ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑 사카로 마이 세스 세레 비시 애

이 절차의 전반적인 목표는 포름알데히드 교차결합, 염색질 용해 또는 항체가 필요 없이 고해상도와 낮은 배경으로 단백질-DNA 상호 작용의 게놈 전체 지도를 현장에서 생성하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 영역과 관련하여 다양한 조절 요인이 염색질과 연관되는 위치와 같은 전사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무시할 수 있는 배경의 고해상도 게놈 결합 맵을 제공하고 표준 ChEC-seq 프로토콜과 관련된 제한을 피할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)의 동료인 세바스찬 그룬버그(Sebastian Grunberg)입니다. 실험 전날 오후 또는 저녁에 실험 사용 균주의 사전 배양을 시작합니다. 사용된 펩톤 포도당 3밀리리터 또는 MNase 태그 인자를 포함하는 균주의 단일 콜로니가 있는 적절한 선택적 배지를 접종합니다.

이 배양물을 섭씨 30도의 쉐이커 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 아침, 하룻밤 배양을 0.2 내지 0.3의 600 나노 미터에서 광학 밀도로 50 밀리리터의 매체로 희석합니다. 600 나노미터의 광학 밀도에서 0.5 - 0.7의 광학 밀도에 도달할 때까지 shaker incubator에서 배양합니다.

필요한 양의 Buffer A와 첨가제를 준비하고 절차 중에 실온을 유지하십시오. 샘플 수집을 위해 마이크로분리 튜브를 준비합니다. 분석된 각각의 새로운 인자에 대해 칼슘을 첨가하지 않은 샘플을 수집하고 칼슘 첨가 후 30초, 1분, 2.5분, 5분, 10분을 추가합니다.

각 튜브에 90 마이크로 리터의 정지 용액과 10 % SDS 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 배양액이 600 나노 미터에서 0.5 내지 0.7의 광학 밀도에 도달하면, 배양물을 50 밀리리터 원추형 튜브에 디캔팅하고, 실온에서 1 분 동안 1, 500 배 g에서 원심 분리한다. 상층액을 제거하고, 1ml의 Buffer A에 세포를 완전히 재현탁시키고, 재현탁액을 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

재현탁된 세포를 실온에서 30초 동안 1, 500회 g의 마이크로퓨지에 펠렛화합니다. 상층액을 흡인하고 위아래로 피펫팅하여 1ml의 Buffer A에 세포를 완전히 재현탁합니다. 재현 탁 된 세포를 실온에서 30 초 동안 1, 500 회 g으로 펠렛화합니다.

상층액을 제거하고 1ml의 Buffer A에 세포를 재현탁시킨 다음 다시 원심분리합니다. 상등액을 제거한 후, 완충액 A.의 570 마이크로 리터에 세포를 완전히 재현탁시킵니다.세포의 투과화를 촉진하기 위해 30 마이크로 리터의 2 % 디지 토닌을 첨가하고 혼합하도록 반전시킵니다. 섭씨 30도의 열 블록에서 5분 동안 세포를 투과합니다.

세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 반응을 위아래로 피펫팅합니다. 음성 대조군으로, 투과화된 세포의 100마이크로리터 분취액을 정지 용액과 SDS가 포함된 마이크로분리 튜브로 옮기고 잠시 와류하여 혼합합니다. 시간 경과를 시작하기 전에 정지 용액 튜브, 피펫, 피펫 팁 및 타이머를 열 블록 옆에 두어 초기 시점을 효율적으로 수집할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.

시간 경과를 시작하려면 투과화된 세포에 1.1마이크로리터의 1몰 염화칼슘을 추가하여 MNase를 활성화하고 빠르게 여러 번 반전시켜 혼합합니다. 즉시 혼합 반응을 섭씨 30도로 되돌리고 타이머를 시작하십시오. 수집할 각 시점에서 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 반응을 위아래로 피펫팅한 다음 투과화된 세포의 100마이크로리터 분취액을 정지 용액 및 SDS가 포함된 마이크로분리 튜브로 제거합니다.

소용돌이를 간단히 섞습니다. 모든 시점이 수집되면 각 샘플에 밀리리터당 20mg의 단백질 분해 효소 K 4마이크로리터를 추가합니다. Vortex를 잠시 혼합하고 섭씨 55도에서 30분 동안 배양합니다.

각 샘플에 200마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 첨가하고 격렬하게 소용돌이치며 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 수성상을 새 튜브로 제거합니다. 글리코겐 30마이크로그램과 100% 에탄올 500밀리리터를 첨가합니다.

와류를 격렬하게 혼합하고 10 분 동안 또는 용액이 점성이 될 때까지 드라이 아이스에 침전시킵니다. 침전된 DNA를 최대 속도로 원심분리하고 섭씨 4도에서 10분 동안 펠렛화합니다. 상등액을 디캔팅하고 각 펠릿을 1 밀리리터의 실온 70 % 에탄올로 세척합니다.

에탄올을 디캔팅하고 뒤집어서 나머지를 제거하고 종이 타월로 튜브를 부드럽게 두드려 제거합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 샘플을 잠시 회전시킨 다음 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다.

DNA 펠릿이 건조되는 동안 Tris 버퍼와 RNase A의 마스터 믹스를 만들어 펠릿이 건조되면 펠릿을 재현탁시키고 와류를 혼합합니다. 건조된 각 DNA 펠릿에 30마이크로리터의 RNase A 용액을 추가하고, 소용돌이를 섞어 섞고, 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 RNa를 분해합니다. 20분 후 1마이크로리터의 6X DNA 로딩 염료를 각 샘플 5마이크로리터와 혼합하고 120볼트에서 1.5% 아가로스 젤로 40분 동안 실행합니다.

각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 용액에 75마이크로리터의 SPRI 비드를 첨가하여 크기 선택 절차를 시작합니다. 비드와 DNA 혼합물을 혼합하기 위해 위아래로 10회 피펫팅한 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. SPRI 비드 배양 중에 각 샘플에 대해 96마이크로리터의 10밀리몰 Tris pH pH 8.0과 4마이크로리터의 5몰 염화나트륨이 들어 있는 마이크로분리 튜브를 준비합니다.

비드와 DNA 혼합물이 들어있는 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 튜브 측면의 비드를 채취한 다음 각 상층액을 트리스와 염화나트륨이 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 첨가하고, 와류를 섞어 실온에서 5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 각 수성상을 새 튜브로 제거하고 글리코겐 30마이크로그램과 100% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다.

드라이아이스에 DNA를 10분 동안 또는 용액이 점성이 생길 때까지 침전시킵니다. 침전된 DNA를 최대 속도와 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 상층액을 디캔팅하고 각 펠릿을 1 밀리리터의 70 % 에탄올로 세척하십시오.

에탄올을 디캔팅하고 뒤집어서 종이 타월로 튜브를 부드럽게 두드려 나머지를 제거합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 샘플을 잠시 회전시키고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조합니다.

건조된 각 펠릿을 Tris pH 8의 25마이크로리터에 재현탁합니다. 고감도 분석을 사용하여 각 샘플의 농도를 측정합니다. 뉴클레오솜이 고갈된 영역과 결합하는 일반적인 조절 인자인 Reb1의 염색질 내인성 절단 분석에서 DNA의 아가로스 겔 전기영동은 번짐에 의해 나타난 바와 같이 시간이 지남에 따라 DNA 단편화의 칼슘 의존적 증가와 게놈 DNA의 궁극적인 완전한 소화를 보여줍니다.

Reb1 염색질 내인성 절단 염기서열분석 실험에서 단편 말단을 시각화하면 칼슘 처리 30초 후 free MNase 균주에서 파생된 백그라운드에 걸쳐 Reb1의 강력한 농축을 확인할 수 있습니다. 유사하게, 매개체 소단위체 Med8과 MNase의 융합에 의해 상당한 DNA 절단이 관찰되었지만, 칼슘 첨가 1분 후 Med8 프로모터에 의해 유도된 자유 MNase는 관찰되지 않았습니다. Reb1 염색질 내인성 절단 염기서열분석 데이터를 염색질 면역침전 및 고처리량 염기서열분석 데이터와 비교하기 위해, 유기적 방법에 의해 결정된 1,992개의 Reb1 피크를 모티프 중앙에 배치하고, 모티프 중간점 주위의 100 염기쌍 창에서 각 염기 위치의 평균 단편 말단 수를 측정했습니다.

현저한 비대칭과 분열이 관찰되었으며, 대부분의 Reb1-MNase 방출 단편 말단이 모티프의 상류 쪽에 매핑되었습니다. 일단 숙달되면 이 기술이 제대로 수행된다면 하루 종일 일할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 정확한 피펫팅 및 취급 시간을 보장하기 위해 병렬로 분석되는 샘플의 수를 제한하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후, 이 기술은 전사 분야의 연구자들이 처음으로 효모에서 DNA가 아닌 결합, 메가달톤 크기의 단백질 복합체의 게놈 연관성을 명확하게 특성화할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 발아 효모 게놈에서 단백질 결합 부위의 게놈 전체 매핑을 위해 ChEC-Seq 방법을 수행하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다.