신생아 Hypoxic-허 혈 성 뇌 손상의 마우스 모델에서 Neurobehavioral 평가

인지 및 운동 능력 테스트가 수반되는 신생아 저산소-허혈성 뇌 손상 수술의 전반적인 목표는 이러한 손상 및 관련 뇌 손상을 연구하기 위한 마우스 모델을 구축하는 것입니다. 이 방법은 신생아 저산소-허혈성 뇌 손상이 운동 및 인지 기능에 어떤 영향을 미치는지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잘 알려져 있으며 일반적으로 널리 사용된다는 점입니다.

또한 이는 뇌성마비 및 신생아 뇌졸중의 전임상 모델이기도 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 우측 경동맥을 단독으로 식별하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시연 과정에는 저와 더불어 저희 실험실의 대학원생인 신윤겸 님이 함께할 예정입니다.

최소 다섯 마리의 P7 마우스 새끼를 마취시킨 후, 해부 현미경 아래에 복부가 위로 향하도록 배치합니다. 그다지 목 부위를 알코올로 소독합니다. 수술을 시작하기 위해 가위를 사용하여 목에 0.7 mm 절개를 넣습니다.

그 다음, 포셉을 사용하여 단측 우측 경동맥이 노출될 때까지 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 이어서 5-0 봉합사를 사용하여 단측 우측 경동맥을 결찰합니다. 이제 5-0 나일론으로 목의 절개 부위를 봉합하고, 해당 부위를 멸균 처리합니다.

그런 다음, 뚜껑을 열어둔 37°C 저산소 챔버에서 새끼 쥐가 약 한 시간 동안 회복되도록 합니다. 수술 조작을 받은 다른 생쥐를 저산소 챔버에 넣어 회복시킵니다. 새끼 쥐들이 모두 완전히 깨어나면, 챔버 뚜껑을 닫고 가스 농도를 낮추어 저산소 상태를 조성합니다.

90분간의 저산소증 처리 후, 뇌 손상을 입은 새끼 쥐들을 케이지로 되돌려 보냅니다. 일주일 후, 이전과 동일하게 수술을 준비하여 손상 증거를 확인합니다. 두피를 절개하여 우반구의 후외측 영역에 있는 뇌 병변을 확인합니다.

반투명한 두개골을 통해 피질 손상 및 해마 손상 증거가 있는지 확인하십시오. 이에 따라 새끼 쥐를 손상군 또는 비손상 대조군으로 분류하십시오. 확인 후, 봉합사로 두피를 닫고 절개 부위를 소독하십시오.

마우스가 6주령이 되었을 때, 혐오 자극의 학습 및 회피 정도를 바탕으로 기억력을 평가합니다. 이 과제에는 상용 2구획 단계 통과 수동 회피 장치를 사용합니다. 우선, 마우스를 상자의 밝은 구획에 30초 동안 둡니다.

그 다음, 구획 사이의 문을 열고 동물이 어두운 구획으로 들어갈 때까지의 잠복기를 기록합니다. 과제를 수행하는 시간은 최대 300초까지 허용합니다. 마우스의 네 발이 모두 어두운 구획 안으로 완전히 들어가면 문을 닫습니다.

그 다음, 2초 동안 1/2 mA의 전기 발 충격을 가한 후, 마우스를 케이지로 돌려보냅니다. 24시간 후에 테스트를 반복합니다. 이번에는 마우스가 암실로 이동할 수 있도록 충분히 300초의 시간을 주되, 마우스에게 충격을 가하지는 않습니다.

질적 및 양적 분석을 모두 사용하여 운동 기능의 미세한 장애를 구분하기 위해 6주령 생쥐를 대상으로 래더 워킹 테스트를 수행합니다. 먼저 래더 장치를 설치한 다음, 장치 위에서 생쥐의 사지 움직임을 기록할 비디오 카메라를 설정합니다. 다음으로, 생쥐를 시작 패널에 놓고 비디오 카메라로 녹화를 시작합니다.

비디오에서 다리 부분이 선명하게 초점이 맞았는지 확인하십시오. 마우스가 사다리 장치의 마지막 패널에 닿으면 녹화를 중단하십시오. 그런 다음 마우스를 다시 시작 패널로 옮기고, 마우스가 장치를 다시 통과하는 모습을 녹화하십시오.

각 실험 날짜에 마우스 한 마리당 총 4회 반복 수행하십시오. 이후 비디오를 분석할 때, 비디오를 1/10 속도로 재생하며 각 사지에서 발생한 미끄러짐 횟수를 수동으로 측정하십시오. 사지가 바(bar) 사이로 미끄러지는 경우를 미끄러짐으로 간주합니다.

마우스가 6주령이 되었을 때, 악력을 측정합니다. 패널에 고정된 지름 2 mm의 삼각형 와이어가 장착된 푸시/풀 스트레인 게이지를 사용하십시오. 마우스의 꼬리를 잡고 패널 위에 위치시킵니다.

그다음, 마우스가 앞발로 금속 와이어에 닿게 합니다. 마우스가 와이어를 잡는 즉시, 잡고 있던 것을 놓을 때까지 꼬리를 부드럽게 당깁니다. 장비가 와이어에 가해진 최대 힘을 g 단위로 기록합니다.

마우스에게 휴식을 주기 전에 이 테스트를 5회 반복하십시오. 악력 테스트 중에는 정확한 수행 능력을 나타내는 눈에 띄는 움직임들이 관찰됩니다. 마우스의 근육 피로를 줄이기 위해 최소 1분 동안 휴식을 취하게 하기 전, 5번의 시도 동안 이러한 움직임들을 확인하십시오.

마우스가 최소 1분 동안 휴식을 취한 후, 5회 시도 시리즈를 다시 반복합니다. 그 다음, 마우스에게 다시 휴식 시간을 주고 해당 테스트 일의 마지막 시리즈를 수행합니다. 수집된 데이터에서 분석을 위해 한쪽 앞발 또는 양쪽 앞발의 상위 3개 점수의 평균값을 사용합니다.

14주령의 저산소-허혈성 손상 동물의 뇌를 적출한 후, 형태학적으로 피질 손상이 없거나, 경미한 손상이 있거나, 또는 심각한 손상이 있는 것으로 평가하였습니다. 동일한 동물들을 일주일 전에 MRI로 스캔하였으며, 이 결과 또한 매우 유용했습니다. 형태학적으로 정상인 뇌조차 해마에서 경미한 손상을 보였습니다.

생후 6주 및 손상 후 5주가 되었을 때, 마우스들을 대상으로 다양한 행동 과제를 통해 평가를 진행하였습니다. 저산소-허혈성 손상을 입은 마우스들은 24시간 수동 회피 과제에서 인지 기능 저하를 보였습니다. 우측 뇌반구만 손상되었기 때문에, 마우스들은 편마비성 운동 기능을 나타냈습니다.

이는 각 앞다리의 사다리 가로 가로대에서 발생한 미끄러짐 비율의 차이로 확인되었습니다. 또한, 파지력은 뇌의 운동 피질과 관련되어 있으므로, 정상군과 피질 손상군 사이에 파지력 차이가 나타났습니다. 정상 대조군과 범주적으로 손상되지 않은 생쥐 사이에는 차이가 관찰되지 않았으나, 손상된 생쥐들은 분명한 기능 저하를 보였습니다.

이 영상을 시청한 후, 신생아 저산소-허혈 생쥐 모델을 생성하기 위해 오른쪽 총경동맥을 일측성으로 결찰하는 방법과 후속 행동 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 손상 7일 후 대뇌 피질에 눈에 보이는 손상이 없더라도 MRI 상에서는 해마 손상이 나타날 수 있다는 점에 유의하십시오. 또한, 새끼 생쥐를 조심스럽게 다루고 수술을 가능한 한 빠르게 완료하는 것이 중요합니다.

새끼들은 피부가 매우 약하고 얇으므로 각별히 주의하십시오.