Name: ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 ChEC-seq를 이용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 단백질-DNA 상호작용을 고해상도로 매핑하는 방법을. 포름알데히드 가교 없이 전사 조절 연구에 활용할 수 있습니다.

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ChEC-seq 개발과 Mediator 단지 적용에 대한 조언과 지원을 위해 원고와 Steven Hahn 및 Steven Henikoff의 비판적인 독서를 위해 Moustafa Saleh와 Jay Tourigny에게 감사드립니다. SG는 NIH 보조금 R01GM053451 및 R01GM075114에서 지원되며 GEZ는 Indiana University 시작 자금에서 지원됩니다.

1. 효모 균주의 생성 <ol><li> MNase로 태그가 붙은 관심있는 인자를 가진 효모 균주를 생성하십시오. <ol><li> PCR은 특정 반응 혼합물 ( 표 2 )과 사이클링 조건 ( 표 3 )을 사용하여 원하는 벡터 ( 표 1 )에서 MNase 태깅 카세트를 증폭. 5 μL의 PCR 반응과 1 μL의 6X DNA loading dye를 섞는다. 40 분 동안 120 V에서 0.8 % 아가로 오스 겔에서 각 PCR 분액을 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 2.3kb입니다. </li><li> 증폭 된 태깅 카세트를 표준 리튬 아세테이트 변형 22 를 사용하여 원하는 스트레인으로 변형시키고 선택을 수행하십시오. </li><li> 식민지 PCR과 태그 카세트의 올바른 통합을 확인합니다. <ol><li> 스크리닝 할 콜로니 수에 대해 지정된 반응 혼합물 ( 표 4 )을 준비합니다. 필요할 때까지 얼음을 계속하십시오. </li><li> 각 식민지의 일부를 선택하여 테멸균 된 이쑤시게 또는 pipet 팁을 사용하여 PCR 튜브의 바닥에 ted. </li><li> 1 분 동안 고출력으로 집게를 집어 넣습니다. </li><li> 혼합하기 위해 각 microwaved 식민지와 pipet에 PCR 믹스 ( 표 4 ) 50 μL를 추가합니다. 지정된 순환 조건을 사용하여 PCR을 수행하십시오 ( 표 5 ). </li><li> PCR 반응 50 μL와 각 PCR 튜브에 6X DNA 로딩 염료 10 μL를 직접 섞으십시오. 40 분 동안 120V에서 1 % 아가로 오스 겔에서 각 샘플의 10 μL를 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 700bp입니다. 참고 : 원하는 경우 Western blotting을 통한 MNase 융합 단백질의 적절한 발현을 확인하십시오. 태그 단백질의 분자량에서 ~ 20.6 킬로 달톤의 변화가 예상된다. </li></ol></li></ol></li><li> pGZ136 (표 1) 및 1.1.2 단계에서와 같은 변형 및 선택에 목적 유전자의 프로모터의 상 동성 기반 클로닝에 의해 무료 MNase 균주를 생성한다. <ol><li> Alternati다시 말하자면 관심있는 유전자의 프로모터와 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 플라스미드 벡터에 모으고, 1.1.2 단계에서와 같이 형질 전환하고 선택하고, 플라스미드의 유지를위한 적절한 선택 조건으로 변형시킨다. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> ChEC 실험 전날 오후 / 저녁에 MNase-tagged factor를 갖는 균주의 단일 콜로니와 함께 3 mL의 효모 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 또는 적절한 선택 배지를 접종한다. 이 배양 물을 밤새 품어주십시오 (180 RPM 흔들림, 30 ° C). </li><li> ChEC 실험 당일 아침 밤새 배양 물을 50 mL의 배지로 희석하여 600 nm에서의 광학 밀도 (OD 600 )가 0.2 - 0.3이되도록하십시오. 0.5 ~ 0.7의 OD 600 에 도달 할 때까지이 배양 물 (180 RPM 흔들어, 30 ° C)을 품어 둔다. 배양 물이 적절한 OD 600에 접근 할 때, 30 ℃로 heat block 또는 water bath를 설정하고 Buffer A 첨가제 ( Ta6). </li><li> 배양액 당 5 mL의 완충액 A 첨가물 ( 표 6 )을 준비하십시오. 절차 중에 버퍼 A를 실온에 유지하십시오. </li><li> 수집 할 시점마다 정지 용액 ( 표 7 ) 90 μL 및 10 % SDS 10 μL를 포함하는 microfuge 튜브를 준비합니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초, 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분 및 10 분에 시료를 채취합니다. </li><li> 배양액을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 1,500 xg 및 실온 (RT)에서 1 분간 원심 분리한다. </li><li> 버퍼 A의 1 ML에 철저하게 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브에 resuspended 세포를 전송하십시오. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended. </li><li> 상청액을 흡인하고 철저히 pipetting하여 버퍼 A 1 ML에 세포를 resuspend. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended. 이 단계를 한 번 반복하십시오. </li><li> 철저히 버퍼 A의 570 μL에 세포를 resuspend. 2 % digitonin의 30 μL를 추가(0.1 % 최종 농도) 세포의 permeabilization을 촉진하고, 혼합 반전. </li><li> 30 ° C에서 5 분간 열 블록 또는 수 욕조에서 세포를 투과시킨다. </li><li> 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 반응을 위 아래로 피펫 팅합니다. 중지 솔루션과 SDS (단계 2.4) 및 혼합 소용돌이가 포함 된 microfuge 튜브에 부정적인 컨트롤로 permeabilized 세포의 100 μL 나누어지는을 제거합니다. </li><li> permeabilized 세포에 1 M CaCl 2 (최종 농도 2 μM) 1.1 μL를 첨가하여 MNase를 활성화시키고 신속하게 여러 번 반전 시키거나 혼합 시키십시오. 즉시 30 ℃에서 혼합 반응을시키고 타이머를 시작하십시오. </li><li> 수집 할 각 시점에서 세포를 균등하게 분배하기 위해 반응을 위아래로 pipetting 한 다음 정지 용액과 SDS가 들어있는 미세 다공성 튜브에 permeabilized 세포를 100 μL 나누어 넣고 가볍게 섞습니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초 (CaCl 2 첨가 없음), 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분, 및 10 분의 시간 포인트. 참고 : 30 ° C에서 DNA를 빠르게 절단하는 요인을 사용한 ChEC 실험은 MNase 절단 동역학을 늦추기 위해 저온에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> 모든 시간 점이 수집되면 각 시료에 20 μg / mL proteinase K 4 μL를 넣고 가볍게 섞어 혼합하고 55 ° C에서 30 분 동안 배양합니다. </li><li> 각 샘플에 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 200 μL를 넣고 격렬히 섞어서 최대 속도와 RT에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 각각의 수성 상 (~ 150 μL)을 새 튜브에 옮깁니다. 글리코겐 30 μg과 100 % 에탄올 500 μL를 넣으십시오. 10 분 동안 또는 용액이 점성을 나타낼 때까지 드라이 아이스에 섞어서 침전 시키도록 격렬하게 가해줍니다. </li><li> 펠렛은 DNA를 10 분 동안 최대 속도와 4 ℃에서 마이크로 퓨즈로 침전시켰다. </li><li> 상층 액을 따라 내고 RT 70 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻는다. </li><li> 에탄올을 가만히 따르고,종이 타월에 튜브를 부드럽게 두드려서. 간단히 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 시료를 회전시키고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 5 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛. </li><li> 펠릿이 건조하는 동안, 각각 10mg / mL RNase A의 pH 8.0 + 1 μL의 Tris 29 μL로 건조 펠렛을 resuspend하는 마스터 믹스를 만드십시오. RNA를 37 ° C에서 20 분 동안 분해하십시오. </li><li> 각 샘플 5 μL와 6X DNA 로딩 염료 1 μL를 섞고 40 분 120 V에서 1.5 % 아가로 오스 겔에 실행합니다. </li></ol> 3. 사이즈 선택 참고 : 크기 선택의 목표는 시퀀싱 할 샘플에서 게놈 DNA의 다중 킬로베이스 단편을 제거하고 ~ 150 bp (뉴 클레오 솜 DNA의 대략 크기) 이하의 단편을 풍부하게하는 것입니다. 시퀀싱 데이터에서, &lt;400 bp의 단편이 풍부 해져서 뉴 클레오 솜 DNA 크기 (~ 150 bp) 주변의 주목할만한 피크와 서브 뉴 클레오 솜 단편의 피크 또는 넓은 분포가 풍부합니다. &lt;ol&gt; <li> 각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 23에 고상 가역 고정 (SPRI) 비즈 75 μL를 넣고 pipet up과 down 10 회 혼합합니다. 구슬을 품어 : RT에서 5 분 동안 DNA 혼합물. </li><li> SPRI 비드 인큐베이터 동안, 각 샘플에 대해 10 MM 트리스, pH 8.0 96 μL 및 5 M NaCl 4 μL를 포함하는 microfuge 튜브를 준비합니다. </li><li> 튜브의 측면에 구슬을 수집하는 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. 비드가 튜브의 측면에 2 분 동안 모으도록하십시오. </li><li> 각 상청액을 Tris와 NaCl이 들어있는 새 튜브에 옮긴다 (3.2 단계). </li><li> 각 샘플에 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 200 μL를 넣고 혼합하고 최대 속도와 5 분 동안 원심 분리하여 5 분간 원심 분리하십시오. </li><li> 각 수성 상을 새 튜브에 옮깁니다. 글리코겐 30 μg과 100 % 에탄올 500 μL를 넣으십시오. 10 분 동안 또는 용액이 점성을 나타낼 때까지 드라이 아이스에서 DNA를 침전시킵니다. </li><li> 펠렛 preci마이크로 스피어에서 최대 속도와 4 ° C에서 10 분간 DNA를 투척했다. </li><li> 상층 액을 버리고 70 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻는다. </li><li> 에탄올을 가만히 따르고 종이 타월에 튜브를 뒤집어 부드럽게 두드려 나머지 부분을 제거합니다. 간단히 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 시료를 회전시키고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 5 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛. </li><li> Tris, pH 8.0 25 μL로 Resuspend 건조 펠렛. 고감도 분석을 사용하여 시료 농도를 결정하십시오. TF ChEC 실험에서 크기 선택 후 10-100 ng의 DNA가 일상적으로 회수됩니다. </li><li> 시퀀싱 라이브러리를 준비하십시오. 이전에 설명한 24 와 같이 크기 선택에 의존하지 않는 라이브러리 준비 프로토콜은 광범위한 단편 크기 (25-500bp)의 시퀀싱을 허용하는 것이 바람직합니다. </li><li> 쌍 엔드 모드의 시퀀스 라이브러리. 고품질의 판독을 위해서는 각 말단에 최소 25 염기 서열이 필요합니다.매핑. 1 ~ 2 백만 판독 값은 ChEC 샘플에 대해 충분한 범위를 제공합니다. 참고 : ChEC-seq 데이터 분석은 복잡한 절차이며이 기사의 범위를 벗어납니다. 데이터 분석에 대한 자세한 정보는 이전 발행물 1 , 21 에서 찾을 수 있으며 분석에 사용되는 사용자 정의 스크립트는 GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq)에서 사용할 수 있습니다. HOMER 25 (http://homer.salk.edu)는 ChEC-seq 데이터의 명령 행 분석에도 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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우리는 ChEC가 다양한 종류의 효모 단백질을 염색질에 매핑 할 수 있으며, 효모의 다른 계열의 TF 및 기타 염색질 결합 인자에 널리 적용될 것으로 예상합니다. ChEC-seq은 가교 결합, 크로 마틴 가용화 또는 항체가 필요 없다는 점에서 유리하다. 따라서 ChEC는 불완전한 단백질 가용화로 인한 거짓 네거티브와 같은 hyper-ChIPable 아티팩트 3 , 4 및 기본 칩과 같은 X-ChIP-seq에 잠재적으로 존재하는 아티팩트를 피합니다 14 . ChEC-seq의 주요 단점은 모든 효소 융합 방법과 마찬가지로 융합 단백질에 대한 요구 사항입니다. 이것은 출아 효모에서 빨리 성취 될 수 있지만, 후생 동물에서는 더욱 힘들어집니다. ChEC-seq의 또 다른 한계는 히스톤 변형의 프로파일 링을 위해 그대로 구현 될 수 없다는 것이다. 그러나, 변형 - 결합 도메인은 MNase...

전사 인자 (TF), 염색질 리모델러 및 기타 염색질 관련 규제 요소의 결합 부위를 매핑하는 것이 모든 염색소 기반 프로세스를 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq) 접근법은 게놈 생물학에 대한 많은 중요한 통찰력을 얻기 위해 사용되었지만 주목할만한 한계가 있습니다. 우리는 최근 이러한 단점을 피하기 위해 염색질 내인성 절단 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq) 1 라고하는 대체 방법을 도입했습니다. ChIP-seq는 단백질 -DNA 상호 작용을 보존하기 위해 초기 포름 알데히드 가교 결합 단계 (X-ChIP-seq)로 수행되는 것이 가장 일반적입니다. 그러나 최근의 여러 연구에 따르면 X-ChIP-seq는 일시적 또는 비특이적 단백질 -DNA 상호 작용을 2 , 3 , 4 , 5 &lt;거짓 양성 결합 부위를 유발하는 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 또한 X-ChIP-seq 실험에서 염색질을 단편화하는 데 일반적으로 사용되는 초음파 처리는 열린 염색질의 영역을 우선적으로 절단하여이 영역에서 단편의 편향된 회수를 유도합니다 9 , 10 . Sonication 또한 exonuclease 소화 단계의 추가가 크게 해상도 11 , 12 을 향상시킬 수 있지만, 단편 길이의 이질적인 혼합물을 궁극적으로 바인딩 사이트 해상도를 제한한다. 친화도가 높고 자연적으로 분리 된 염색질 (ORGANIC) 13 에서 게놈의 점령 된 영역과 같은 기본 ChIP 방법은 포름 알데히이드 가교 결합 및 초음파 처리와 관련된 잠재적 인 편향을 경감시켜 미세 크로스 캡슐 핵산 분해 효소 (MNase)와 교차 결합 및 크로 마틴 조각을 사용하지 않습니다. 하나,네이티브 염색질 추출에 필요한 비교적 온화한 조건에서 많은 염색질 결합 단백질의 용해도가 낮아 잠재적으로 동적 범위 및 / 또는 거짓 네거티브 14 가 감소합니다. ChIP-seq의 다양한 반복이 단백질 -DNA 상호 작용의 게놈 - 전체 매핑에 가장 일반적으로 사용되는 반면, 관심있는 단백질과 다양한 DNA- 변형 효소의 융합을 기반으로하는 여러 매핑 기술이 구현되었다. 이러한 접근법 중 하나는 목적하는 염색질 결합 단백질이 댐에 유 전적으로 융합되고이 융합이 세포 또는 동물에서 발현되어 단백질 결합 부위에 인접한 GATC 서열의 메틸화를 초래하는 DNA 아데닌 메틸 전이 효소 동정 (DamID) 15 이다. DamID는 면역 침강에 의존하지 않으며 가교 결합, 항체 또는 염색질 가용화를 피할 수 있다는 점에서 유리하다. 그것은 또한 생체 내에서 수행 됩니다. 하나, DamID의 분해능은 킬로베이스 스케일로 제한되며, 댐 융합 단백질의 메틸화 활성은 구성 성이다. 효소 결합에 기초한 두 번째 방법은 트랜스포존에 대한 관심있는 인자의 융합을 이용하여 트랜스포존의 부위 특이 적 통합을 지시하는 Calling Card-seq 16 이다. DamID와 마찬가지로, Calling Card-seq은 면역 침강을 기반으로하지 않으므로 증가 된 해상도의 이점이있는 유사한 장점이 있습니다. 그러나, Calling Card-seq은 트랜스포존의 서열 편향에 의해 제한 될 수 있으며 또한 트랜스포존 삽입 부위에 가까운 제한 효소의 존재에 의존한다. Laemmli 연구실에서 개발 된 세 번째 효소 융합 방법은 염색질 내인성 절단 (ChEC) 17 입니다. ChEC에서는 염색질 관련 단백질과 MNase 사이의 융합이 세포에서 발현되며, MNase를 활성화시키기 위해 칼슘을 첨가하면 DNA가 태그가 붙은 결합 부위 근방에서 절단됩니다요인 ( 그림 1 ). Southern blotting과 함께, ChEC는 yeast 17 , 18 에서 다수의 개별 유전자좌에서 염색질 구조와 단백질 결합을 특성화하는데 사용되어 왔으며 , 저해상도 마이크로 어레이 분석과 결합하여 핵 세공 성분과 효모의 상호 작용을 조사했다 게놈 19 . ChEC는 DamID 및 Calling Card-seq와 유사한 이점을 제공하며, primer extension 19로 분석 할 때 그 해상도는 거의 단일 염기 쌍이다. ChEC는 또한 조절할 수 있습니다 : MNase에 의한 견고한 DNA 절단은 밀리몰 칼슘의 첨가에 달려있어 MNase는 살아있는 효모 세포에서 관찰되는 낮은 유리 칼슘 농도에서 불활성입니다 20 . 이전에 우리는 ChEC와 고효율 시퀀싱 (ChEC-seq)을 결합하면 TF 바인딩 사이트의 고해상도 맵을 제공 할 것이라고 가정했습니다. 사실, ChEC-seq는 게놈 1을 가로 지르는 신진 효모 일반 조절 인자 (Abf1, Rap1, Reb1)의 고해상도지도를 생성했습니다. 우리는 또한 ChEC-seq를 DNA와 직접 접촉하지 않고 ChIP-seq로지도 화하기 어려울 수있는 메가 달톤 크기의 복합체로 ChEC-seq의 적용 가능성을 확대하는 보존 된 필수 전사 전사 보조 활성제 인 모듈 형 Mediator 복합체에 성공적으로 적용했습니다. 기반 방법. ChEC-seq는 ChIP-seq 결과를 독립적으로 검증하고 염색질 상주 프로세스의 규제에 대한 새로운 통찰력을 창출하는 강력한 방법입니다. 여기, 출연 효모에서이 방법을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 고충실도 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Phusion과 같은 다른 고충실도 DNA 중합효소를 카세트 증폭에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Ca2+의 킬레이트화에 의한 MNase 절단을 억제하지 않도록 EDTA-free 프로테아제 억제제 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, 고순도</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>격렬한 와류로 1mL DMSO에 20mg 디지토닌을 용해하여 2% 스톡을 만듭니다.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>ampure-like beads는 공개된 프로토콜(ref 24)을 사용하여 생성할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MagneSphere 마그네틱 랙</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

chec-seq와의 단백질 - dna 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

게놈 전체에 걸친 단백질 -DNA 상호 작용의 매핑은 유전자 조절, 염색질 재구성 및 기타 염색질 상주 과정을 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (X-ChIP-seq)에 따른 포름 알데히이드 가교는 게놈 생물학에 대한 많은 가치있는 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 그러나 X-ChIP-seq는 가교 결합 및 초음파 처리와 관련하여 주목할만한 한계가 있습니다. 네이티브 칩은 가교 결합을 생략함으로써 이러한 결점을 피하지만 종종 크로 마틴 결합 단백질의 빈약 한 회복을 초래합니다. 또한 모든 ChIP 기반 방법은 항체 품질 고려 사항의 적용을받습니다. 단백질을 DNA 변형 효소에 융합시키는 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 효소 적 방법도 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 데 사용되어왔다. 우리는 최근 ChEC-seq와 같은 high-throughput sequencing을 가진 chromatin endogenous cleavage (ChEC)와 같은 방법을 조합했다. ChEC-seq은 염색체 결합체 (chromatin-assoc)의 융합에 의존한다생균 내 칼슘의 존재하에 표적화 된 DNA 절단을 생성하기 위해 미세 구균 핵산 분해 효소 (MNase)에 관심있는 대상 단백질. ChEC-seq은 면역 침전을 기반으로하지 않으며 가교 결합, 초음파 처리, 염색질 가용화 및 항체 품질에 대한 잠재적 인 우려를 회피하면서 최소한의 배경 신호로 고해상도 매핑을 제공합니다. 우리는 ChEC-seq가 ChIP에 대한 강력한 대응 물이 될 것이며, ChIP-seq 발견을 검증하고 게놈 규제에 대한 새로운 통찰력을 발견 할 수있는 독립적 인 수단을 제공 할 것이라고 기대한다.

성공적인 ChEC 실험의 경우, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 DNA 분석은 게놈 DNA의 번짐 및 최종 완전한 소화에 의해 지시 된 바와 같이, DNA 단편화에 따른 칼슘 의존성 증가를 나타낼 것이다. 어떤 경우에는 전통적인 MNase 소화와 비슷한 밴드 사다리가 확장 소화 후에 관찰됩니다. 이것은 nucleosome-depleted regions (NDRs)에 결합하는 일반적인 조절 인자 인 Reb1의 ChEC 분석의 경우이다 ( 그림 2 ). 우리는 GRFs의 경우, 확장 소화가 신속하게 절단 된 결합 부위에서 신호 손실을 초래한다는 것을 발견했습니다 1 . 이상적으로, Reb1 ChEC의 30 초 및 1 분 시점과 같이 고 분자량의 번짐을 나타내는 게놈 DNA 밴드의 크기가 감소 된 샘플은 신호의 시간 의존적 손실을 피하기 위해 시퀀싱에 사용됩니다 . <p...

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

본 절차의 전반적인 목표는 포름알데히드 가교, 염색질 가용화 또는 항체가 필요 없이, 고해상도와 낮은 배경 잡음으로 인 시투(in situ)에서 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전체 지도를 생성하는 것입니다. 이 방법은 다양한 조절 인자가 유전자 조절 부위와 관련하여 염색질의 어느 위치에 결합하는지와 같은 전사 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배경 잡음이 거의 없는 고해상도 게놈 결합 지도를 제공하며, 표준 ChEC-seq 프로토콜과 관련된 제약 사항들을 피할 수 있다는 점입니다.시연을 맡아줄 분은 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 동료인 Sebastian Grunberg입니다. 실험 전날 오후 또는 저녁에 실험용 균주의 예비 배양을 시작하십시오. MNase 태그 인자를 보유한 균주의 단일 콜로니를 3 mL의 peptone dextrose 또는 적절한 선택 배지에 접종하십시오.이 배양액을 30 °C 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액을 50 mL 배지에 희석하여 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.2에서 0.3이 되도록 합니다. 600 nm에서의 흡광도가 0.5에서 0.7에 도달할 때까지 진탕 배양기에서 배양합니다.첨가제가 포함된 Buffer A를 필요한 양만큼 준비하고, 실험 과정 동안 실온으로 유지하십시오. 시료 수집을 위한 마이크로 원심분리 튜브를 준비하십시오. 분석하는 각 새로운 인자마다, 칼슘을 첨가하지 않은 시료를 수집하고, 칼슘 첨가 후 30초, 1분, 2.5분, 5분 및 10분 후에 시료를 수집하십시오.각 튜브에 정지 용액 90 µL와 10% SDS 10 µL를 첨가합니다. 배양액의 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.5에서 0.7에 도달하면, 배양액을 50 mL 원뿔형 튜브에 붓고 실온에서 1,500 ×g로 1분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 세포를 1 mL의 Buffer A에 완전히 재부유시킨 후 재부유된 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.재부유시킨 세포를 마이크로 원심분리기에서 상온, 1,500 ×g로 30초 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 피펫팅을 통해 Buffer A 1 mL에 세포를 완전히 재부유시킵니다. 재부유시킨 세포를 상온, 1,500 ×g로 30초 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.상층액을 제거하고, 세포를 1 mL의 Buffer A에 재현탁한 후 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거한 뒤, 세포를 570 µL의 Buffer A에 완전히 재현탁합니다. 세포의 투과화를 촉진하기 위해 2% digitonin 30 µL를 첨가하고, 뒤집어서 섞어줍니다. 30 °C의 히팅 블록에서 5분 동안 세포를 투과화합니다.세포가 고르게 분포되도록 피펫으로 반응액을 위아래로 섞어줍니다. 음성 대조군으로, 투과화된 세포액 100 µL를 정지 용액과 SDS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 옮긴 후, 짧게 볼텍싱하여 혼합합니다. 시간 경과 실험을 시작하기 전, 초기 시점의 샘플을 효율적으로 수집할 수 있도록 정지 용액 튜브, 피펫, 피펫 팁, 타이머를 히팅 블록 옆에 배치하는 것이 중요합니다.시계열 실험을 시작하려면, 1.1 µL의 1 M calcium chloride를 투과화된 세포에 첨가하여 MNase를 활성화하고, 빠르게 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 혼합된 반응액을 즉시 30 °C로 되돌리고 타이머를 시작합니다. 각 수집 시점마다 피펫으로 반응액을 상하로 섞어 세포가 고르게 분포되도록 한 다음, 투과화된 세포 100 µL의 분주액을 정지 용액과 SDS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.짧게 볼텍싱하여 혼합합니다. 모든 시점의 샘플 수집이 완료되면, 각 샘플에 20 mg/mL proteinase K 4 µL를 첨가합니다. 짧게 볼텍싱하여 혼합한 후, 55 °C에서 30분 동안 배양합니다.각 샘플에 phenol:chloroform:isoamyl alcohol 200 µL를 첨가하고, 격렬하게 볼텍싱하여 혼합한 후, 상온에서 최대 속도로 5분간 원심분리합니다. 수층을 새로운 튜브로 옮깁니다. glycogen 30 µg과 100% ethanol 500 mL를 첨가합니다.격렬하게 볼텍싱하여 혼합하고, 용액이 끈적해질 때까지 또는 10분 동안 드라이아이스에서 침전시킵니다. 최대 속도, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 DNA를 펠렛화합니다. 상층액을 따라내고 각 펠렛을 실온의 70% ethanol 1 mL로 세척합니다.에탄올을 따라내고, 튜브를 뒤집어 종이 타월 위에 가볍게 두드려 남은 액체를 제거합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 샘플을 짧게 원심분리한 후, 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다.DNA 펠렛이 건조되는 동안, 건조 후 펠렛을 재현탁하기 위한 Tris 버퍼와 RNase A 마스터 믹스를 제조하고 볼텍싱하여 혼합합니다. 건조된 각 DNA 펠렛에 RNase A 용액 30 µL를 첨가하고, 볼텍싱으로 혼합한 후 37 °C에서 20분 동안 배양하여 RNA를 분해합니다. 20분 후, 각 샘플 5 µL에 6X DNA 로딩 다이 1 µL를 혼합하고, 1.5% 아가로스 겔에서 120 V로 40분 동안 전기영동을 수행합니다.각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 용액에 포함된 SPRI beads 75 µL를 첨가하여 크기 선택 절차를 시작합니다. 비즈와 DNA 혼합물을 섞기 위해 피펫팅을 10회 반복한 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다. SPRI bead 배양 동안, 각 샘플을 위해 10 mM Tris pH 8.0 96 µL와 5 M sodium chloride 4 µL가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다.비드와 DNA 혼합물이 담긴 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓아 비드를 튜브 벽면에 모은 다음, 각 상층액을 Tris와 sodium chloride가 담긴 새 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 200 µL의 phenol:chloroform:isoamyl alcohol을 첨가하고, 볼텍싱하여 혼합한 후 실온에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리합니다. 각 수층을 새 튜브로 옮기고, 30 µg의 glycogen과 500 µL의 100% ethanol을 첨가합니다.드라이아이스에서 10분 동안 또는 용액이 점성이 생길 때까지 DNA를 침전시킵니다. 최대 속도와 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 DNA를 펠렛화합니다. 상층액을 따라내고 각 펠렛을 1 mL의 70% ethanol로 세척합니다.에탄올을 따라내고, 튜브를 뒤집어 종이 타월 위에서 가볍게 두드려 남은 액체를 제거합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 샘플을 짧게 원심분리한 후, 피펫을 이용하여 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠렛을 실온에서 5분 동안 공기 건조합니다.각 건조 펠렛을 25 µL의 Tris pH 8에 재현탁합니다. 고감도 분석법을 사용하여 각 샘플의 농도를 측정합니다. 뉴클레오솜 결핍 부위에 결합하는 일반 조절 인자인 Reb1의 염색질 내인성 절단 분석을 통한 DNA 아가로스 겔 전기영동 결과, 스미어링으로 나타나는 시간 경과에 따른 칼슘 의존적 DNA 단편화 증가와 최종적인 게놈 DNA의 완전한 소화가 확인됩니다.Reb1 염색질 내인성 절단 시퀀싱 실험의 단편 말단 시각화 결과, 30초간의 칼슘 처리 후 유리 MNase 균주로부터 유도된 배경 값 대비 Reb1의 강력한 농축이 확인되었습니다. 마찬가지로, 칼슘 첨가 1분 후 Med8 프로모터에 의해 구동되는 유리 MNase에서는 나타나지 않았으나, 매개체 서브유닛 Med8과 MNase의 융합 단백질에 의한 상당한 DNA 절단이 관찰되었습니다. Reb1 염색질 내인성 절단 시퀀싱 데이터를 염색질 면역침전 및 고처리량 시퀀싱 데이터와 비교하기 위해, 유기적 방법으로 결정된 1,992개의 Reb1 피크를 모티프 중심으로 정렬하였으며, 모티프 중간 지점을 둘러싼 100 base pair 윈도우 내 각 염기 위치에서의 평균 단편 말단 수를 산출하였습니다.대부분의 Reb1-MNase 방출 단편 말단이 모티프의 상류 측에 매핑되는 현저한 비대칭성과 절단이 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 단 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 정확한 피펫팅과 처리 시간을 확보하기 위해 병렬로 분석하는 샘플 수를 제한하는 것이 중요합니다.본 기술의 개발 이후, 전사 분야의 연구자들은 효모에서 DNA에 결합하지 않는 메가달톤 크기의 단백질 복합체의 게놈 연관성을 최초로 명확하게 규명할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 출아 효모 게놈 내 단백질 결합 부위의 게놈 전반에 걸친 매핑을 위한 ChEC-Seq 방법의 수행법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

배우세요 ChEC-seq를 이용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 단백질-DNA 상호작용을 고해상도로 매핑하는 방법을. 포름알데히드 가교 없이 전사 조절 연구에 활용할 수 있습니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑

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