라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

이 실시간 고처리량 순환 AMP 분석의 전반적인 목표는 냄새 수용체에 대해 냄새 물질을 스크리닝하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 마우스는 냄새 수용체의 기능을 조사하는 데 유용하기 때문에 냄새 수용체와 리간드 모두에 대한 대규모 스크리닝뿐만 아니라 관심 수용체-리간드 쌍의 약리학적 카르텔화도 가능합니다. 이 기술의 주요 장점은 냄새 물질에서 수용체로의 활성화를 효율적이고 안정적으로 평가할 수 있다는 것입니다.

살아있는 세포를 이용한 이종 냄새 수용체 발현 시스템. 먼저 위상차 현미경으로 Hana3A 세포를 관찰하여 세포 생존력을 확인하고 합류를 추정합니다. 그런 다음 세포 배양 접시에서 모든 배지를 흡인합니다.

그리고 10ml의 인산염 완충 식염수를 플레이트에 넣고 접시를 휘젓고 PBS를 흡인하여 세포를 세척합니다. 다음으로, 3ml의 0.5%트립신-EDTA를 플레이트에 첨가합니다. 1분 동안 또는 모든 세포가 떠다닐 때까지 세포에 트립신을 그대로 둡니다.

10%FBS와 함께 MEM 5ml를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 분해하여 트립신을 비활성화합니다. 세포 계수를 수행한 후 2x10을 96웰 플레이트당 6번째 세포로 전달하여 15ml 튜브로 transfection합니다. 자극 전에 세포의 과다 또는 과소 증식을 방지하기 위해 96-well 플레이트에 준비할 세포의 정확한 수를 계산하는 것이 중요합니다.

튜브를 200배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 세포 팔레트를 방해하지 않고 상층액을 흡입합니다. 각 96웰 플레이트에 대해 항생제가 없는 배지 6ml를 추가하고 세포 덩어리를 분해하기 위해 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫을 추가합니다.

부유 세포를 저장소로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 배양합니다.

형질 주입 전에 위상차 현미경으로 도금된 세포를 관찰하여 웰당 약 30-50%의 적절한 합류를 확인한 다음 인큐베이터로 돌아갑니다. 행 태그가 지정된 odorant-to-receptor 구조체, accessory factor 구조체 및 cyclic AMP biosensor variant 구조체를 따릅니다. 그런 다음 각 96웰 플레이트에 대해 500마이크로리터의 MEM에서 플라즈마 형질주입 혼합물을 준비합니다.

다음으로, 500마이크로리터의 MEM에 18마이크로리터의 지질 매개 트랜스펙션 시약을 함유하는 트랜스펙션 혼합물을 제조합니다. transfection 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 플라즈마 혼합물과 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, transfection mix에 10%FBS가 포함된 MEM 5ml를 첨가하여 반응을 중단합니다. 다음으로, 세포 배양 후드에 멸균 종이 타월을 두껍게 펴 바릅니다. 인큐베이터의 세포가 들어 있는 96웰 플레이트를 가져옵니다.

부드럽고 반복해서 종이 타월 더미에 접시를 거꾸로 두드려 매체가 종이 타월에 완전히 흡수되도록 합니다. 결합된 형질주입 혼합물 50마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 5%의 이산화탄소를 함유한 상태로 섭씨 37도에서 18-24시간 동안 밤새 배양합니다. transfection을 관리할 수 있으며 한 번의 실험에서 두 개 이상의 96웰 플레이트를 테스트하여 모든 플레이트가 동일한 transfection 및 distiller 노출 간격 후에 미러링되도록 하기 위해 기기에서 자극 일정을 유지해야 합니다.

자극을 가하기 전에 인큐베이터로 돌아가기 전에 위상차 현미경으로 형질주입된 세포를 관찰하여 웰당 50-80%의 적절한 합류를 확인합니다. 그런 다음 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액에 10 밀리몰 힙과 5 밀리몰 포도당을 첨가하여 자극 매체를 준비합니다. 얼음 위에서 55마이크로리터의 실시간 순환 AMP 분석 기질 시약 알로쿼트를 해동합니다.

55 마이크로 리터의 기질 시약과 2, 750 마이크로 리터의 자극 매체를 혼합하여 2 % 동등한 abration 용액을 준비합니다. 벤치에 종이 타월을 두껍게 펴 놓은 후 종이 타월 위에 플레이트를 거꾸로 부드럽게 반복해서 두드려 트랜스펙션 매체가 종이 타월에 흡수되도록 합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 자극 배지를 피펫팅하여 세포를 세척합니다.

96웰 플레이트에서 자극 매체를 부드럽고 반복적으로 두드립니다. 25마이크로리터의 2% 평형 용액을 각 웰에 피펫팅하고 실온에서 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 끝나기 전에, 묽게 해동된 냄새 물질 원료 용액을 작업 농도 및 자극 매체에 희석합니다.

냄새 첨가제를 첨가하기 전에 화학발광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 기초 발광 수준을 측정합니다. 플레이트 리더에서 플레이트를 빠르게 제거하고 각 웰에 25마이크로리터의 냄새 희석액을 추가합니다. 그런 다음 즉시 30분 이내에 20주기 동안 모든 웰의 연속 발광 측정을 시작합니다.

379개의 고유한 인간 냄새 수용체를 실시간 순환 AMP 분석을 사용하여 30마이크로몰 머스콘에 대해 스크리닝했습니다. X축을 따라 있는 컬러 블록은 서로 다른 인간 냄새 수용체 계열을 나타냅니다. Y축은 반응이 양성 대조군에 대한 최대값에 도달했을 때 냄새 첨가 30분 후 정규화된 발광을 나타냅니다.

OR5AN1의 반응이 표시됩니다. 이 그림은 다양한 농도의 머스콘에 의한 OR5AN1 활성화의 실시간 측정과 무취 음성 대조군의 결과를 보여줍니다. 화살표는 oderant 덧셈의 시점을 나타냅니다.

여기에서는 oderant 추가 30분 후 muscone에 대한 OR5AN1의 농도 반응 곡선을 보여줍니다. 여기에 설명된 기술은 첫 번째 날에 배양 계층의 스톡 플레이트부터 시작하여 총 3일이 걸립니다. 일단 마스터하면 마지막 날의 공정은 적절하게 수행되면 각 96웰 플레이트에 대해 3시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 결과를 활용하기 위해 순환 AMP 분석을 사용하여 oderant 수용체의 활성화를 관리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.