June 28th, 2017
이 프로토콜은 ultrafast microfluidic 흐름과 이미징 유동 세포 계측법의 응용 프로그램에서 단일 셀 이미징을위한 비대칭 감지 시간 - 스트레치 광학 현미경 시스템의 구현을 설명합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 초고속 미세유체 흐름에서 무표지 고대비 단일 세포 이미징을 위한 비대칭 검출 시간 스트레치 광학 현미경 시스템을 준비하고 사용하는 것입니다. ATOM의 가장 큰 장점은 최대 수십 메가헤르츠의 라인 스캔 속도로 초고속 이미지를 캡처하는 동시에 라벨링되지 않은 셀의 이미지 대비를 향상시킨다는 것입니다. ATOM은 초당 최대 100,000개의 세포로 중심을 잡지 않은 세포 기반 분석을 통해 세포 및 세포 내 구조에 대한 복잡한 형태학적 분석을 가능하게 하며, 이는 표준 유세포 분석으로는 불가능합니다.
시스템 설정을 시작하려면 광섬유 콜리메이터를 사용하여 광대역, 펨토 또는 피코 초, 근적외선 펄스 레이저를 광 증폭기에 연결된 단일 모드 분산 광섬유에 연결합니다. 레이저로 투과 회절 등급을 비추어 스펙트럼 샤워를 생성합니다. 회절 효율을 최대화하기 위해 그레이딩을 littrow 구성에 가깝게 배치합니다.
4f 이미징 시스템에서 telescopic relay lens assembly를 구성하여 spectral shower를 샘플 플랫폼 아래에 있는 대물 렌즈의 후면 초점면으로 향하게 합니다. 스펙트럼 샤워가 대물 렌즈의 후면 조리개를 채우는지 확인하십시오. 샘플 플랫폼 위의 후면 조리개에 평면 거울이 있는 다른 대물 렌즈를 배치합니다.
초점면이 겹칠 때까지 대물 렌즈를 조정합니다. 스펙트럼 샤워가 이미지 평면을 두 번 통과하고 동일한 경로를 따라 그레이딩으로 돌아가는지 확인합니다. 샘플 플랫폼에 미세유체 칩을 놓고 스펙트럼 샤워가 미세유체 채널을 가로질러 떨어지도록 합니다.
반사광이 그레이딩을 통과한 후 빔 스플리터로 반사광의 방향을 바꿉니다. 반사된 빛을 다른 빔 스플리터를 사용하여 두 개의 빔으로 분리합니다. 파이버 콜리메이터를 사용하여 빔을 서로 다른 길이의 단일 모드 파이버에 연결하여 빔 사이에 시간 지연을 도입합니다.
광섬유 커플러와 광 검출기를 통해 광섬유를 실시간 오실로스코프에 연결합니다. 광 신호의 신호 대 잡음비가 10데시벨보다 클 때까지 광 증폭기 이득을 조정합니다. 그런 다음 반환된 각 빔의 약 절반을 나이프 에지 빔 블록으로 차단합니다.
각 광섬유에서 측정된 광 전력이 블록 이전 전력의 약 절반이 될 때까지 빔 블록을 조정합니다. 오실로스코프 대역폭과 샘플링 속도가 모두 이미지 해상도에 영향을 주지 않을 만큼 충분히 높은지 확인합니다. 실험을 시작하려면 세포 샘플을 인산염 완충 식염수 또는 샘물로 밀리리터당 10에서 5번째, 10에서 6번째 세포 사이로 희석합니다.
그런 다음 세포 용액을 10ml 주사기에 로드합니다. 주사기를 미세유체 채널 입구에 연결합니다. 미세유체 채널 배출구를 원심분리기 튜브로 향하게 합니다.
주사기 펌프에 주사기를 고정하고 채널 너비에 맞게 유량을 설정합니다. 실험에 대해 저장할 데이터 포인트의 수를 선택합니다. 그런 다음 광 신호 데이터를 획득하고 저장합니다.
오실로스코프에서 컴퓨터로 데이터를 디지털화하고 내보냅니다. 데이터를 2D 이미지로 처리하고 이미지에서 파라미터 라이브러리를 추출합니다. 매개변수 라이브러리의 이미지를 시각화 프로그램으로 가져옵니다.
각 축에 관심 있는 매개변수를 할당하고 산점도로 표시할 데이터 세트를 선택합니다. 플롯의 각 그룹과 연결된 세포 이미지를 확인하여 추세를 식별합니다. 수동 게이팅을 사용하거나 필요에 따라 추가 분석을 위해 추가 데이터 세트를 표시합니다.
ATOM은 인간 세포와 식물성 플랑크톤의 고대비 단세포 이미지를 획득하는 데 사용되었습니다. 액포(vacuoles), 피레노이드(pyrenoids), 편모(flagella)와 같은 특징적인 세포 구조는 식물성 플랑크톤 이미지에서 볼 수 있습니다. 세포 크기 및 원형도와 같은 매개변수는 세포 분석을 위해 세포를 분류하기 위해 ATOM 이미지에서 결정되었습니다.
분류 결과를 2D 산점도로 표시할 수 있습니다. 여기서 부피 대 원형도는 노란색으로 표시된 MCF7과 빨간색으로 표시된 PBMC에 대해 표시되었습니다. MCF7에 대해 두 개의 클러스터가 관찰되었습니다.
개별 데이터 포인트에 해당하는 고대비 이미지를 식별함으로써 하단 클러스터가 세포 조각 및 파편에 해당하는 것으로 밝혀졌습니다. 이미징 시스템을 완전히 익히면 제대로 수행된다면 2-3시간 내에 설정할 수 있습니다. 이미징 절차는 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다.
레이저 소스와 레이저 빔 정렬로 작업하는 동안 눈 안전에 특별한 주의를 기울이는 것을 잊지 마십시오. 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 최적의 이미징 품질을 보장하기 위해 전체 이미징 시스템 설정 과정에서 광학 빔 정렬을 모니터링해야 합니다.
이 기술은 질병 진행 중에 희귀하거나 명백한 세포의 검출 및 정량화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 크고 이질적인 세포 집단 내에서 세포 유형 분류에도 적용할 수 있습니다. 이 기법은 이미징 세포분석의 처리량 한계를 극복하는 동시에 이미지 품질을 유지하고자 할 때 특히 유용합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 시스템 설정에서 이미징 절차에 이르기까지 ATOM을 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
이 프로토콜은 초고속 미세유체 흐름에서 라벨 없는 고 대조 단일 세포 이미징을 위한 비대칭 감지 타임 스트레치 광학 현미경 시스템의 구현을 설명합니다. ATOM 시스템은 초고속 이미지 캡처를 가능하게 하고 라벨이 없는 세포에 대한 이미지 대조를 향상시켜 복잡한 형태학적 분석을 가능하게 합니다.
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.