Name: 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 인간 사후 뇌 조직에서 세제 불용성 단백질 응집체를 농축하는 분획화 방법을 통해 신경퇴행성 질환의 병리 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 단백질 응집체를 효율적으로 분리하여 연구 생산성을 높입니다.

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저자는 박사 짐 Lah와 앨런 Levey, 모리 부 신경과의 도움이 의견 및 제안에 대 한 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 투자 함으로써 의학 협력 가속 부여 (U01AG046161-02)에 모리 Alzheimer의 질병 연구 센터 (P50AG025688) 및 노후화에 국가 학회 부여 (R01AG053960-01) N.T.S.를 이 연구도 일부 모리 신경 과학 NINDS 핵심 시설 보조금, P30NS055077의 Neuropathology 코어에 의해 지원 되었다.

윤리 성명: 모든 뇌 조직에 모리 츠에서 가져온 &#39; s 질환 연구 센터 (ADRC) 두뇌 은행. 인간의 사후 조직 적절 한 제도적 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에서 인수 했다.
 1. 균질 및 분류 <ol><li>조직 선택 참고: 사후 담당 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 고정 광고 사례를 확인된은 모리에서 선정 되었다 ADRC 두뇌 은행 (n = 2). 녹말 체 패 배포의 사후 neuropathological 평가 츠에 대 한 레지스트리를 설정 하는 컨소시엄에 따르면 수행 했다 &#39; s 질병 반 정량적 기준 24, 비록 득점 neurofibrillary 얽힌 병리학 Braak 준비 시스템에 따라 평가 했다. 16 <ol><li>얻기 냉동 사후 뇌 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 확인 광고의 경우. 드라이 아이스, 집게 및 면도날의 컨테이너를 활용 하 여, 소비 세 ~ 250mg 부분 tared 일회용에 각 조직 샘플에서 회색 물질의 무게 배, 조직 해빙 하지 않도록 돌보는. 무 균 수를 각 작품의 무게를 기록.</li>
		<li>소비 세 ~ 250mg의 회색 문제를 사용 하 여 집게와 면도기 시각적으로 검사 하 여 외부 회색 물질과 내부 백색 질 사이의 인터페이스를 찾습니다. 백색 질 및 더 중요 한 것은, 어떤 큰 혈관 또는 살 벌 한 지역, meninges, 또는 거미 집 모양의 메이 터. 신속 하 게 작업 하 고 자주 폴리스 티 렌 용기 마른 얼음에 뇌 조직으로 무게 배를 배치 하 여 절단 과정에서 냉동 조직 유지</li>
		<li>Excised 분석 균형을 사용 하 여 각 냉동된 조각에서 회색 물질의 정확한 무게를 기록 합니다. 계산 볼륨 낮은 소금 (LS) 버퍼의 dounce 균질 (5 mL/g 또는 20 %w / v)에 대 한 필요 (표 1 참조).</li>
		<li>프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 및 얼음에 진정 x 1 준비 10 mL LS 버퍼</li>
		<li>무게 조직과 무게 보트에서 제거 드라이 아이스와 약 2 x 2 m m 조각으로 주사위로 그것은 녹은. 얼음에 2 mL 미리 냉장된 dounce 균질 화기 튜브에 전송</li>
		<li>프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 X 1와 차가운 낮은 소금 (LS) 버퍼의 5 mL/g (20 %w / v) 추가.</li>
		<li>Homogenize 높은 클리어런스 유 봉 A와 낮은 클리어런스 유 봉 b.의 15 획의 약 10 타를 사용 하 여 얼음에 뇌 조직</li>
		<li>유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 2 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 모든 homogenate를 전송. 와 함께 튜브 라벨 &#8220; 일 &#8221; (총 Homogenate), 조직의 경우 수, 그리고 homogenate 볼륨. 약 수 0.8 mL 레이블이 1.5 mL 튜브에. 어떤 과잉 homogenate 수 마찬가지로 aliquoted-80에 저장 ° c.</li>
		<li>각 0.8 mL aliquot, 추가 100 µ L 각 5 M NaCl 및 10% (w/v) sarkosyl의 농도 0.5 M 및 1 %w / v, 각각. 반전에 의해 잘 튜브를 혼합 하 고 15 분 레이블 튜브에 대 한 얼음에 품 어 &#34; TH-S &#34; (총 Homogenate-Sarkosyl)는 homogenates sarkosyl-버퍼 (표 1)에 나타냅니다.</li>
		<li>얼음에 30% 진폭에서 3 5의 펄스에 대 한 각 튜브를 sonicate (최대 강도 = 40%) 사용 하 여 microtip 프로브.</li> <li>bicinchoninic 산 (BCA)를 사용 하 여 homogenates의 단백질 농도 시험 25 확인 방법. 
		참고: 조직의 그램 당 5 mL LS에서 일 S homogenates의 평균 단백질 농도 15 ~ 20 mg/mL. homogenates 수 수 즉시 분류 한 또는 사용까지-80 ° C에 저장.</li>
		<li>10 mg/ml 1 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 x 차가운 사크 버퍼 (표 1)를 사용 하 여 희석 TH-S homogenates.</li>
		<li>전송 5 mg 단백질 (0.5 mL) 500 µ L 폴 리 카보 네이트 ultracentrifuge 튜브와 쌍-균형 사크 버퍼에 각 TH-S homogenate의. 미리 냉장된 회전자와 180000 x g 1.5 mL 튜브에 4 ° c. sarkosyl-수용 성 전송 supernatants (S1)에서 30 분에서 ultracentrifuge에 튜브를 로드 하 고-80에서 저장 ° c. 
		참고: 사크-버퍼는 ultracentrifuge의 (선택적 세척) 추가 200 µ L 튜브 세제 불용 성 분수 (P1)를 포함 하 고 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 ultracentrifuge 튜브의 아래쪽에서 펠 릿 (P1)를 꺼내 려.</li>
		2-3 s <li>짧게 펄스-스핀은 거꾸로 튜브 (&#8804; 2500 x g) 아래 1.5 mL 튜브에 펠 릿 (P1) 및 버퍼 전송 microcentrifuge에. 펠 릿 중단 되도록 아래로 pipetting으로 사크 버퍼에서 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.</li>
		<li>쌍-균형, 그리고 4에서 추가 30 분 180000 x g에서 원심 분리기 ° c.</li>
		<li>선택적 세척 상쾌한 (S2)를 폐기 하 고 1 요소 버퍼 (표 1)의 50-75 µ L에서 sarkosyl-불용 성 펠 릿 (P2)를 품 어 그림 (프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일) 실 온에서 30 분 동안 solubilize x는 펠 릿. 
		참고: 따뜻한 요소 버퍼 SDS 강수량을 피하기 위해 사용 하기 전에 실내 온도에. 세제에 민감한 애플리케이션을 위해 요소 버퍼에서 SDS를 생략 하 고 요소 버퍼에 resuspending 전에 낮은 소금 버퍼에 불용 성 펠 렛 (P2) 세척을 고려.</li>
		<li>0.5 mL 튜브에 resuspended 펠 릿 (P2)을 전송 하 고 간단한 사용 (1 s) 20% 진폭 microtip 쥡니다 (최대 강도 = 40%)을 완벽 하 게 알 약을 solubilize.</li>
		<li>Sarkosyl-수용 성 (S1)의 단백질 농도 결정 하 고-BCA를 사용 하 여 불용 성 (P2) 분수 시험 방법. 이 분수를 사용 하 여 즉시 또는 사용까지-80 ° C에 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol>서양 blotting <li> 참고: 약간의 수정을 이전에 보고 된 절차에 따라 수행 했다 서쪽 blotting. 5 , 10 <ol><li>준비 40 µ g 샘플 총 homogenates (TH-S), 사크 성 (S1) 및 5 mM의 TCEP ph 7 1 X Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼에 사크-불용 성 (P2) 분수의. 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품 어</li>
		<li>부하 샘플에는 캐스트 10 잘 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤. 첫 번째 센티미터 (10 분)에 대 한 V 80와 120 V 나머지 (60 분)에 대 한 또는 추적 염료는 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 electrophorese.</li>
		<li>신선한 면도날과 젤 칼 분할-오픈 프리 카스트 젤 카세트를 사용 합니다. 부드럽게 버려야 빗과 신선한 면도날으로 젤의 끝.</li>
		<li>Pipetting으로 그림 고 아래로 1 x 200 µ l 사크-버퍼에 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.</li>
		<li>0.2 µ m 니트로 막 더 럽 히 기계에 건조 전송 메서드를 사용 하 여 전송 (자료 표 참조).</li>
		<li>차단 BB와 뒤를 0.05% 블로킹 버퍼 (BB) 트윈 20 30 분 없이 막 30 분 트윈 20 (BB/T). 차단, 후 린스 TBS/T에서 막 (0.1% Tween 20) 5 분 초과 차단 버퍼 제거.</li>
		<li>준비 1:1,000 희석 주 항 체 pT231, 타우-2 (팬 타우), AT8의 그리고 BB/T에서 EEA1 (0.05% 트윈 20).</li>
		<li>원형 동요와 4 ° C에서 하룻밤 1 차적인 항 체 솔루션에 막 품 어. 3 x 15 분에 대 한 큰 술/T에 막 씻어</li>
		<li>어둠 통에 붙일 레이블 근처-적외선 이차 항 체의 BB/T에 실 온에서 60 분에 대 한 1:20,000 희석와 막 조사. Tbs.에 3 x 10 분 TBS/T와 2 x 5 분 막 씻어</li>
		<li>스캔 이미징 시스템 (예: 700 nm (빨강 채널) 적외선 염료 680 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) 보조와 800 nm (녹색 채널) 적외선 염료 790 당나귀-토끼 IgG (H + L에 대 한 적절 한 여기 파장에는 적외선을 사용 하 여 막 보조)).</li>
		<li>이미징 소프트웨어를 사용 하 여 신호 강도 계량 제조자에 의하여 densitometry 측정 수행을 &#39; s 지시, 평균 전체 배경 설정 자동 배경 설정 보장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 소개 하 고 다양 한 misfolding 분석 기능 단백질 질량 분석 기반 proteomics 분석에서까지 실험적인 응용 프로그램에 적용 하는 약식된 단일 단계 세제 분별 프로토콜 토론 그리고 서 부 럽입니다. 5 , 6 , 7 , 10 이 방법론은 아마도 가장 효과적인 치 매 등 신경 proteinopathies 공부 하는 데 사용 하는 경우, 루 게 릭 병, 헌팅턴 병, 프리온 질병 및 다양 한 tauopathies. 원래 5 단계 순차 분류 프로토콜에 비해,이 단일 단계 절차 하루에 완료 될 수 있다 고 매우 비슷한 결과 제공. 5 , 6 , <sup class="xr...

Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 루 경화 증 (ALS), 밀접 하 게 관련된 프리온 질환 등 신경 퇴행 성 질환은 proteinopathies의 점진적인 축적에 의해 특징 세제 불용 성 단백질 집계 동반 인지 뇌에서 떨어진다. 1 , 2 이 공유 병 적인 기능 이상 이러한 신경 퇴행 성 질환의 병 인에 중심 역할을 담당할 생각 이다. 2 이러한 집계 일반적으로 β크로스 misfolded 단백질 전시의 단위를 반복으로 구성 된 고분자 녹말 체 섬유의 구성-구조. 1 , 2 , 3 , 4 화학적, 녹말 체 집계는 화학 또는 열 변성을 가용 화, 그들의 정화, 분석에 독특한 도전을 선물 한다3 높은 저항 하 고 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 공부. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 unsurprisingly, 세제 불용 성 단백질 분수가 되었습니다 misfolded 단백질의 축적을 포함 하는 신경 퇴행 성 질환의 이상으로 많은 연구의 초점. 6 , 12 , 13 , 14
생 화 확 적인 분류 기법 종종 사후 뇌 homogenates에서 세제 불용 성 부분을 풍부 하 게 이용 되어 있다. 6 , 12 , 13 , 14 가장 일반적인 방법 중 하나는 버퍼와 조직 homogenates의 연속 추출과 엄중, 가용성과 불용 성 부분을 분할 하는 ultracentrifugation 다음 증가의 세제 포함 됩니다. 일반적으로 사용 되는 순차 분류 프로토콜6,14 세제 무료 낮은 소금 (LS) 버퍼에서 냉동된 조직 샘플의 균질 화를 포함 하 고 결과 불용 성 펠 릿은 다음 순차적으로 추출 높은 소금, 비 이온 세제, 높은 자당을 포함 하는 버퍼, 이온 세제 그리고 마지막으로 chaotropes 요소 처럼. 6 , 14 이러한 순차적 분별 프로토콜의 명백한 결점은 상당한 시간과 노동 투입을 완료 하는 데 필요한. 균질과 ultracentrifugation를 포함 하 여 전형적인 5 단계 분류 프로토콜 걸릴 수 있습니다 몇 시간 또는 일. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 또한, 많은 pathologic 단백질 집계 남아 모든 가혹한 조건19,20 하지만 불용 성 생성 된 분수의 대부분은 제한 된 값의. 따라서, 높은 소금 농도 및 비 이온 세제 덜 엄격한 분류 단계 크게 중복 됩니다.
이전 연구는 이온 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 단순화 된 단일 단계 세제 분별 프로토콜에 대 한 우수한 후보 나타났습니다. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 변성 세제로 sarkosyl는 충분히 solubilizing misfolded 단백질 집계 베타-아 밀 로이드 (Aβ),6,11의 구성 없이 뇌에서 기본적으로 접힌된 단백질의 대부분을 solubilize 엄격한 phosphorylated 타우 (pTau),6 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43),14 알파 synuclein,12,13 scrapie,23 또는 u 1 작은 핵 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) u 1-70 K 등. 5 , 21 , 22 Sarkosyl 유비 쿼터 스 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 보다 덜 엄격으로, SDS 처리를 견딜 수 없는 misfolded 단백질 집계의 덜 강력한 oligomeric 형태 유지 합니다. 9
이전에 우리는 더 힘 드는 순차 분류 방법론에 유사한 결과 달성 하는 약식된 세제 분별 프로토콜을 설명 합니다. 5 덜 엄격한 분류 단계를 생략 하 여 우리 수 있었다 사후 인간의 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 손쉬운 단일 단계 분류 프로토콜을 개발. 5 여기에 설명 된이 상세한 프로토콜 서쪽에 게 더 럽 히기에서 배열 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 적합 하 고 기능적인 단백질 misfolding 및 집계 시드를 질량 분석 기반 단백질 분석 실험. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일, EDTA 무함유 (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>마이크로팁 초음파처리기</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>냉장 초원심분리기</td></tr><tr><td>TLA120.1 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>초원심분리기 로터</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) 폴리카보네이트 튜브, 두꺼운 벽</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>TLA120.1 로터용 초원심분리기</td></tr><tr><td>튜브 4X SDS 시료 완충액</td><td>집에서 만든</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP 용액, 중성 pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>환원제</td></tr><tr><td>(TBS) 차단 완충액</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>차단 버퍼</td></tr><tr><td>(TBS) 차단 버퍼 + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>차단 버퍼 및 항체 희석제</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus 겔, 10웰</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>프리캐스트 SDS-PAGE 겔</td></tr><tr><td>MES SDS 러닝 버퍼(20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE 러닝 버퍼</td></tr><tr><td>N-라우로일사르코신 나트륨 염(사르코실)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>세제</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) 항체</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>항체</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>항체</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau 항체 (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>항체</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) 항체</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>항체와 관련상품</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 당나귀 anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>항체</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, 니트로셀룰로오스, 미니</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>겔 전사</td></tr></tbody></table>

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

이 연구에서 우리는 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜을 설명합니다. 이오니아 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 효과적으로 뇌 조직 신경 proteinopathies의 넓은 범위에서 세제 불용 성 단백질의 농축을 같이 허용에 기본적으로 접힌된 단백질 solubilizes Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 및 루 경화 증, 그리고 프리온 질병 인간의 제어 및 광고 사후 뇌 조직 되었고 무 균 sedimented ultracentrifugation sarkosyl 세제 불용 성 단백질 집계 pathologic phosphorylated 타우, neurofibrillary의 핵심 구성 요소를 포함 하 여 풍부 하 게 존재 하 여 광고에 tangles입니다. 서 부 럽 집계 phosphorylated 타우와 세제 수용 성 단백질, 제어 및 광고 두뇌에서 초기 Endosome 항 원 1 (EEA1)의 차동 가용성을 설명 했다. Proteomic 분석은 또한 β의 농축을 밝혀-아 밀 로이드 (Aβ), 타우, snRNP70 (U1-70 K), 그리고 apolipoprotein E (APOE) 제어, 이전 조직 분류 전략 일치의 그들에 비교 하는 광고 두뇌의 sarkosyl-불용 성 분수에 . 따라서,이 간단한 농축 프로토콜에 이르기까지 서 부 럽 고 기능 단백질에서 공동 집계 분석 실험 단백질 질량 분석 기반 실험 응용 프로그램의 광범위 한 이상적입니다.

축약된 한 단계 sarkosyl-분별 프로토콜 제어 및 광고 사후 뇌 (그림 1)에서 세제 불용 성 단백질 집계를 풍부 하 게 사용 되었다. TH-S, S1, S2, P2 분수에서 단백질 SDS-PAGE, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼와 부드러운 얼룩 뒤에 15 분에 대 한 고정 해결 했다. 때문에 s 2 분수에 단백질의 탐지 수준 물의 resuspension 단계는 선택 사항 (1.1.14 참조). 서쪽 오 점 분석 (그림 2A 와 B) 광고 두뇌 pathologic 높은 분자 무게 phosphorylated 타우 집계 했다 sarkosyl-불용 성, 그리고 아주 작은 pTau에 남아 있었다 명확 하 게 설명 합니다 ...

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

이 분별법 프로토콜의 전반적인 목표는 인간의 사후 뇌 조직에서 계면활성제 불용성 단백질 응집체를 농축하는 것입니다. 따라서 이 방법은 질병 내에서 잘못 접힌 단백질 응집체의 식별 및 특성 분석과 같이 신경퇴행성 질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 짧은 시간 내에 뇌 조직으로부터 계면활성제 불용성 단백질 응집체를 신속하게 농축하고 분리할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 기술자인 Tram Nguyen입니다. 건강한 대조군과 병리학적으로 확진된 AD 환자의 냉동 사후 뇌 조직을 준비하십시오. 핀셋과 면도날을 사용하여 각 조직 샘플에서 약 250mg의 회백질 부분을 절제합니다. 절제한 뇌 분절을 1분 동안 해동하십시오.이제 조직 조각이 해동되는 동안 약 2mm³ 크기의 정육면체 조각으로 다집니다. 이를 얼음 위에 놓인 미리 냉각시킨 2mL Dounce 균질기 튜브로 옮깁니다. 이때 백질과 큰 혈관은 피하도록 주의하십시오.빠르게 작업하여 조직을 TARE 일회용 무게 측정 보트에 넣으십시오. 뇌 조직이 담긴 무게 측정 보트를 드라이아이스가 들어 있는 폴리스티렌 용기에 자주 넣어 조직이 해동되지 않도록 주의하십시오. 필요한 모든 조직 조각을 박리하고 무게를 측정한 후, 조직 조각이 담긴 무게 측정 보트를 드라이아이스에서 꺼내십시오.다음으로, 조직 1g당 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일이 포함된 얼음처럼 차가운 저염 버퍼 5mL를 첨가하고, 간극이 넓은 페스틀 A로 약 10회, 간극이 좁은 페스틀 B로 15회 얼음 위에서 균질화합니다. 그다음 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 균질액을 라벨이 부착된 2mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 남은 균질액은 비슷한 방식으로 라벨이 부착된 추가 1.5mL 튜브에 소분하여 -80°C에서 보관합니다. 분획을 진행하려면, 0.8mL로 소분한 각 시료에 5M NaCl 100µL와 10% sarkosyl 100µL를 첨가합니다.반전 혼합하여 잘 섞어줍니다. 그런 다음 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 마이크로팁 프로브가 장착된 초음파 분쇄기를 사용하여 30% 진폭으로 5초씩 3회 펄스를 가합니다.BCA법(bicinchoninic acid method)을 사용하여 균질액의 단백질 농도를 결정한 후, 각 시료에 protease 및 phosphatase 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 sark 완

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

세포 prion 단백질의 새로운 종...

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

이 비디오는 비아밀로이드 단백질의 밀도 구배 원심분리 및 분해를 사용하여 마우스 뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 원섬유를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

이 비디오는 냉동된 사후 인간 뇌 조직에서 세제 불용성 단백질 응집체를 분리하고 농축하는 과정을 설명합니다. 이는 균질화, 세제 처리, 초음파 처리 및 초원심분리를 포함한 주요 단계를 보여주어 불용성 응집체를 분리하고 정제합니다. 마지막 단계는 추가 분석을 위해 요소 완충액에서 응집체를 용해하는 것입니다.

Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

본 연구는 GFAP와 그 병을 유발하는 돌연변이를 생화학적으로 특성화하기 위한 실험적 방법을 개략적으로 제시하며, 필라멘트 조립, 응집, 번역 후 변형에 중점을 둡니다. 고순도 GFAP 단백질을 분석하여 알렉산더병 기전에 대한 통찰을 밝혀내어 잠재적 치료 표적 연구와 GFAP 돌연변이 및 관련 질환 이해에 대한 틀을 제공하였습니다.

교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

배우세요 인간 사후 뇌 조직에서 세제 불용성 단백질 응집체를 농축하는 분획화 방법을 통해 신경퇴행성 질환의 병리 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 단백질 응집체를 효율적으로 분리하여 연구 생산성을 높입니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

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