Name: 생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 학습하세요 생체 외 생물발광 분석법을 사용하여 유방 상피 세포의 세포 주기 리듬을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 환경 요인이 생체 리듬에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품으로는 2012 사회의 독성 (SOT) 지원 되었다-그렇지 연구 (M. 팡) Colgate Palmolive 그랜트와 국제 협력 연구 기금 동물 및 식물 검역 기관, 한국 공화국 (M. 팡), 그리고는 NIEHS 부여 P30ES005022 (H. Zarbl). 우리는 그의 도움이 토론, 씨 Shao-An 후안 그의 실험적인 지원을, 및 그녀의 증거 독서에 대 한 양 키 미 나카타 첸 청 (맥 거 번의과 대학 대학에서 휴스턴에서 건강 과학 센터 택 사스의) 감사 하 고 싶습니다.

1. PER2 발기인 구동 불안정 Luciferase 기자 벡터의 건설 <ol><li>pLS 사용자 정의 구입 [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 인코딩 rLuc 및 인간 cDNA를 포함 하는 벡터 PER2 발기인 조각 (hPER2P, 941 bp) Sac 사이 사이트에서 나 고 뒷 다리 여러 복제 지역 17에 III.</li>
	<li>인간의 PER2 발기인 조각 잘라 (hPER2P, 941 bp)는 벡터에서.
	<ol><li>추가 2.5 µ L 제한 효소 버퍼, 10 µ L (180 기) pLS [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 벡터 및 1 µ L 각 금지 효소, Sac의 I (10 단위 / µ L) 및 뒷 다리 III (10 단위 / µ L)는 DNA/RNA/뉴클레오티드-무료에 microcentrifuge 튜브입니다. 부드럽게 pipetting으로 초순 (10.5 µ L) 25 µ L와 믹스를 추가.</li>
		<li>난방 블록에 90 분 동안 37 ° C에서 품.</li>
		<li>0.7 %agarose 젤 0.0001 %ethidium 평범한 사람 (EtBr) 벡터에서는 hPER2P을 포함 하는 제한 효소 반응의 전체 볼륨 (25 µ L) 실행. 
		참고: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium 브 로마 이드 (CAS 등록 번호: 1239-45-8)은 무 취 붉은 액체. 그것은 일반적으로 사용 되는 형광 태그 (핵 산 얼룩) agarose 젤 전기 이동 법으로 및 UV 빛에서 오렌지 색상으로 표시 하는 intercalating 에이전트입니다. 규제 기관 중 발암 물질 18로 분류 하지만 돌이킬 수 없는 돌연변이 효과의 가능한 위험 실험 동물에서 발생 합니다. 따라서, 우리가 포함 된 화학 위험 폐기물로 EtBr 사용된 agarose 젤과 전기 이동 법 버퍼 수집과 Rutgers 환경 건강 요청 &#38; 안전 (REHS)를 선택 하 고 안전 하 게 처분 하.</li>
		<li>Agarose 젤 941에 EtBr 형광 밴드를 포함 하는 한 조각 잘라 bp, 260 nm 파장에서 흡수 밀도 (OD)를 측정 하 여 정량화는 분 광 광도 계에 따라 DNA 젤 추출 키트, 젤에서 hPER2P 조각 정화.</li>
	</ol></li> <li>정한 반딧불 luciferase 식 벡터: pGL의 선형화 1.0 µ L (1 µ g) [Luc2P / 네오] 단계 1.2.1-1.2.2에 설명 된 대로 동일한 방법으로. 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 위에서 설명한 뒤 DNA 정리 키트는 벡터를 추출.</li>
	<li>선형화 벡터: pGL에는 hPER2P 선 [Luc2P / 네오]. 
	참고: 제조 업체 당 &#39; s 명령, 삽입 및 벡터의 이상적인 어 금 니 비율 2:1입니다. 50 ng 벡터, 삽입의 이상적인 금액은 23.6로 계산 수식, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb 벡터와 ng] (2/1) x 23.6 ng 삽입 =]. HPER2P의 농도에 따라 (7.26 ng / µ L) 및: pGL [Luc2P / 네오] (50 ng / µ L), 50 ng: pGL의 볼륨 [Luc2P / 네오] 23.6 ng hPER2P 각각 1 µ L 3.26 µ L로 계산 됩니다.
	<ol><li>추가 2 µ L T4 DNA 리가 반응 버퍼 (10 배) (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl 2, 1 mM ATP, 그리고 10 mM DTT), 3.26 µ L (23.6 ng) hPER2P, 1 µ L (50 기): pGL [Luc2P / 네오], 13.74 µ L 물 최대 20 µ L 부드럽게 혼합.</li>
		<li>1 µ L T4 DNA 리가 (400 단위 / µ L) 추가 부드럽게 혼합 고 thermocycler, 하룻밤 사이에 16 ° C에서 품 어, 다음 제조 업체 마다 얼음에 합자 벡터 진정 &#39; s 지시.</li>
	</ol></li> <li>합자 벡터: pGL 변환 [hPer2P / Luc2P / 네오] 화학적으로 유능한 대장균을 19.
	<ol><li>42 ° c, catabolite 억압 (S.O.C.) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 따뜻한 물 목욕을 설정 (2 %Tryptone, 0.5% 효 모 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl 2, 10 m m MgSO 4 및 20 m m 포도 당) 실 온에서 Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (100 µ g/mL 암 피 실린, 80 µ g/mL X gal 및 0.5 µ M IPTG 포함) 37 ° C 배양 기에서 따뜻하게 하 고 얼음에 녹여 각 변환에 대 한 세포의 유능한 대장균 한 유리병.</li>
		<li>추가 6 µ L (21 기) 벡터 또는 1 µ L 출혈 (30 ng) 화학적 유능한 대장균 (50 µ L)에의 한 튜브를 벡터 (부정적인 제어)을 다음 부드럽게 혼합 튜브를 플립. 30 분에 대 한 얼음에 품 어</li>
		<li>30 42 ° C 물 욕조에 충격 열 동요 없이 하 고 얼음을 반환 s</li>
	</ol></li> <li>블루/화이트 심사를 사용 하 여 합자 벡터와 변형 대장균 식민지 선택.
	<ol><li>변환 된 대장균에 추가 250 µ L S.O.C. 매체 튜브 및 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>10-50 µ L의 변형된 대장균 파운드 한 천 격판덮개의 표면에 균일 하 게 확산. 넣어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤. 
		참고: 효율적인 복제 반응 몇 백 식민지를 생산 한다. 두 개의 다른 볼륨을 도금 적어도 하나의 접시 큰, 분명 흰색 또는 파란색 색상과 잘 간격된 식민지 해야한다 되도록 것이 좋습니다. 식민지는 너무 작은 때 색상은 구별할 수 10 배 (50 X) 현미경을 사용 하 여 도움이 됩니다.</li>
		<li>소독된 치아 막대기, 격판덮개에서 3-6 백색 식민지를 선택 하 고 50 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 문화 매체의 4 mL를 포함 하는 하나의 문화 관으로 각 식민지를 놓습니다.</li>
		<li>200 rpm에서 밤새 흔들어 37 ° C에서 튜브를 품 어. 4 mL의 2 개 mL를 사용 하 여 DNA를 추출 플라스 미드 DNA 추출 미니 준비 키트 제조 업체 당 대장균 배양 &#39; s 지시.</li>
	</ol></li> <li>확인 하 고 삽입을 분석 (hPER2P, 941 bp) <ol><li>플라스 미드 DNA 제한 효소로 소화 하 고 삽입 확인 하십시오 단계 1.2.1-1.2.3에 설명 된 대로 전기 이동 법을 실행. 
		참고: 긍정적인 제어 (hPER2P 단계 1.2.4에서 정화) 부정적인 제어 (대장균 빈 벡터와 변형)에 포함 된 및.</li>
		<li>방향 19 플라스 미드 삽입의 순서를 확인 하려면 M13 앞으로 및 역방향 M13 뇌관을 사용 하 여 선택 된 플라스 미드 DNA 시퀀스. 
		주: 전기 및 올바른 방향에 hPER2P 및 시퀀싱 결과에서 시퀀스의 정확한 크기와 삽입을 했다 단 하나 식민지가 선정 됐다.</li>
		<li>인간의 PER2 발기인 조각 분석 (hPER2P, 941 bp) CCAATC, 전자 상자 모티브 (Bmal1 바인딩 사이트, 고양이/CGTG)를 포함 하 여 circadian 규제 요소에 대 한 시퀀싱 GC 상자, 및 녹음 방송 시작 사이트 (CAGCGG) 20.</li>
	</ol></li> <li>증폭 추가 하 여 선택 된 대장균 남은 2 mL 200 mL 파운드 문화 매체 50 µ g/mL 암 피 실린 포함 하 고 다음 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 하룻밤 배양으로 대장균 배양.</li>
	<li>추출 DNA 플라스 미드도 없는 맥시와 당 키트 준비 제조 업체 &#39; s 명령 후는 분 광 광도 계와 OD 260 nm 파장에서 측정 하 여 계량 하는 고. 약 수와 저장소 플라스 미드 DNA: pGL [hPer2P/Luc2P/네오], 나중에 사용-80 ° C 냉장고.</li>
</ol> 2. 일시적인 Transfection <ol><li>구매 문화 MCF10A 셀 <ol><li>구입 상업에서 불멸 하 게 하 고, 변형 비 정상적인 인간 유 방 상피 세포 라인 (MCF10A) 세포 은행, 셀 cytogenetically는 어디 테스트와 함께 인증 된 짧은 탠덤 반복 동결 하기 전에 분석. 해 동 하 고 유지 하는 최대 8 주 문화에 냉동된 셀의 각 유리병. 
		참고: 다른 세포와 달리이 세포 있다 접촉 금지 그들은 ~ 70% 합류에 도착. 그 하위 ~ 70%에서 실시는 필요 합니다.</li>
		<li>유 방 상피 기저 매체 (MEBM), 성장 보조 제, 그리고 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2에서 셀 문화 인큐베이터에서 콜레라 독 소 유 방 상피 세포 성장 매체 (MEGM), 셀 문화. 
		참고: 준비-사용 성장 요인 제공 하는 SingleQuot (SQ)를 구매 하 고 별도로 콜레라 독 소를 얻을. 성장 보충의 최종 농도 0.4% 소 뇌 하 수 체 추출, 0.1% 인슐린, 0.1% 하이드로 코 티 손, 0.1% 인간 표 피 성장 인자, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 0.05 %gentamycin 황산 및 0.05% 암포 B.</li>
		<li>10 mL 트립 신/대 한 EDTA를 가진 외피에 의해 10 cm 배양 접시에 셀 해리 ~ 20 분 다음 10 mL trypsin 중화 솔루션을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 모든 셀 HEPES 소금물 (HBSS)를 버퍼링 하는 수집.</li>
		<li>거꾸로 현미경 hemocytometer와 셀 단일 세포 현 탁 액의 농도 계산 하 고 필요에 따라 셀의 특정 숫자를 씨앗. 각 접시에 셀의 동등한 배급을 얻기 위해 철저 하 게 접시를 소용돌이 친다. 셀에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어. 
		참고: 포함 된 트립 신/EDTA, 트립 신 중화 솔루션 및 사용 HBSS subculture 시 약 팩 구입.</li>
	</ol></li> <li>건설 circadian 벡터에 포함 된 셀의 과도 transfection.
	<ol><li>35mm 문화에 균등 하 게 시드 2 x 10 5 MCF10A 세포 MEGM와 접시와 20-30% 합류 (다음 날)에 성장.</li>
		<li>따뜻한은 감소를 혈 청 미디어 (예를 들어, Opti 메모리) 37 ° C 물 목욕과 transfection 시 약 30 분에 대 한 실 온에서 희석 플라스 미드 DNA 건설 (: pGL [hPer2P / Luc2P / 네오])와 엔도-독 소 무료 30 ng / µ L를 트리 스-EDTA (테) 버퍼 및 실내 온도 유지.</li>
		<li>63.6 µ L 따뜻한 감소 된 혈 청 미디어를 먼저 추가한 다음 추가 33.4 µ L (0.1 µ g) 플라스 미드 DNA, 플라스 미드 transfection 혼합물 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서를 준비 하 고 pipetting, 하 transfection의 3 µ L에 마지막으로 추가 하 여 부드럽게 혼합 벽을 건드리지 않고 튜브의 센터에 직접 시 약. 부드럽게 pipetting으로 혼합, 후 30 분에 대 한 실 온에서 계속</li>
		<li>접시에 매체의 센터 표면에 직접 전체 플라스 미드 혼합물 (100 µ L)를 삭제 하 고 요리를 떨고 하 여 부드럽게 섞는다. 추가 48-72 헤에 대 한 CO 2 배양 기에서 셀 문화 
		참고: 그것은 최고의 transfection 효율 그들의 접촉 저해에 때문에이 세포의 40-70% 합류에 있을 것을 예상은 ~ 70%. 따라서, transfection 작품에서 최고의 시작 ~에서 20% ~ 70% 합류.</li>
	</ol></li></ol> 3. 뚜렷이 페 MCF10A 세포의 체 외에 생물 발광 분석 결과의 설립 <ol><li>24 h. 위한 성장 인자 없이 MEBM에서 (후 48-72 h transfection) 합류 점 ~ 70%에서 경작된 한 세포를 굶 어</li>
	<li>동기화 에이전트 (예를 들어, 50% 말 혈 청 (HS)) MEBM에 CO 2 배양 기에서 1.5 h에 대 한 세포 치료. 
	참고: 이상적인 동기화 에이전트, 10 µ M 산림, 1 nM 멜 라 토 닌, dexamethasone 0.1 µ M, 50 %HS, 및 100%의 선택을 위한 SQ 비교 되었다 circadian 진폭 및 기간 circadian 벡터 transfected 세포에. 100% 빈 벡터 transfected 세포 처리 됩니다 부정적인 컨트롤로 SQ.</li>
	<li>Pre-prepare 20 mL 녹음 매체 (10-30mm 문화 요리)에 대 한 MEGM의 5 mL, 15 mL MEBM, 150 µ L 나트륨 중 탄산염, 200 µ L HEPES, 및 40 µ L 소를 추가 하 여 재고 솔루션 (50 mM) 50 mL 소독 원심 분리기 튜브에서. 
	참고: 각 부품의 최종 농도: 20% 광장 및 20 ng/mL 콜레라 독 소, 0.06% 나트륨 중 탄산염, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM HEPES. 따뜻하게 미리 준비 된 매체를 기록 하 고 37 ° C 물 욕조에 30 분 동안 1 x PBS를 소독. 사용 직전 100 µ M 소 추가.</li>
	<li>씻어 따뜻한 1 셀 Dulbecco x &#39; s Phosphate-Buffered 염 분 (D-PBS) 3에 대 한 동기화 에이전트와 함께 부 화 후 시간과 기록 매체 2 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>증발을 방지 하기 위해 다음 측에 레이블을 실리콘 윤활제를 사용 하 여 멸 균된 커버 클래스와 접시를 봉인.</li>
	<li>밀폐 접시 루미 노, 안쪽 자리에 놓고 폴더에 파일 위치를 저장 하기 위한 옵션 (세부 사항, 섹션 6을 참조).</li>
</ol> 4. 안정적으로 페 셀 선택 <ol><li>최적화 제조 업체에 따라 죽 일 곡선 분석 결과와 이상적인 G418 농도 (800 µ g/mL) &#39; 안정적 transfected 세포의 선택에 대 한 지침 s.</li>
	<li>48 h 또는 72 h에 대 한 과도 transfection, 후 subculture와 씨 5000 큰 요리에서 MEGM 셀 셀/접시 (100 mm). 24 시간 후 문화 (37 ° C, 습도 95%, 및 5% CO 2), 셀 문화 인큐베이터에서 매 3-4 일 2 주 동안 800 µ g/mL G418를 포함 하는 새로운 매체 오래 된 매체를 대체 하 여 G418의 800 µ g/mL로 세포 치료.</li>
	<li>Subculture 안정적으로 살아남은 500µg/mL G418 hPer2P/Luc2P의 안정적인 식 유지 하 고 차후 사용을 위해 액체 질소에서 동결을 포함 하는 MEGM와 함께 1-3 구절에 대 한 식민지 transfected.</li>
	<li>생물 발광 분석 결과 생체 외에서의 결과에 생물 발광 강도 많은 구절에서 사용 후 점차적으로 낮은 경우 일반 subculture 셀의 안정적 transfected 인구를 다시 선택 후 500µg/mL G418 치료.</li>
</ol> 5. 화학 물질과 치료 <ol>에서 <li>48 h 또는 72 h 후 transfection 24 헤에 대 한 MEBM에 성장 요인에서 세포를 굶 어</li>
	<li>50% 동기화 후 2 시간에 대 한 HS 치료 0.25 m m 또는 0.5 m m nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527, 또는 MEBM 포함 하는 20 %1 h 1 µ M cambinol 셀 평방</li>
	<li>1 세척 후 x D-PBS, 혼자, 또는 20 EX527 또는 셀에 1 µ M cambinol와 함께 중간 포함 12.5 µ M MSC 기록 추가. 모니터링은 루미 노와 생물 발광.</li>
	<li>치료 안정적 transfected MCF10A / PER2-0.5, 1 또는 2 m m, 40 nm, EX527 또는 2.0 µ M, 50% 동기화 후 1 시간에 Cambinol에서 NMU dLuc 셀 HS, MSC의 중간 포함 12.5 µ M 기록에서 세포를 품 어 고 또는 n-진 (NAC)의 다른 복용량 (5, 10, 또는 20 µ M). 루미 노, 기록에에서 접시를 놓고 3.6 절에 설명 된 대로 4-8 일에는 생물 발광 루미 노에 의해 저장. 
	참고: NMU methylated nitrosourea 화합물, 발암 성, 변이 원 성 및 않았음 속성입니다. NMU는 직접 연기 alkylating 에이전트 있으며 짧은 반감기 (T 1/2 = ~ 30 분). 그것은 알칼리 성 상태 (pH 9-10)와 온도 20 ° c. 이상에서 불안정 하지만 산 성 상태 (pH 4-5)에서 안정 양측 검정 청소 벤치 표면 및 NMU soluti에 의해 잠재적으로 오염 하는 랩 실력에 대 한 효율적인 비활성화 요원으로 10%에서 표 백제를 사용 하는 따라서,. 남은 재고 솔루션은 선택 하 고 REHS에 의해 안전 하 게 폐기. 화학 물질의 행동의 모드에 따라, 동기화 된 세포는 녹음 매체에서 경작 하기 전에 짧은 시간에 대 한 치료 수 있습니다. 있으 나 셀 긴 시간 (몇 일) 녹화 매체에서 또한 대우 될 수 있다.</li>
</ol> 6. 데이터 수집, 분석, 및 프레 젠 테이 션 참고: 세포 생존 능력 표시 같은 시간에 대 한 동일한 농도에서 세포의 치료 후 표준 방법 (예: MTT 분석 결과)를 사용 하 여 결정 해야. 생체 외에서 생물 발광 분석 결과에서 사용 하는 모든 치료 농도 30% 치 사 농도 (LC30) 보다 낮은 했다. 모든 실험은 3 중에서 실시 됐다 그리고 대표 결과 발표 됐다.
<ol><li>로드 없이 H 2 O와 CO 2, 37 ° C에서 설정 하 고 컴퓨터에 연결 하는 인큐베이터 안에 유지 되는 루미 노에 좌석에 요리 접시 (3.5 단계) 씰링, 후.</li>
	<li>클릭 &#34; 저장 &#34; 폴더 및 해당 요리에서 기록 된 발광 신호 저장할 파일 이름을 입력 하 고. 
	참고: 시스템에 발광 신호를 감지 개별 위치에서 접시에 셀에서 실시간. 신호 광 전 증폭 관 관 4-광자-카운트를 통해 컴퓨터에 전송 및 저장 및 데이터 수집 소프트웨어에 의해 컴퓨터에 표시 됩니다.</li>
	<li>4-7 일, 중간 변경 및 필요한 경우 두 번째 주에 대 한 지속적인 기록에 따라 수에 대 한 녹음 후 신호 분석. 
	참고: circadian 매개 변수, 위상, 기간 길이, 및 포함 한 리듬 진폭, 속도, 댐핑을 우리 루미 노 분석 소프트웨어를 사용 생물 발광 데이터를 분석.</li>
	<li>실행 평균, 원시 데이터를 detrend 하 고 기간, 위상, 진폭, 고 속도 21 , 22 감쇠를 사인파에 최고 맞는 분석.</li>
	<li>치료 및 중간 변경 시 높은 과도 생물 발광으로 인해 분석에서 데이터의 첫 번째 사이클 제외.</li>
	<li>데이터 프레 젠 테이 션에 대 한 플롯 시간 (h 또는 주)에 대 한 원시 데이터 (생물 발광, 수/s). 필요한 경우 데이터 기준선을 뺍니다 진폭 및 위상 비교를 그릴 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

포유류 세포 주기 circadian 클록의 상호 transcriptional/변환 피드백 루프에 의해 통제 된다. Heterodimers의 Bmal1 시계 및 Npas2 코어 CGs, Per2 , 외침및 수많은 CCGs4등의 발기인의 E 상자 요소에 바인딩하여 circadian 전사 조절. 그들은 셀, heterodimers의 축적으로 당: 외침 post-translationally 수정 및 시계: Bmal1 transcriptional 활동을 억 누르기 위해 핵 수송. 이 부정적인 피드백 루프 코어를 CGs 자신의 녹음 방송 규제와 CGs와 CCGs23의 리듬 표현 설정 수 있습니다. 개별 셀에 시계 두 기본 조건 (예를 들면, 산화 환 원 잠재력)에 의해 동기화 할 수 있습니다 비록 대부분 포유류 세포는 본질적인 circadian 시계, 및 외부 환경 자극24<...

Circadian 시계 넓은 범위 조절 유전자 약 24 h. 역학의 주기 예측 가능한 리듬 동작 자를 일주 식에서 생물 학적 과정의 연구 좋습니다 circadian 그 만성 장애 리듬의 유 방 및 교대 근로자, 간호사, 항공 승무원1,2,3등 전립선 암 위험을 증가 시킵니다. 이러한 결과 지속적인 빛, 밤에 빛, 또는 빛 사이클-시차 증가 종양 발생률을 모방 하 고 종양 성장을4,5가속을 노출을 보여주는 설치류 연구에 의해 뒷받침 됩니다. 인간과 설치류 학문에서 데이터를 바탕으로, 암 연구에 대 한 국제 기구의 분류는 가능성이 인간의 발암 물질 (유형 2A) 20106교대 작업.
우리는 설명 하는 이전에 유 방 종양 특정 발암 물질, Nnitroso의 단일 발암 복용량-N-methylurea (NMU) 중단 circadian 표현의 주요 circadian 유전자 (CGs) (예를 들어, 기간 2 , Per2) 여러 circadian 제어 유전자 (CCGs), 포함 한 DNA 손상 응답 키 및 대상 유선 (에 간) (DDRR) 유전자를 복구. 또한, 정상을 향해 Per2 와 DDRR 유전자의 circadian 식 식이 L의 chemopreventive 처방에 의해 다시 설정-메 틸-셀레노시스테인 (MSC) 63%로 종양의 발생률을 감소. 이러한 연구 결과 circadian 리듬, 화학 발암 및 자성7,8간의 기계적 링크를 표시 하는 첫번째 이었다. 기타 환경 유독 circadian 유전자 식에 vivo에서 방해를 표시 하는 노출 환경 질병9,10의 증가 위험과 관련 된 있습니다. 환경 유독 병 인 여 circadian 중단 연결 메커니즘을 이해 질병 예방에 mechanistically 기반 접근을 이어질 수 있습니다. 그러나, 연구는 노출 사이 상호 작용을 정의 목적 및 circadian 리듬은 일반적으로 수행 vivo에서. 24 또는 48 h 동안 모든 3-4 h를 수집는 전형적인 vivo에서 실험 조사 circadian 리듬에 미치는 영향 필요, 동물의 많은 수에서 3 개 이상 조직 제어 및 3 노출된 동물 되어야 합니다. Vivo에서 관찰 및 메커니즘이 검증 된 시험관에 시스템의 개발 따라서 뿐만 아니라, 동물의 수를 줄일 것 이라고 하지만 실험 비용 및 요구 사항 또한 극적으로 감소 하는 연구팀은 24-48 h 동안 지속적으로 작동합니다. 또한, 시스템 검증 된 시험관에 circadian 리듬, 또는 환경 스트레스 또는 유독 그것의 응답에 영향을 주는 유전 변경 화합물의 높은 처리량 검열 사용 될 수 있습니다. 따라서, 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델과 실험의 협력 조합 다른 초점으로 다른 통찰력을 얻기 위해 필요 합니다.
포유류에서 circadian 발진기는 SCN의 특수 신경 뿐만 아니라 가장 주변 셀 형식에 존재 한다. 이 분자 시계는 비슷합니다 설립된 fibroblast 세포 선 및 기본 섬유 아 세포에서 배아 또는 성인 동물; 그러나, 조직 유형 특정 휴대 전화 모델11에 대 한 필요가 있다. 따라서, 운동 활동에서 vivo에서, SCN의 전통적인 연구 explants 비보 전, 그리고 불멸 하 게 fibroblast 세포의 체 외에서 세포 기반 분석은 널리 셀 자치 circadian 결함을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 fibroblast 세포 기반 분석 결과 circadian 메커니즘을 정리 수 있습니다 나타내는 증거가 없다 하 고 다른 주변 장기에 vivo에서의 셀에 응답 제시. 다른 세포 유형 유전자 발현, xenobiotic 물질 대사, 및 DDRR, 독특한 패턴을 가질 수 있으며 독성과 circadian 유전자 발현 사이의 링크 셀 형 수 있습니다 특정 및 다른 생리 적인 매개 변수에 의해 변조. 또한, 섬유 기반 시스템에서 circadian 발진기는 하지 되었습니다 완전히 평가 환경 유독, 스트레스 및 질병 개발 및 예방의 메커니즘에 노출 링크 예방 에이전트에 대 한 응답에 대 한. 따라서, 손쉬운, 유효한 셀 유형 전용, 생체 외에서 생물 발광 분석 실험 연구 기관 특정 환경 circadian 분리기에 대 한 필요가 있다. 다양 한 세포 시계 모델 (예를 들어, 간, keratinocytes, 지방 세포 뿐만 아니라 다리 셀 선)는 최근 몇 년 동안12,,1314, 에서 개발 되었습니다. 15, 여기서 설명 하는 분석 결과 유 방 상피 세포, 그리고 vivo에서 환경 스트레스, 유독, 마약과 chemopreventive 대리인 응답을 정리를 첫 번째 데모에서 첫 번째 세포 시계 모델입니다.
Renilla luciferase (rLuc) 및 반딧불 luciferase 30-61 kDa 단위체 단백질 효소 활동에 대 한 처리 posttranslational 필요 하지 않은 및 번역 즉시 유전 기자로 서 기능을 할 수 있습니다. 일단 기판 연결 luciferase 효소, 생 화 확 적인 반응을 촉매 빛의 플래시를 생성 합니다. 따라서, luciferase 구문은 진 식 기자 시스템에서 생체 외에서 그리고 에 비보로 널리 사용 됩니다. 그러나, circadian 리듬 연구, luciferase 기자의 유틸리티 luciferase 단백질의 상대적으로 긴 반감기에 의해 제한 됩니다 (T1/2 = 3.68 h) 기간 (특히 짧은 기간) circadian 유전자에 변화에 대 한 상대적인 식; 그러나, 수많은 연구 년 동안 성공적으로 사용 luciferase 유전자 빠르게 분해 luciferase 같은 circadian 리듬, 특히 오랜 기간 함께 리듬에 대 한 보고를 위해 필요 하지 않을 수 있음을 나타내는 pGL3 벡터에 24 h입니다. 따라서, 기자 플라스 미드 정한 luciferase 벡터를 사용 하 여,: pGL [Luc2P/Neo] hPEST (단백질 불안 시퀀스)를 포함 하는 개발 되었습니다, 현재 체 외 circadian 기자 벡터로 사용 하 수 있도록 생물 발광 분석 결과. Luc2P 에 의해 단백질은 훨씬 더 짧은 반감기 (T1/2 = 0.84 h) 따라서, 응답 보다 신속 하 고 더 큰 크기와 변화에 야생-타입 보다 transcriptional 활동에 나그것은 될 수 있는 ndicating luciferase 실시간16에 정확 하 게 PER2 발기인에 의해 규제의 리듬 표현 모니터링 하는 데 사용.

<table><tbody><tr><td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 벡터</td><td>SwitchGear Genomics</td><td>S700000</td><td>맞춤형 벡터</td></tr><tr><td>pGL4.18[Luc2P/Neo] 벡터</td><td>Promega</td><td>9PIE673</td><td>불안정화된 루시페라아제 발현 벡터</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>Invitrogen</td><td>15224041</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td></tr><tr><td>Sac I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>Hind III-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>CutSmart 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>제한 효소 버퍼</td></tr><tr><td>DNA 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>아가로스 젤 PCR 정제 키트에서 DNA 단편 정제</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA 클린</td></tr><tr><td>업 LB Miller's modification</td><td>TEKNOVA</td><td>L8600</td><td>변형된 대장균 배양용</td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트</td><td>TEKNOVA</td><td>L1902</td><td>흰색/파란색 선택</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>플라스미드 DNA 추출용</td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 준비 키트</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>플라스미드 DNA 추출용</td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM 감소 혈청 배지</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td>트랜스펙션</td></tr><tr><td>MCF10A 세포주</td>용 <td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CRL-10317</td><td>유방 상피 세포</td></tr><tr><td>MEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>유방 상피 성장 배지</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>유방 상피 기저 매체</td></tr><tr><td>MEGM SingleQuot Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>용품 및 성장 인자</td></tr><tr><td>시약Pack</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>계대 배양</td></tr><tr><td>용 시약 D-PBS (10X)</td> <td>Sigma</td><td>D1408</td><td>배양 접시에서 세포 세척</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977</td><td>묽은 10X D-PBS</td></tr><tr><td>조직 배양 접시 (35 mm)</td> <td>BD / Falcon</td><td>353001</td><td>세포 배양 접시 LumiCycle</td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>Fisher에 적합</td><td>NC9044707</td><td>기록 매체로 접시를 밀봉하기 위해</td></tr><tr><td>원형 커버 유리</td><td>Harvard Bioscience</td><td>64-1500 (CS-40R)</td><td>기록 매체로 접시를 밀봉하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>G418 황산염 (Geniticin)</td><td>을 위한 보충제 Invitrogen</td><td>10131035</td><td>stabliy transfected cells 암</td></tr><tr><td>피실린</td> <td>선택을 위한 항생제시그마</td><td>A9393</td><td>콜로니 선택용</td></tr><tr><td>포스콜린</td><td>시그마</td><td>F6886</td><td>동기화 에이전트</td></tr><tr><td>멜라토닌</td><td>시그마</td><td>M5250</td><td>동기화 에이전트</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D4902</td><td>동기화 에이전트</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>시그마</td><td>H1138</td><td>동기화 에이전트</td></tr><tr><td>D-루시페린, 나트륨 염</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td>루시페라제 기질</td></tr><tr><td>IC261</td><td>Sigma</td><td>10658</td><td>일주기 교란 물질에 대한 양성 대조</td></tr>군 <tr><td>메틸니트로소우레아(NMU)</td><td>Sigma</td><td>N1517</td><td>유방 특이 발암물질</td></tr>인 <tr><td>메틸셀레노시스테인(MSC)</td><td>Sigma</td><td>M6680</td><td>유기 셀레늄(화학반응제)</td></tr><tr><td>EX527</td><td>Sigma</td><td>E7034</td><td>SIRT1 특이적 억제제</td></tr><tr><td>캄비놀</td><td>시그마</td><td>C0494</td><td>SIRT1 & SIRT2 억제제</td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 8000</td><td>정량화 뉴클레오티드</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>N805-0200</td><td>분자 생물학 실험용</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>NAPCO</td><td>시리즈 8000 DH</td><td>37°C에서 5% CO2에서 세포 배양용; C</td></tr><tr><td>리프레저레이터가 있는 탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>분자생물학 실험용</td></tr><tr><td>스윙 버킷이 있는 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>80124</td><td>위상차 선택적</td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td>Labconco</td><td>Class II A2</td><td>BSL-2 인증</td></tr><tr><td>LumiCycle 32</td><td>Actimetrics</td><td>를 사용할 수 없음</td><td>광도 검출기</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Circadian 리듬 동작 자 유전자 발현에서 배열 하는 생물 학적 과정을 조절 하는 기본적인 생리 과정 모든 생물에 존재 이다. 척추 동물, circadian 리듬 (SCN, 중앙 맥 박 조정기) suprachiasmatic 핵 및 가장 주변 조직을 구성 하는 개별 셀 기능 분자 발진기에 의해 제어 됩니다. 더 중요 한 것은, 밤에 빛, 환경 스트레스 또는 유독 하 여 circadian 리듬의 만성 질환과 노화의 위험 증가와 연결 됩니다. 중앙 및 주변 생물 학적 시계를 중단 시킬 수 있는 에이전트와 에이전트 방지 또는 circadian 중단의 효과 완화 수 있는 식별 수 만성 질환의 예방에 중요 한 의미를 갖는다. 설치류 모델 노출 및 유도 또는 circadian 중단 방지/완화 하는 에이전트를 식별 하는 데 수 있습니다, 비록이 실험 동물의 많은 수를 필요 합니다. Vivo에서 연구는 또한 중요 한 자원과 인프라를 요구 하 고 밤새 일 하는 연구원을 필요로. 따라서, 있다 시스템 적절 한 체 외에서 세포 형에 대 한 긴급 한 필요 환경 circadian 분리기 및 강화 셀 형식에 대 한 화면을 다른 기관과 질병 상태에서. 우리는 인간 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 진 핵 세포에서 정한 luciferase의 전사를 구동 하는 벡터를 건설 한다. 이 circadian 기자 구조는 안정적으로 인간 유 방 상피 세포로 페 그리고 circadian 응답 기자 세포 생체 외에서 생물 발광 분석 결과 개발 하기 위해 선정 됐다. 여기, 우리는 상세한 프로토콜을 설정 하 고 분석 결과 제시. 우리는 더는 vivo에서 다양 한 화학 물질의 효과 세포 생물 학적 시계에 정리 분석 결과 생체 외에서 우리의 수를 보여주는 개념 실험의 증거에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 결과 분석 결과 다양 한 종류의 세포에 대해 환경 분리기 및 circadian clock의 chemopreventive 강화를 적용할 수 있습니다 나타냅니다.

Circadian 생물 발광 기자 벡터: 인간의 PER2 발기인 기반 표현의 정한 luciferase 변종
941 bp 조각으로 구성 된 DNA 순서: pGL circadian 기자 벡터를 생성 하는 데 사용 하는 인간의 PER2 발기인에서 파생 된 [hPer2P/Luc2P/Neo, 처음 규제 요소 규제 알려진 존재에 대 한 분석 circadian 진 식입니다. 생물 정보학 분석이 보여주었다이 발기인 조각 내는 3 개의 다른 Bmal1 바인딩 사이트 (E 상자) (고양이/CGTG), 두 circadian 전사 강화 사이트 (CCAATG), 두 개의 GC 상자 및 녹음 방송 시작 위치 (그림 1). 따라서이 기자 벡터 circadian 유전자 발현을 반영...

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

본 인비트로(in vitro) 생물발광 분석법의 전반적인 목표는 정상 또는 질병 상태의 유선 유래 유선 상피세포의 세포 주기 리듬에 다양한 환경적 일주기 교란 인자와 촉진 인자가 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 화학 화합물을 포함한 환경 요인이 세포 주기 리듬에 영향을 미치는지와 같은 환경 보건 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 분석법의 주요 장점은 다양한 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있어, 서로 다른 장기 내 일주기 시계의 환경 조절 인자를 스크리닝할 수 있다는 점입니다.저와 함께 실험 과정을 시연할 사람은 저희 연구실의 대학원생인 Brian Estrella입니다. 인간 PER2 프로모터 단편은 다중 클로닝 부위의 SecI과 HindIII 사이 위치에 인간 PER2P가 포함된 맞춤형 벡터로부터 얻습니다. 벡터에서 인간 PER2P 단편을 절단하기 위해, DNA/RNA 및 뉴클레오타이드가 없는 마이크로원심분리 튜브에 제한 효소 버퍼 2.5 µL, 벡터 10 µL, SacI 제한 효소 1 µL, HindIII 제한 효소 1 µL를 넣고 초순수로 최종 부피를 25 µL가 되도록 혼합합니다.37 °C 가열 블록에서 90분 동안 인큐베이션합니다. 제한효소 절단이 완료되면, 벡터로부터 인간 PER2P를 분리하기 위해 반응액 전체 부피를 0.01% ethidium bromide가 포함된 0.7% agarose 겔에서 전기영동합니다. 941 base pairs에서 형광 밴드가 나타나는 agarose 겔 조각을 잘라내어 겔에서 인간 PER2P 단편을 정제하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA를 정량합니다.다음 단계는 인간 PER2P를 destabilized fire flow luciferase가 포함된 벡터로 클로닝하는 것입니다. 앞서 설명한 대로 SacI 및 HindIII 제한 효소 절단을 통해 벡터 1 µg을 선형화합니다. 반응액 전체 부피를 에티듐 브로마이드가 포함된 겔에서 전기영동한 후, 이전과 동일하게 벡터 DNA를 정제하고 정량합니다.선형화된 벡터에 인간 PER2P를 라이게이션하기 위해, 마이크로원심분리 튜브에 T4 DNA ligase 반응 버퍼 2 µL, 인간 PER2P 3.26 µL, 선형화된 벡터 1 µL를 넣고 증류수를 추가하여 최종 부피를 20 µL로 맞춘 뒤 부드럽게 혼합합니다. 그 다음 T4 DNA ligase 1 µL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 써

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포...

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

학습하세요 생체 외 생물발광 분석법을 사용하여 유방 상피 세포의 세포 주기 리듬을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 환경 요인이 생체 리듬에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

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