인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

이 임상 등급 분리 방법의 전반적인 목표는 다양한 신장 질환의 세포 치료제를 위한 인간 신장 혈관 주위 기질 세포(kPSC)를 분리하는 것입니다. 이 방법은 신장 질환의 중추 신경 치료 및 이식에 적합한 인간 kPSC와 같은 재생 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임상 적용이 가능하다는 점과 세포 치료 목적으로 충분한 수의 kPSC를 생성하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.

우리 실험실의 테크니션인 Ellen Lievers가 kPSCs의 기능 테스트 방법을 시연하겠습니다. 신장 세포 분리 절차를 시작하기 전, 멸균된 관류 트레이를 수직 방향으로 항온 수조에 연결하십시오. 관류 트레이가 온수로 가열되면, 항온 수조에 연결된 상태 그대로 트레이를 수평 방향으로 전환한 다음, L/S 25 튜브를 펌프에 장착하십시오.

튜브의 한쪽 끝에 배양용 핀셋을 배치하고 튜브가 트레이 바닥에 놓이도록 합니다. 폐쇄를 방지하기 위해 튜브 위에 멸균 거즈를 올리고, 튜브의 반대쪽 끝에 루어 커넥터를 연결한 다음, 트레이에 약 100 milliliters의 배지를 넣고 100 milliliters per minute의 펌프 속도로 L/S 25 튜브의 플러싱을 시작합니다. 신장 세포를 분리하려면, 이중 멸균 백에 들어있는 신장을 멸균 관류 트레이로 옮긴 후, 가위와 부드럽게 찢는 방식을 사용하여 신장 주변 지방 조직과 신장 피막을 제거합니다.

대동맥 패치에서 신동맥의 위치를 확인한 후, 보조 스파이크를 사용하여 신동맥에 캐뉼라를 삽입하고 멸균 타이랩으로 스파이크를 고정합니다. 펌프를 켠 상태에서 펌프 튜브 끝을 루어 커넥터에 연결합니다. 그리고 트레이에 있는 배지를 이용하여 100 milliliter per minute의 유속으로 신장을 세척합니다.

다음으로 콜라게나제 20 milliliters와 DNAse 2.5 milliliters를 관류 트레이에 추가하고, 효소가 신장을 소화시키도록 둡니다. 장기가 부드러워지고 관류액이 불투명해지기 시작할 때까지 가끔씩 손으로 장기를 부드럽게 돌려줍니다. 콜라게나제 소화 시간은 매우 중요하며, 시간이 너무 짧으면 세포 덩어리가 형성되고, 너무 길면 세포 사멸로 이어집니다. 효소 관류가 끝나면 세포 현탁액이 얻어질 때까지 신장을 부드럽게 마사지하고, 소화되지 않은 물질과 스파이크를 제거합니다.

정상 인간 혈청 50 milliliters를 세포 현탁액에 추가한 다음, 펌프의 유량을 낮게 설정하고 신장과 연결된 튜브를 여러 개의 50 milliliter 수집 튜브 위에 배치하여 세포 현탁액이 관류 트레이에서 수집 튜브로 배출되도록 합니다. 모든 세포가 수집되면 세포 현탁액을 원심 분리하고, 10% 정상 인간 혈청이 보충된 세척 배지로 펠렛을 2회 세척합니다. 2차 세척 후, 세포 펠렛과 동일한 부피의 세포 배양 배지로 펠렛을 재현탁합니다.

조잡한 신장 세포를 배양하려면, T 175 세포 배양 플라스크당 약 1mL의 세포 현탁액을 24mL의 alpha-MEM 5% 혈소판 용해물 세포 배양 배지에 추가하고, 플라스크를 37°C 및 5% CO2 조건에서 배양합니다. 2일 후 상층액과 세포 잔해를 제거하고, 25mL의 신선한 세포 배양 배지를 공급합니다. 세포가 합쳐지면(confluent), 표준 프로토콜에 따라 자기 세포 분리법으로 NG2 양성 분획을 분리합니다.

그런 다음 적절한 크기의 세포 배양 플라스크에 cm²당 4 × 10³개의 NG2 양성 세포를 분주하고, 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 90~100% 밀도(confluency)에 도달하면 상층액을 수집하고 부착된 세포를 PBS로 2회 세척합니다. 플라스크 크기에 맞는 적절한 부피의 trypsin으로 세포를 탈착시킨 후, 5분 뒤에 보관해 둔 상층액을 넣어 반응을 중단시킵니다.

세포를 부드럽게 재현탁한 후, 원심분리를 위해 적절한 크기의 원추형 튜브로 세포 현탁액을 옮기고, cm²당 4×10³ cells 밀도로 세포를 다시 도말합니다. NG2 농축 후 때때로 세포 증식이 중단되거나 3D 구조로 성장하기 시작할 수 있습니다. 이는 세포를 트립신 처리하여 다시 도말함으로써 해결할 수 있습니다.

4~5회 계대 배양 후, kPSC를 6-웰 플레이트에 웰당 2 mL 배지당 2×10⁵ cells 농도로 파종하고, 별도의 6-웰 플레이트에는 근위 세뇨관 상피세포 5×10⁵개를 웰당 2 mL의 근위 세뇨관 상피세포 배지에 파종합니다. 두 플레이트를 모두 세포 배양 인큐베이터에 48시간 동안 배양한 후, 배양 종료 시점에 kPSC 세포 상층액을 수확합니다. 그다음 근위 세뇨관 상피세포 상층액을 제거하고 노란색 피펫 팁을 사용하여 각 웰 바닥의 세포 단층에 스크래치를 냅니다. 스크래치된 세포를 PBS로 세척하고, 신장 혈관 기질 세포 배양물에서 얻은 조건 배지를 첨가합니다.

그 후, 시간에 따른 폐쇄 백분율을 평가하기 위해 도립 명시야 현미경을 사용하여 동일한 표시 위치에서 4, 8, 12, 24시간에 스크래치 이미지를 촬영합니다. 신장 혈관 주위 기질 세포는 플라스틱 부착성 및 방추형 세포로, 기질 및 혈관 주위 세포 마커에는 양성을 보이며 CD31, CD34, CD45, HLA-DR 마커에는 음성을 보입니다. 일반적으로 신장 혈관 주위 기질 세포의 균질한 집단은 계대 배양 4회차에 도달하며, 세포는 계대 배양 9~10회차 무렵에 노화 단계에 이릅니다.

kPSC의 기능적 능력을 평가하기 위한 이 대표적인 상처 치유 분석(wound scratch assay)에서, 신장 혈관주위 기질세포 배양액으로 처리한 조건화 배지를 첨가했을 때 상처 폐쇄 속도가 대조군 배지로 배양한 웰보다 유의미하게 빨랐습니다. 일차 분리 기술을 숙달하면 약 2시간이 소요되며, 균일한 kPSC 군집을 생성하는 데는 1~2개월이 걸립니다. 이 절차를 수행할 때, 신장이 부드러워지고 액체가 덜 투명해지는 즉시 콜라게나제 처리를 중단하는 것이 중요합니다.

여기에 시연된 절차 외에도, 이러한 기술은 다른 고형 장기에서 혈관주위 기질 세포를 분리하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 기술로 분리된 kPSC는 다양한 신장 질환 및 이식 모델에서 이들 세포의 재생 가능성을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 임상 등급의 방식으로 kPSC를 분리하고 배양할 수 있을 것입니다.

인체 유래 물질을 다루는 것은 바이러스 전염의 위험이 따르므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 HIV, B형 간염, C형 간염 검사와 같은 예방 조치를 취하십시오.