셀의 발광 운동 측정 30 분 다음 특정 휘발성 화합물과 치료, 보다 효율적이 고 정확한 분석에 덜 취약 또는 활성화의 대표 연장 시간과 냄새 유발 세포 독성 세포 환경에서 발생 하는 아티팩트 이 실시간 측정 ORs의 ligands, 대규모 심사로 관심의 특정 또는 ligand 쌍의 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 OR5AN1로 식별 사향 복합 muscone에 대 한 수용 체 379 인간의 ORs에 대 한 심사를 수행 하 고 이후에 긍정적인 심사 결과 확인 하 여.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP 시약</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP 플라스미드</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A 세포</td><td></td><td></td>는 <td>요청 시 작성자로부터 제공됩니다.</td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 또는 마그네슘 없음</td><td>GIBCO 14175095</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr> M3R 플라스미드 <tr><td></td><td></td><td></td> 는 EBSS 및 L-글루타민 Hyclone SH30024 <td></td></tr> Muscone Santa와 <tr><td>함께 pCI MEM과 같은 포유류 발현 벡터로 복제되었습니다</td>.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musk tibetene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr> 또는 칼슘 또는 마그네슘 없이 <tr><td>pCI PBS와 같은 포유류 발현 벡터에 Rho-tag로 복제된</td><td>플라스미드</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 miniprep kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S 플라스미드</td><td></td><td></td>를 pCI Trypsin-EDTA Hyclone SH30236 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2-mL PCR 튜브</td>와 같은 포유류 발현 벡터로 복제, <td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL Eppendorf 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL 17 mm x 120 mm conical tube</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8-well 및/또는 12-well 멀티채널 피펫맨</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well flat-bottom white cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm cell culture dish</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Class II 생물 안전 작업대(laminar flow</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>포함)Cell Culture incubator, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, 15ml 코니컬 튜브</td><td></td><td></td><td></td>용 스윙 버킷 로터 포함</tr><tr><td>Infinite F200 플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경(x10 및 x20 대물렌즈 포함)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>다채널 분배</td><td></td><td></td><td></td>를 위한 멸균 시약 저장고</tr><tr><td>멸균 종이 타월</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 셀 측정의 odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

포유류 odorant 수용 체 (OR) 가족의 거 대 한 크기는 수많은 휘발성 화학 물질 가운데 그들의 동족 ligands를 찾는 데 어려움을 제시. 효율적이 고 정확 하 게 ORs deorphanize, 우리 표현 포유류 ORs와 유전자 변형된 바이오 센서 플라스 미드 실시간으로 또는 활성화의 하류 캠프 생산을 측정 하는 분리 셀 라인의 사용을 결합. 이 분석 결과 ORs와 반대로화면 odorants을 사용할 수 있습니다. 화면에서 긍정적인 odorant 수용 체 상호 작용 이후에 다양 한 악취 농도, 농도-응답 곡선을 생성에 대 한 테스트 하 여 확인할 수 있습니다. 여기 우리는 인간 또는 라이브러리 Hana3A 세포에 표현 하 고 긍정적으로 반응 하는 수용 체의 화합물에 대 한 동족 수용 체 확인 향기로운 화합물의 높은 처리량 검열을 수행 하기 위해이 방법을 사용. 우리 효율적이 고 또는 활성화 평가에 신뢰할 수 있는 것이 높은 처리량 탐지 방법을 발견 하 고 우리의 데이터 또는 기능 연구에 그것의 잠재적인 사용의 예를 제공.

Muscone 천연 사향에서 주요 향기로운 구성 요소입니다. 최근은 muscone 및 마우스 또는, MOR215-1, 쥐37,38행동에 muscone 응답 glomeruli에서 복제에 상 동에 따라 다른 macrocyclic 사향 화합물에 대 한 인간의 수용 체로 확인 된 OR5AN1을 공부 한다. 또한 인간 또는 레 퍼 토리, 우리의 그룹 및 Touhara 그룹을 심사 하 여 OR5AN1 2 macrocyclic 사향 화합물, cyclopentadecanone 및 muscone, 주요 수용 체로 서 각각 사용 하 여 식별 luciferase 분석 결과 시스템38,39 .
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

이 실시간 고속 대량 cAMP 분석의 전반적인 목표는 후각 수용체에 대한 후각 물질을 또는 그 반대로 스크리닝하는 것입니다. 생쥐는 후각 수용체와 리간드 모두에 대해 더 대규모의 스크리닝을 가능하게 하며, 관심 있는 수용체-리간드 쌍의 약리학적 특성 분석이 가능하기 때문에 후각 수용체 기능을 연구하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 후각 물질에 의한 수용체 활성화를 효율적이고 신뢰성 있게 평가할 수 있다는 점입니다.살아있는 세포를 이용한 이종 후각 물질-수용체 발현 시스템입니다. 먼저 위상차 현미경으로 Hana3A 세포를 관찰하여 세포 생존력을 확인하고 합류도를 추정합니다. 그 다음, 세포 배양 접시에서 모든 배지를 흡입하여 제거합니다.플레이트에 10 milliliters의 phosphate buffered saline을 넣고, 디시를 흔들어 섞은 후 PBS를 흡입하여 세포를 세척합니다. 다음으로, 0.5%trypsin-EDTA 3 milliliters를 플레이트에 첨가합니다. 모든 세포가 부유할 때까지 또는 1분 동안 trypsin을 세포에 처리합니다.10% FBS가 포함된 MEM 5 milliliter를 첨가하고 피펫팅하여 세포 덩어리를 풀어줌으로써 트립신을 불활성화합니다. 세포 수를 측정한 후, 형질전환 예정인 96-well 플레이트당 2x10⁶ cells에 해당하는 세포를 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 자극 전 세포의 과증식 또는 과소증식을 방지하기 위해 96-well 플레이트에 준비할 정확한 세포 수를 계산하는 것이 중요합니다.튜브를 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 상층액을 흡입하여 제거합니다. 96-well 플레이트당 6 mL의 항생제가 없는 배지를 추가하고, 세포 덩어리를 풀어주기 위해 기포가 생기지 않도록 피펫으로 가볍게 섞어줍니다.부유 세포를 리저버로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 50 µL씩 분주합니다. 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.형질전환 전, 위상차 현미경으로 분주된 세포를 관찰하여 웰당 약 30~50%의 적절한 합류도를 확인한 후 배양기로 되돌려 놓는다. 후각 수용체 컨스트럭트, 보조 인자 컨스트럭트 및 cyclic AMP 바이오센서 변이체 컨스트럭트가 표시된 행을 따른다. 그 다음, 96-웰 플레이트당 500 microliter의 MEM에 플라스미드 형질전환 혼합물을 준비한다.다음으로, 500 µL의 MEM에 18 µL의 지질 매개 transfection 시약이 포함된 transfection 혼합물을 준비합니다. 피펫팅을 통해 transfection 혼합물과 혈장 혼합물을 섞습니다. 그 후 실온에서 15분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, transfection 혼합물에 10% FBS가 포함된 MEM 5 milliliters를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 다음으로, 세포 배양 후드 내에 멸균 종이 타월을 두껍게 폅니다. 인큐베이터에서 세포가 들어 있는 96-well 플레이트를 꺼냅니다.배지가 종이 타월에 완전히 흡수되도록 플레이트를 뒤집어 종이 타월 더미 위에 부드럽게 반복해서 두드립니다. 혼합된 transfection 혼합물 50 µL를 96-well 플레이트의 각 웰에 분주하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 18~24시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다. 한 실험에서 2개 이상의 96-well 플레이트를 테스트하는 경우, 모든 플레이트가 동일한 transfection 및 자극 노출 간격을 갖도록 기기에서 transfection 및 자극 일정을 조정하여 관리할 수 있습니다.자극 전, 위상차 현미경으로 형질전환된 세포를 관찰하여 웰당 50 내지 80%의 적절한 합류도(confluence)를 확인한 후 인큐베이터로 되돌립니다. 그 다음, Hanks'balanced salt solution에 10 millimolar heaps와 5 millimolar glucose를 첨가하여 자극 배지를 준비합니다. 실시간 cyclic AMP assay 기질 시약의 55 microliters 분주액을 얼음 위에서 해동합니다.기질 시약 55 µL와 자극 배지 2,750 µL를 혼합하여 2% equal abration 용액을 준비합니다. 벤치 위에 페이퍼 타월을 두껍게 펴 바른 후, 플레이트를 뒤집어 페이퍼 타월 위에 부드럽고 반복적으로 두드려 형질전환 배지가 페이퍼 타월에 흡수되도록 합니다. 각 웰에 자극 배지 50 µL를 피펫팅하여 세포를 세척합니다.96-well 플레이트에서 자극 배지를 조심스럽게 반복해서 털어냅니다. 각 웰에 2% 평형화 용액 25 µL를 피펫으로 넣고 실온의 암소에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 끝나기 전, 해동된 냄새 물질 스톡 용액을 작동 농도와 자극 배지로 희석합니다.취기 물질을 첨가하기 전, 화학발광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 기저 발광 수준을 측정합니다. 플레이트 리더에서 플레이트를 빠르게 꺼내어 각 웰에 25 µL의 취기 물질 희석액을 첨가합니다. 그 후 즉시 30분 이내에 모든 웰에 대해 20주기의 연속 발광 측정을 시작합니다.실시간 cyclic AMP 분석법을 사용하여 30 µM muscone에 대해 379종의 고유한 인간 후각 수용체를 스크리닝하였습니다. X축을 따라 표시된 색상 블록은 서로 다른 인간 후각 수용체 패밀리를 나타냅니다. Y축은 양성 대조군의 반응이 최대치에 도달한 시점인 후각 물질 첨가 30분 후의 정규화된 발광 값을 나타냅니다.OR5AN1의 반응을 나타내었다. 이 그림은 다양한 농도의 muscone에 의한 OR5AN1 활성화를 실시간으로 측정한 결과와 무취 음성 대조군의 결과를 보여준다. 화살표는 취기 물질이 첨가된 시점을 나타낸다.여기서는 향료 첨가 30분 후 muscone에 대한 OR5AN1의 농도 반응 곡선이 제시되어 있습니다. 여기서 설명하는 기술은 첫째 날 배양 층의 스톡 플레이트로 시작하여 총 3일이 소요됩니다. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 마지막 날의 과정은 96-웰 플레이트당 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, cAMP 분석법을 이용하여 후각 수용체의 활성화를 관리하고 그 결과를 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

Heterologous 셀에 Chemosensory 수용체의 표면 표현을 시금

이 동영상은 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 바이오센서 및 발광 검출을 사용하여 형질 주입된 세포에서 냄새 수용체 활성화를 측정하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 후각 뉴런의 수용체-리간드 상호 작용 및 신호 경로를 연구하는 데 적용됩니다.

Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay를 사용한 Odorant Receptor Activation 측정

출처: de March, C. A. et. al., 증기 단계에서 냄새 물질에 의한 냄새 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 발광 측정을 사용하여 재조합 포유류 세포에서 냄새 수용체의 실시간 활성화를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 냄새 물질 결합은 G-단백질 활성화 및 cAMP 생산을 유발하여 기질 결합 시 발광을 방출하는 글로센서 단백질을 활성화하여 수용체 반응의 정량적 측정을 제공합니다.

재조합 세포에서 Odorant Receptor 활성화에 대한 실시간 모니터링

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ  의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

학습하세요 실시간 고처리량 cAMP 분석법을 사용하여 후각 수용체 활성화를 평가하는 방법을 배우세요. Hana3A 세포를 이용한 이 기법은 약리학적 특성 분석에 활용됩니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

더 많은 동영상 탐색