Name: 인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 임상 등급 신장 혈관 주위 기질 세포(kPSC) 격리 및 배양 방법을 통한 재생 의학 연구. 이 기술은 신장 질환 세포 치료를 위한 충분한 세포 수 확보에 활용됩니다.

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이 연구는 부여 계약 번호 305436에서 유럽 공동체의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금 지원을 받은 스텔라.

유럽 컨소시엄(STELLAR)의 지역 의료 윤리 위원회와 윤리 자문 위원회는 주로 외과적 이유로 폐기된 인간 이식 등급 신장의 연구 및 수집을 승인했습니다. 모든 신장에 대해 연구 동의가 이루어졌다.
1. 세포 배양을 위한 준비
<ol>
	<li>혈소판 용해물 풀을 준비합니다.
	<ol>
		<li>유통기한이 2일 미만인 혈소판은 -80°C에서 사용할 때까지(최대 1년 동안) 보관하십시오. 
		참고: 혈소판은 원래 상업 공급업체에서 공급받았습니다. 지방 혈액 은행에서 배급한 병원의 잉여 물자를 입수하였다.</li>
		<li>4°C에서 최소 5명의 기증자(바람직하게는 10명)의 혈소판을 해동합니다.</li>
		<li>큰 멸균 병에 혈소판을 모으고 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 4°C에서 1,960 x g에서 10분 동안 회전합니다. 
		참고: 혈소판의 양은 기증자의 수와 기증자당 병원 잉여 물질의 양에 따라 다릅니다.</li>
		<li>50mL 주사기의 배럴을 통해 혈액 백(50mL/백)에 상층액을 피펫팅합니다. -80 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포 배양 배지의 제조.
	<ol>
		<li>혈소판 용해물 한 봉지를 37°C의 수조에서 해동합니다.</li>
		<li>최소 필수 배지 - 알파 변형(alphaMEM) 1L(즉, 2병), 200mM 글루타민 5mL, 페니실린(5,000 U/mL)/스트렙토마이신(5,000 μg/mL) 20mL(펜/연쇄상구균)를 백에 추가합니다.</li>
		<li>37 °C에서 3 시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>가방이 평평한 표면에 놓여 있을 때 가방을 부드럽게 두드려 겔 제거를 위해 가방을 흔듭니다.</li>
		<li>멸균 50mL 주사기를 사용하여 수혈 시스템의 필터를 통해 용해물을 당겨 5% 혈소판 용해물 배지를 여과합니다.</li>
		<li>50mL 튜브에 배지를 분취하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 
		참고: 혈소판 용해물의 모든 새로운 배치는 세포 배양에서 테스트되고 두 배치에서 포화 상태로 관심 세포(bmMSC 또는 kPSC)를 성장시켜 이전 배치와 비교합니다. 세포 수 및 생존율에서 새로운 배치에서 성장한 kPSC 또는 bmMC는 10% 이상 차이가 없어야 하며 유세포분석으로 분석한 CD73, CD90, CD105 및 CD31, CD34 및 CD45의 마커 발현은 차이가 없어야 합니다. 세포 배양 방법은 프로토콜의 섹션 6(kPSC 배양)에 설명되어 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 세포 수확을 위한 준비
<ol>
	<li>솔루션 준비.
	<ol>
		<li>Dulbecco의 DMEM(Minimum Essential Medium)-F12 500mL(1병)에 10mL의 펜/연쇄상구균을 첨가하여 일반 배지를 준비합니다.</li>
		<li>DMEM-F12 1병에 Normal Human Serum(NHS) 50mL와 펜/연쇄상구균 10mL를 첨가하여 세척 매체를 준비합니다.</li>
		<li>160mL 위스콘신 대학교 용액에 2.9mL 1M, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 1.2mL NaHCO, 3 2.5%[w/v] 및 160μL CaCl2(1M)를 첨가하여 효소-스톡 완충액을 준비합니다.</li>
		<li>>2,000 U/bottle 콜라겐분해효소가 들어있는 GMP 등급 콜라겐분해효소 병에 20mL의 효소 스톡 완충액을 천천히 첨가하여 콜라겐분해효소 용액을 준비합니다. 4°C에서 약 40분 동안 녹입니다. 녹는 동안 여러 번 부드럽게 흔듭니다.</li>
		<li>45mL NHS에 5mL 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 동결 매체를 준비합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>관류 트레이의 준비 (그림 1A).
	<ol>
		<li>플로우 캐빈을 청소하고 수술용 커튼으로 덮습니다. 수조를 약 40 - 45 °C로 가열하여 관류 트레이를 37 °C로 가열합니다. 수술 가운과 수술용 장갑을 착용합니다.</li>
		<li>멸균된 관류 트레이를 수조에 연결하여 따뜻한 물로 관류 트레이를 예열합니다. 관류 트레이를 수직 위치에 있는 것부터 시작하여 관류 트레이에 공기가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 관류 트레이로 공기가 주입되는 것을 방지하기 위해 수조에 물을 더 추가합니다.</li>
		<li>LS25 튜브를 펌프에 놓습니다. 튜브의 양쪽 멸균 끝을 흐름 캐비닛에 그대로 둡니다. Kocher의 집게를 튜브의 한쪽 끝에 놓고 관류 트레이 바닥에 놓으십시오. 막힘을 방지하기 위해 튜브 위에 멸균 거즈를 놓습니다. 다른 튜브 끝에 Luer 커넥터를 부착합니다.</li>
		<li>약 100mL의 일반 배지를 관류 트레이에 추가하고 100mL/분의 펌프 속도로 튜브를 세척하기 시작합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 신장 세포 분리
<ol>
	<li>신장의 준비.
	<ol>
		<li>이중 멸균 백에서 신장을 제거하고 멸균 관류 트레이(그림 1B)에 놓습니다. 가위로 신장 주위 지방 조직과 신장 캡슐을 제거하고 부드럽게 찢어내고(그림 1C) 그림 1D.</li>
		<li>액세서리 스파이크로 신장 동맥을 캐뉼레이션하고, 멸균된 타이 립으로 고정하고, 펌프가 켜져 있는 동안 Luer 커넥터로 펌프 튜브 끝에 부착합니다. 튜브가 완전히 채워지지 않은 경우 먼저 펌프를 시작하여 트레이와 플러시 튜브에 더 많은 매체를 추가합니다(그림 1E - F). 100mL/분의 유량으로 펌프를 통해 일반 배지로 신장을 세척합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>콜라겐 분해 효소 치료 및 신장 세포 분리.
	<ol>
		<li>콜라겐 분해 효소(20 mL, >2,000 U) 및 DNase(2.5 mL, 1 mg/mL)를 관류 트레이(그림 1G)에 추가합니다. 때때로 손으로 신장을 부드럽게 돌립니다. 신장이 부드러워지고 관류 액체의 투명도가 낮아질 때까지 기다립니다(약 30 - 40분).</li>
		<li>세포 현탁액이 얻어질 때까지(그림 1H) 신장을 부드럽게 마사지합니다(그림 1I). 소화되지 않은 물질과 신장 동맥의 스파이크를 제거합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신장 세포의 세척 및 수집.
	<ol>
		<li>세포 현탁액에 NHS 50mL를 추가합니다. 펌프를 낮은 유량으로 놓고 신장에 먼저 연결된 튜브를 50mL 튜브 위에 배치하여 관류 트레이에서 세포 현탁액을 배출합니다(그림 1J).</li>
		<li>300 x g에서 4°C에서 7분간 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 10% NHS가 함유된 세척 매체로 펠릿을 세척하고 다시 300 x g에서 7분 동안 원심분리합니다. 세탁을 한 번 더 반복합니다. 세포 펠릿의 부피를 측정하고 동일한 부피의 세포 배양 배지를 첨가합니다.</li>
		<li>세포 현탁액에 동결 배지를 1:1로 첨가하여 여기에서 세포를 동결 보존하고 표준 프로토콜에 따라 극저온 바이알에 보관하거나 세포를 계속 배양합니다(섹션 4). 
		참고: 세포 현탁액에는 세포 덩어리가 포함되어 있으며 단일 세포를 얻기 위해 추가 단계가 필요하며, 이로 인해 세포 사멸이 증가합니다. 따라서 세포는 현탁 상태로 유지되며 이 단계에서 계수되지 않습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 조잡한 신장 세포의 세포 배양
<ol>
	<li>T175 세포 배양 플라스크(그림 1 K)에서 alphaMEM 5% 혈소판 용해물(세포 배양 배지) 24mL에 약 1mL의 세포 현탁액을 추가하고 37°C, 5% CO2에서 배양합니다. 부착 세포에서 2일 후 배지 및 세포 파편을 제거하고 25mL의 세포 배양 배지로 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>무균 기술을 사용하여 배지(12.5mL)의 절반을 제거하고 새 배지(12.5mL)를 추가하여 일주일에 두 번 배양 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>합류 할 때까지 문화 (보통 5-7 d) (그림 1L). 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척한 후 37°C에서 5분 동안 각 T175 플라스크에 5mL 트립신을 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 배양 배지에서 세척하고 490 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.</li>
</ol>
5. 자기 세포 분리에 의한 NG2의 세포 농축 (그림 1M)
<ol>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 세포 분리 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>트립신화된 kPSC를 10mL 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 490 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포를 300μL 세포 분리 완충액에 재현탁합니다.</li>
	<li>100 μL FcR 차단 reagen/5 x 107 cells를 추가하고, 5 x 107 cells당 100 μL anti-melanoma(NG2) bead를 추가하고, 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.제조업체의 프로토콜에 따라 NG2 양성 분획을 분리합니다. 10mL의 배지 및 원심분리 세포를 490 x g에서 5분 동안 추가합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 Bürker 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 배양 플라스크(약 4 x 10,3 cells/cm2)에 세포를 파종하고 배양합니다. 
	참고: T25 플라스크에 <250,000, T75 플라스크에 250,000 - 500,000, T175 플라스크에 700,000 - 800,000 농도로 세포를 파종합니다. 자기 세포 농축 후 약 1 - 2%의 양성 분율이 분리됩니다. 그러나 이 단계는 세포 분류가 아닌 세포 농축이므로 배양에 다른 세포 유형이 존재하게 됩니다(그림 1N). 여러 계대(보통 약 4 - 5) 후에는 동질적인 kPSC 개체군만 존재합니다(그림 1P).</li>
</ol>
6. kPSC의 문화
<ol>
	<li>배지의 절반을 제거하여 일주일에 두 번 배지를 새로 고치고 갓 해동한 배양 배지(그림 1N). 로 교체하십시오.
	참고: kPSC는 배지의 절반만 재생될 때 더 생존 가능하고 증식하는 경향이 있습니다.</li>
	<li>kPSCs. 의 패시징
	참고: 90 - 100% 포화도에서 또는 3D 구조가 나타날 때(그림 1O 참조) 또는 일주일 이상 세포 성장이 없었을 때 kPSC를 통과시킵니다. 후자의 두 가지는 특히 세포 농축 후 초기 계대에서 발생할 수 있습니다. 이 경우, 계대 배양 후 세포는 일반적으로 단층 배양에서 다시 성장하기 시작합니다(그림 1P).
	<ol>
		<li>90 - 100% confluent cell에서 배지를 제거합니다(나중에 사용할 수 있도록 배지를 보관). PBS로 플라스크를 두 번 세척합니다(T25 1mL, T75 5mL, T175 10mL). 트립신(T25에서 0.5mL, T75에서 2mL, T175에서 5mL)을 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 플라스크에 기존 배지를 추가하고 부드럽게 재현탁합니다.</li>
		<li>15 또는 50 mL 튜브(용량에 따라 다름)로 옮기고 490 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 생존 가능한 세포와 플레이트<를 T25의 경우 0,000 - 500,000, T75의 경우 250,000 - 500,000 또는 T175의 경우 700,000 - 800,000(약 4 x 103 cells/cm2)으로 계산합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5단계 또는 6단계에서 kPSC를 테스트합니다(예: 스크래치 분석, 섹션 7). 
	참고: 표준 프로토콜을 사용하여 유세포 분석으로 전파된 세포를 특성화합니다. NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC의 마커 발현은 모두 양성이어야 하며 CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR은 음성이어야 합니다. 임상 미생물학 실험실의 표준 프로토콜에 따라 배양 배지에서 마이코플라스마, 박테리아 및 곰팡이를 테스트합니다. 신장 상피 상처 스크래치 분석에서 kPSC를 기능적으로 테스트합니다. 실험은 일반적으로 계대 6-8 사이의 상처 치유 능력을 가진 멸균 유세포 분석으로 확인된 균질한 kPSC 집단을 사용하여 수행됩니다.</li>
	<li>표준 프로토콜을 사용하여 0.5mL 세포 현탁액(배양 배지 mL당 200만 개 세포)에 0.5mL 동결 보존 배지를 추가하여 kPSC를 동결 보존합니다. 
	참고: 해동 후 kPSC를 더 높은 밀도(T175의 106개 세포)로 파종합니다.</li>
</ol>
7. kPSC의 기능 테스트: 신장 상피 상처 스크래치 분석
<ol>
	<li>2mL 배양 배지에서 200,000 cells/well의 밀도로 6-well 플레이트에서 kPSC를 배양합니다. 37 ° C에서 48 시간 배양 후 5 % CO2 상등액을 수집한다. 이것이 조건화된 매체입니다.</li>
	<li> 인슐린(5mg/mL), 트랜스페린(5mg/mL), 셀레늄(5ng/mL), 하이드로코르티손(36ng/mL), 트리요오드티리닌(40pg/mL), 표피 성장 인자(10ng/mL) 및 펜/연쇄상구균이 보충된 DMEM-F12의 1:1 비율로 구성된 근위 세뇨관 상피 세포(PTEC) 배지 2mL에 HK-2(근위 세뇨관 상피 세포)17을 파종합니다. 6-well 세포 배양 플레이트에서 well당 500,000개의 세포 밀도.</li>
	<li>37 °C에서 48 시간 동안 배양, 5 % CO2. HK-2s의 세포 배양 배지를 제거하고 노란색 피펫 끝으로 웰의 상단에서 하단으로 긁힌 자국을 만들어 HK-2s의 단층에 긁힌 자국을 만듭니다. HK-2s를 PBS로 세척하고 kPSC의 조절된 배지 또는 대조 배지를 추가합니다. 플레이트 바닥에 이미징할 영역을 표시합니다. 
	참고: HK-2는 합류해야 합니다. 우물당 두 영역을 이미지화합니다.</li>
	<li>4, 8, 12 및 24시간 동안 도립 명시야 현미경으로 동일한 표시된 위치에서 스크래치를 이미지화합니다.</li>
	<li>다각형 선택 도구를 사용하여 Image J의 스크래치 영역을 측정하여 닫힌 비율을 확인합니다.</li>
</ol>

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</ol>

D.G.L., M.A.E., 및 T.J.R.는이 연구에 대 한 특허 출원과 함께 연결 되어 있습니다. 다른 저자는 공개 없다.

혈관 주위 세포는 많은 다른 인간 단단한 장기, 췌 장, 지방, 연골, 신장9,,1516등에서 분리 되었습니다. 그러나 대부분의 방법은,, 기반으로 조직, 해 부 되 고 이후에 소화 효소 치료의 작은 샘플 합니다. 또한, 이것은 일반적으로 수행 되지 않습니다 임상 학년 제품. 이것은 이러한 전략 직접 임상 번역을 위해 보다 적게 적당 한 임상 등급 셀의 대량은 필요 합니다.
여기 우리는 관류 임상 등급 효소와 재료에 따라 전체 기관에 대 한 인간 kPSCs의 소설 격리 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 현재 우리의 센터18에 임상 응용 프로그램에 대 한 사용에에서 임상 독도 Langerhans 격리 프로토콜에서 적응.
이것은 첫 번째 임상 등급 방법 kPSCs의 대량을 달성 될 수 있다입니다. 셀 수익률의 변동성은 크게 기증자 의존. 그러나, 이론적으로, 우리는 현재 3 명의 다른 기증자의 조 세포 현 탁 액의 일부분에서 얻을 셀 생산량 추정 때 기증자 당 1012 kPSCs x 2.7의 평균 수익률 달성 될 수 있습니다. MSC 치료는 일반적으로 1-2 106 셀/kg 몸 무게4x 2 셀 혼합 이루어져 있다로이 핸드폰 번호 allogenic 치료의 여러 환자에 대 한 충분 한 있습니다.
분리 절차의 하나의 중요 한 단계는 콜라 소화의 기간입니다. 소화 기간이 너무 짧은 때 문화에 더 있을 것 이다 조직의 큰 덩어리 유지 됩니다. 관류 기간이 너무 긴 경우 증가 세포 죽음을 관찰할 수 있습니다. 따라서, 최대한 빨리 신장 부드럽고 덜 투명 한 체액 되기 시작, 신장 부드럽게 마사지 한다 고 콜라 치료를 중지 합니다.
또 다른 중요 한 단계 NG2 셀 농축 후 셀의 문화입니다. 가끔 NG2 셀 농축 후 혈관 주위 세포 증식 또는 3 차원 구조에 성장 하기 시작 시작 되지 않습니다. 이 경우 셀 trypsinized을 다시 시드해야 하는 경우 셀 것 이다 일반적으로 단층 문화에서 성장 시작 됩니다.
자료를 시작으로 인간 이식 학년 신장 수술 이유로 주로 삭제 사용 되었다. 이러한 주요 섬유 증 없이 기능적인 기관 이다입니다. 우리는 이것이 비교적 드문이 제한 있을 인정 및 기관 소스를 얻기 어렵다. Explanted 신장 있을 다른 소스; 그러나, 신장 explantation의 이유에 따라 이러한 신장에 더 많은 섬유 증 및 따라서 myofibroblasts, 포함 될 수 있습니다 그리고 그러므로 주의 해야 myofibroblasts 수 있습니다 격리 하 고 혈관 주위 세포 대신 교양.
kPSCs 절연이 프로토콜 표시와 함께 신장 상피와 유기 전형적 속성 상처 치유 용량15, 신장 질병에서 kPSCs와 세포 치료 하 고 이식 미래 응용 될 것 이다. 이 목적을 위해 셀/제품 배달의 여러 전략 있습니다. 첫 번째 전략은 bmMSC 임상 연구에서 현재 사용 되는 kPSCs의 IV 주입 이다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램은 kPSCs 또는 kPSC 배설 요소 이식 하기 전에 기계 관류에의 사용 이다. 이 방법으로 이식 후 향상 된 신장 기능을 이어질 수 explanted 신장의 품질 향상 됩니다. 두 전략에 대 한 kPSCs는 추가 임상 목적을 위해 탐구 하는 재미 있는 새로운 셀 소스입니다.

Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 면역 modulatory 세포는 골 수에서 원래 고립 되었다. 그들은 그들의 스핀 들 모양의 형태, 지방, 뼈와 연골, 그리고 플라스틱 부착으로 차별 하는 능력에 의해 특징. MSCs stromal 마커 CD73, CD90, CD105 동안 마커 CD31, CD451,2,3에 대 한 부정적인 표현 한다. MSCs는 그들의 조직의 항상성 및 immunomodulatory 용량 세포 치료에 대 한 유망한 후보. bmMSCs는 현재 신장 질환과 신장 이식으로4다른 검토를 포함 하 여 여러 가지 질병에 대 한 임상 실험에서 공부 되 고 있습니다.
이전 그것은 혈관 주위 지방 조직을 포함 하 여 여러 다른 단단한 장기에서 세포, 태 반 및 골격 근육 MSCs9특성을 공유 표시 했다. 그러나,이 세포는 또한 조직 관련 기능 organotypic 수리10귀 착될 수 있는 전시. 예를 들어 인간의 심근 혈관 주위 세포 hypoxia 후 신생 응답을 자극 하 고 혈관 주위 세포가 다른 조직에서 고립이 후보11보여주지 않았다 하는 동안, cardiomyocytes에 분화.
혈관 주위 stromal 세포 마우스12,,1314 및 인간의 신장15,16으로부터 격리 될 수 있습니다. 우리는 광범위 하 게 kPSCs를 특징 하 고 bmMSCs에 비해. 우리는 kPSCs, bmMSCs, 유사한 면역 능력 있고, 혈관 신경 얼 기 형성을 지원할 수 있습니다 발견. 그러나, 조직 세포 유형 HoxD10 및 HoxD11 nephrogenic 전사 인자를 포함 하 여 organotypic transcriptional 식 서명 했다 kPSCs로 구체적인 차이가 있습니다. kPSCs, bmMSCs, 달리 myofibroblast 변환 후 TGF-β와 자극을 받아야 하지 않았다 고 adipocytes에 차별화 하지 못했습니다. 또한, kPSCs는 신장 관 상피 상처 스크래치 분석 결과, bmMSCs와 관찰 하지 현상은 상피 무결성 가속. 이 향상 된 상처 복구 hepatocyte 성장 인자 자료를 통해 중재 했다. 또한, kPSCs ameliorated 급성 신장 상해15의 쥐 모델에서 신장 상해. 따라서, kPSCs 우수한 신장 수리 능력을가지고 것과 신장 질환의 세포 치료에 대 한 흥미로운 새로운 소스.
세포 치료 목적을 위해 kPSCs를 사용할 수 있어야 kPSCs 임상 등급 효소와 프로토콜 임상 등급 방식으로 격리 한다. 또한, 1 기증자에 게 서 kPSCs와 여러 환자를 치료 수 있도록, 충분 한 셀 숫자를 얻은 합니다. 여기 우리가 임상 세포 치료에 사용 되는 셀의 충분 한 숫자 저조한 전체 이식 학년 신장에서 kPSCs의 임상 등급 격리 절차 자세히 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Baxter bags</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈소판</td><td>Sanquin</td><td></td><td>병원 잉여 재료 만료 2d 미만 사용</td></tr> 혈<tr><td>소판 용해물</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>일회용 멸균 병</td><td>Corning</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>500 mL PP 원심 분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM 미디엄</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>테르모 피셔</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>수혈 시스템</td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>life technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Serum (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7.5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Bridge to life</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 NB1 GMP 등급</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>외과용 커튼</td><td>3M 네덜란드</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Metrohm</td><td>X007528300</td><td></td></tr><tr><td>펌프 헤드</td><td>MetroHM</td><td>X077202600</td><td></td></tr><tr><td>관류 트레이</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>LS25 masterflex 튜브</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>액세서리 스파이크</td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>pulmozyme</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 25 cm2</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 75 cm2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 175 cm2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>안티 흑색종 비드 (NG2)</td> <td>miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 70 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 자석</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555821</tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555485</tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550315</tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R& D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555596</tr><tr><td>HLA ABC APC BD</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>555555</tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>559866</tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555516</tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550257</tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555445</tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>R& D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345815</tr><tr><td>마우스 IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345816</tr><tr><td>마우스 IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345818</tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555743</tr><tr><td>염소 안티 마우스 PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>아 지드 머</td><td>크</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 햄 〈 s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (인슐린, 트랜스페린, 셀레늄)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>트리요오드티리닌</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGF)</td><td>시그마</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>불멸의 인간 신장 PTEC (HK2)</td><td></td><td></td><td>M. Ryan의 제공, 유니버시티 칼리지 더블린</td></tr></tbody></table>

인간의 신장 혈관 주위 stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 조직 항상성 및 면역 modulatory 세포 신장 질환과 이식에 유익한 효과 표시. 혈관 주위 Stromal 세포 (PSCs) 골 MSCs (bmMSCs)와 특성을 공유. 그러나, 그들은 또한 소유, 대부분 지역 각 인, 조직 관련 속성 및 지역 조직의 항상성에서 역할. 이 조직 특이성 또한 인간의 신장 내 조직 특정 복구 될 수 있습니다. 우리는 이전 인간의 신장 Psc (kPSCs)는 신장 상피 상처 치유 bmMSCs이이 잠재력 하지 않은 반면 강화 보였다. 또한, kPSCs는 신장 상해 비보개량 수 있습니다. 따라서, kPSCs는 특히 신장 질환과 신장 이식에 대 한 세포 치료에 대 한 재미 있는 소스를 구성합니다. 여기 우리가 인간의 신장 신장 동맥 및 혈관 주위 마커 NG2 농축을 통해 소화 효소의 전체 장기 관류에 따라 이식-학년에서 kPSCs에 대 한 자세한 고립과 문화 메서드를 보여줍니다. 이 방법에서는, 큰 셀 수량 얻어질 수 있다 세포 치료에 적합 합니다.

임상 등급 kPSCs 절연 메서드는 그림 1에 요약 됩니다. 조 신장 세포 콜라 관류에 의해 인간의 이식 학년 신장 으로부터 격리 됩니다. 결과 셀 서 스 펜 션 5% 혈소판 lysates에 합칠 때까지 양식입니다. 다음 혈관 주위 stromal 세포 분수 NG2 식에 따라 격리 됩니다.
kPSCs 플라스틱 부착 스핀 들 모양의 셀 (그림 2A) 고 CD31, CD34, CD45 그리고 HLA-DR (그림 2B)에 대 한 부정적인 동안 stromal 마커 CD73, CD90, CD105 및 혈관 주위 마커 NG2, PDGFR-B와 CD146에 대 한 긍정적인. 일반적으로, kPSCs의 균질 인구 통로 4에 도달 될 수 있다 그리고 kPSCs 도달 통로 9-10 (그림 2C) 주위 노화. 우리는 통로 5-8 사이 실험을 수행 하 따라서 조언 한다.
격리 된 kPSCs의 기능 능력을 평가, 우리 수행 체 외에 신장 상피 상처 스크래치 분석 결과 kPSCs의 모든 새로운 배치에 우리가 이전 kPSCs의 바른된 매체 상피 상처 치유이 스크래치 시험15가속화할 수 있습니다 보여준. KPSC 조건된 매체 alphaMEM 5% 혈소판 lysates 48 h에 대 한 kPSCs를 경작 하 고는 상쾌한 수집 하 여 이루어집니다. 다음, 불멸 하 게 인간의 신장 근 위 관 상피 세포 (홍콩-2)17 합칠까지 교양 하 고 스크래치 상처를 만든 다음. 다음 중 kPSCs 또는 제어 매체의 바른된 매체 우물에 추가 되 고 상처의 치유의 속도 측정. KPSCs의 조절된 중 추가 될 때 상처는 훨씬 빠른 (그림 2D) 닫습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
그림 1 : 인간의의 임상 등급 격리 방법 kPSCs. 이식 학년 신장 cannulated 신장 동맥 (A-G)을 통해 콜라와 함께 끼얹는다 고 결과 세포 현 탁 액을 씻어 그리고 중 cryopreserved 또는 문화 (H-K)에 넣어. 셀에 도달 confluency (L), 후 셀 농축은 NG2 수행 (M). 셀 때 하나 confluent, trypsinized는 확산 또는 3D 구조 (N-P)를 표시 하는 때 중단 했다. KPSCs에 대 한 릴리스 조건 있으며 불 임, 마커 식 관 상피 상처 치유 (Q)을 강화 하는 기능. 화살표:의 신장 동맥 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
그림 2: 특성의 인간 kPSCs. ) kPSCs는 스핀 들-모양, 플라스틱 부착 세포. B) kPSCs는 엽 마커 CD73, CD90, CD105, CD31 CD34, CD45 부정 하면서 혈관 주위 마커 NG2, PDGFR-β 및 CD146에 대 한 긍정적 이다. kPSCs 익스프레스 MHC 클래스 I (HLA-ABC) 하지만 하지 클래스 II (HLA-DR). C) cytometry에서 3 명의 다른 kPSC 기증자의 성장 특성 확인 (통로 4)에 균질 NG2 긍정적인 인구. kPSCs 노화 통로 9-10 주위에 도달합니다. D) kPSCs 신장 상피 수리 상처 스크래치 분석 결과에서 향상 시킬 수 있습니다. 제어 매체 및 t kPSC 조절 매체의 대표 이미지 = 0, 4, 8 및 12 h 표시 됩니다. A에서 눈금 막대) = 200 µ m, d에서) = 100 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

이 임상 등급 분리 방법의 전반적인 목표는 다양한 신장 질환의 세포 치료제를 위한 인간 신장 혈관 주위 기질 세포(kPSC)를 분리하는 것입니다. 이 방법은 신장 질환의 중추 신경 치료 및 이식에 적합한 인간 kPSC와 같은 재생 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임상 적용이 가능하다는 점과 세포 치료 목적으로 충분한 수의 kPSC를 생성하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.우리 실험실의 테크니션인 Ellen Lievers가 kPSCs의 기능 테스트 방법을 시연하겠습니다. 신장 세포 분리 절차를 시작하기 전, 멸균된 관류 트레이를 수직 방향으로 항온 수조에 연결하십시오. 관류 트레이가 온수로 가열되면, 항온 수조에 연결된 상태 그대로 트레이를 수평 방향으로 전환한 다음, L/S 25 튜브를 펌프에 장착하십시오.튜브의 한쪽 끝에 배양용 핀셋을 배치하고 튜브가 트레이 바닥에 놓이도록 합니다. 폐쇄를 방지하기 위해 튜브 위에 멸균 거즈를 올리고, 튜브의 반대쪽 끝에 루어 커넥터를 연결한 다음, 트레이에 약 100 milliliters의 배지를 넣고 100 milliliters per minute의 펌프 속도로 L/S 25 튜브의 플러싱을 시작합니다. 신장 세포를 분리하려면, 이중 멸균 백에 들어있는 신장을 멸균 관류 트레이로 옮긴 후, 가위와 부드럽게 찢는 방식을 사용하여 신장 주변 지방 조직과 신장 피막을 제거합니다.대동맥 패치에서 신동맥의 위치를 확인한 후, 보조 스파이크를 사용하여 신동맥에 캐뉼라를 삽입하고 멸균 타이랩으로 스파이크를 고정합니다. 펌프를 켠 상태에서 펌프 튜브 끝을 루어 커넥터에 연결합니다. 그리고 트레이에 있는 배지를 이용하여 100 milliliter per minute의 유속으로 신장을 세척합니다.다음으로 콜라게나제 20 milliliters와 DNAse 2.5 milliliters를 관류 트레이에 추가하고, 효소가 신장을 소화시키도록 둡니다. 장기가 부드러워지고 관류액이 불투명해지기 시작할 때까지 가끔씩 손으로 장기를 부드럽게 돌려줍니다. 콜라게나제 소화 시간은 매우 중요하며, 시간이 너무 짧으면 세포 덩어리가 형성되고, 너무 길면 세포 사멸로 이어집니다. 효소 관류가 끝나면 세포 현탁액이 얻어질 때까지 신장을 부드럽게 마사지하고, 소화되지 않은 물질과 스파이크를 제거합니다.정상 인간 혈청 50 milliliters를 세포 현탁액에 추가한 다음, 펌프의 유량을 낮게 설정하고 신장과 연결된 튜브를 여러 개의 50 milliliter 수집 튜브 위에 배치하여 세포 현탁액이 관류 트레이에서 수집 튜브로 배출되도록 합니다. 모든 세포가 수집되면 세포 현탁액을 원심 분리하고, 10% 정상 인간 혈청이 보충된 세척 배지로 펠렛을 2회 세척합니다. 2차 세척 후, 세포 펠렛과 동일한 부피의 세포 배양 배지로 펠렛을 재현탁합니다.조잡한 신장 세포를 배양하려면, T 175 세포 배양 플라스크당 약 1mL의 세포 현탁액을 24mL의 alpha-MEM 5% 혈소판 용해물 세포 배양 배지에 추가하고, 플라스크를 37°C 및 5% CO2 조건에서 배양합니다. 2일 후 상층액과 세포 잔해를 제거하고, 25mL의 신선한 세포 배양 배지를 공급합니다. 세포가 합쳐지면(confluent), 표준 프로토콜에 따라 자기 세포 분리법으로 NG2 양성 분획을 분리합니다.그런 다음 적절한 크기의 세포 배양 플라스크에 cm²당 4 × 10³개의 NG2 양성 세포를 분주하고, 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 90~100% 밀도(confluency)에 도달하면 상층액을 수집하고 부착된 세포를 PBS로 2회 세척합니다. 플라스크 크기에 맞는 적절한 부피의 trypsin으로 세포를 탈착시킨 후, 5분 뒤에 보관해 둔 상층액을 넣어 반응을 중단시킵니다.세포를 부드럽게 재현탁한 후, 원심분리를 위해 적절한 크기의 원추형 튜브로 세포 현탁액을 옮기고, cm²당 4×10³ cells 밀도로 세포를 다시 도말합니다. NG2 농축 후 때때로 세포 증식이 중단되거나 3D 구조로 성장하기 시작할 수 있습니다. 이는 세포를 트립신 처리하여 다시 도말함으로써 해결할 수 있습니다.4~5회 계대 배양 후, kPSC를 6-웰 플레이트에 웰당 2 mL 배지당 2×10⁵ cells 농도로 파종하고, 별도의 6-웰 플레이트에는 근위 세뇨관 상피세포 5×10⁵개를 웰당 2 mL의 근위 세뇨관 상피세포 배지에 파종합니다. 두 플레이트를 모두 세포 배양 인큐베이터에 48시간 동안 배양한 후, 배양 종료 시점에 kPSC 세포 상층액을 수확합니다. 그다음 근위 세뇨관 상피세포 상층액을 제거하고 노란색 피펫 팁을 사용하여 각 웰 바닥의 세포 단층에 스크래치를 냅니다. 스크래치된 세포를 PBS로 세척하고, 신장 혈관 기질 세포 배양물에서 얻은 조건 배지를 첨가합니다.그 후, 시간에 따른 폐쇄 백분율을 평가하기 위해 도립 명시야 현미경을 사용하여 동일한 표시 위치에서 4, 8, 12, 24시간에 스크래치 이미지를 촬영합니다. 신장 혈관 주위 기질 세포는 플라스틱 부착성 및 방추형 세포로, 기질 및 혈관 주위 세포 마커에는 양성을 보이며 CD31, CD34, CD45, HLA-DR 마커에는 음성을 보입니다. 일반적으로 신장 혈관 주위 기질 세포의 균질한 집단은 계대 배양 4회차에 도달하며, 세포는 계대 배양 9~10회차 무렵에 노화 단계에 이릅니다.kPSC의 기능적 능력을 평가하기 위한 이 대표적인 상처 치유 분석(wound scratch assay)에서, 신장 혈관주위 기질세포 배양액으로 처리한 조건화 배지를 첨가했을 때 상처 폐쇄 속도가 대조군 배지로 배양한 웰보다 유의미하게 빨랐습니다. 일차 분리 기술을 숙달하면 약 2시간이 소요되며, 균일한 kPSC 군집을 생성하는 데는 1~2개월이 걸립니다. 이 절차를 수행할 때, 신장이 부드러워지고 액체가 덜 투명해지는 즉시 콜라게나제 처리를 중단하는 것이 중요합니다.여기에 시연된 절차 외에도, 이러한 기술은 다른 고형 장기에서 혈관주위 기질 세포를 분리하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 기술로 분리된 kPSC는 다양한 신장 질환 및 이식 모델에서 이들 세포의 재생 가능성을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 임상 등급의 방식으로 kPSC를 분리하고 배양할 수 있을 것입니다.인체 유래 물질을 다루는 것은 바이러스 전염의 위험이 따르므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 HIV, B형 간염, C형 간염 검사와 같은 예방 조치를 취하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

이 논문은 열안정성 유인원 바이러스 40 및 광활성성 미토콘드리아를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 신장으로부터 조건부로 불멸화된 사구체 내피 세포를분리하는 방법을 설명한다. 우리는 구슬, 소화 단계, 파종 및 GECs-CD31 양성의 배양을 사용하여 전체 신장에서 사구체를 분리하는 절차를 설명합니다.

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용

이 연구는 쥐 중간막 세포(MC)와 생체 외 세포 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 세포는 세포 성장이나 단백질 발현을 손상시키지 않고 여러 번 배양, 동결, 재생 및 배양할 수 있습니다.

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

배우세요 임상 등급 신장 혈관 주위 기질 세포(kPSC) 격리 및 배양 방법을 통한 재생 의학 연구. 이 기술은 신장 질환 세포 치료를 위한 충분한 세포 수 확보에 활용됩니다.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

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