세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus) Swimmer and Swarmer Cells

이 방법의 전반적인 목표는 박테리아 Vibrio parahaemolyticus의 세포 분화를 유도하고 형광 현미경 검사에 의한 단일 세포 분석에 쉽게 사용할 수 있는 분화된 스워머 세포 집단의 형성을 유도하는 것입니다. 이 방법은 과학자들이 세포 분화 및 형태 형성 중에 박테리아가 세포 내 조직을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 박테리아 군집 내의 세포를 이미징하는 것은 까다로울 수 있기 때문에 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 현미경 분석에 쉽게 사용할 수 있는 단일 세포층에 존재하는 분화된 스워머 세포 집단을 생성한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 세포 분화 중에 박테리아가 세포주기, 세포 형태 및 세포 내 조직의 변화를 어떻게 조절하는지에 대한 더 나은 이해로 확장됩니다. 이 방법의 입증은 단일 세포 분석에 사용할 수 있는 세포 분화의 신뢰할 수 있는 유도 및 세포 형성을 달성하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 군집 플레이트를 만들기 위해 한천 용액을 준비하려면 4g의 심장 주입 또는 HI 한천 분말과 100ml의 이중 증류수를 현수하십시오.

H.I.한천 용액을 전자레인지에 조심스럽게 끓여서 가루가 녹을 때까지 병을 수시로 흔듭니다. 한천 용액을 섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이브하고 한천 용액을 섭씨 60t0 65도로 일정한 교반으로 냉각합니다. 다음 단계는 독성이 강한 2, 2'비피리딜을 취급하는 것이므로 장갑과 보안경을 착용해야 합니다.

2, 2'Bipyridyl을 50 마이크로 몰의 최종 농도에 추가합니다. 염화칼슘을 최종 농도 4 millamolar에 첨가하십시오. 단일 군집의 가장자리에서 소량의 V.parahaemolyticus 세포를 5ml의 LB 육수에 접종합니다.

600나노미터의 광학 밀도에서 0.8의 광학 밀도에 도달할 때까지 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도의 배양물을 배양합니다. 이 작업은 보통 2-3시간 정도 걸립니다. 세포 배양액이 성장하는 동안 최종 H.I.한천 용액 30-35 밀리리터를 둥근 150 밀리미터 페트리 접시에 피펫팅하고 한천을 응고시킵니다.

세포 배양을 발견하기 직전에 섭씨 37도의 뚜껑을 열어 한천 플레이트를 최소 10분 동안 또는 액체 잔류물이 사라질 때까지 똑바로 세우십시오. H.I.agar 군집 플레이트의 중앙에서 1마이크로리터의 세포 배양을 발견하고 건조시킵니다. 투명한 플라스틱 테이프로 플레이트를 밀봉하고 기포가 형성되고 테이프가 접히지 않도록 주의하십시오.

접시를 섭씨 24도에서 밤새 배양합니다. 이것은 이 타임랩스 비디오 클립에서 볼 수 있듯이 군체의 중심에서 뻗어나가는 군집 플레어와 함께 V.Parahaemolyticus 군집 군체를 형성하는 결과를 낳을 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 현미경 검사를 위해 아가로스 슬라이드를 준비하는 것입니다.

100ml의 20%PBS 및 10%LB 육수 용액에 아가로스 1g을 첨가합니다. 용액을 전자레인지에 조심스럽게 끓여 아가로스를 녹인 다음 자석 교반 막대로 혼합하면서 섭씨 65-70도까지 식힙니다. 깨끗한 현미경 슬라이드를 작업대의 완벽하게 평평한 부분에 놓습니다.

슬라이드의 양쪽 끝을 두 겹의 범용 실험실 라벨링 테이프로 덮어 슬라이드를 벤치에 고정합니다. 두 테이프 조각 사이의 거리는 약 3cm여야 합니다. 약 250 마이크로리터의 미리 준비된 아가로스 용액을 덮이지 않은 유리 표면에 피펫팅합니다.

두 번째 현미경 슬라이드를 하단 슬라이드와 같은 방향으로 위쪽에 놓고 잔류 아가로스가 측면으로 흘러나올 수 있도록 약간 누릅니다. 아가로스가 1-2분 동안 굳어지도록 합니다. 메스를 사용하여 현미경 슬라이드의 측면에 부착된 잔류 아가로스를 잘라냅니다.

아가로스가 굳어지면 수평 움직임으로 상단 유리 슬라이드를 하단 유리에서 천천히 당겨 빼냅니다. 현미경 슬라이드 끝에서 테이프를 천천히 제거합니다. 아가로스 슬라이드는 천천히 마르기 시작하므로 가능한 한 빨리 사용해야 합니다.

스웜머 세포를 현미경 슬라이드로 옮기기 직전에 메스를 사용하여 미리 준비된 스웜머 플레이트에서 플라스틱 테이프를 잘라냅니다. 떼를 지어 다니는 한천을 절제하는 동안, 무리를 짓는 한천을 군집 중앙에서 유래한 세포로 오염시키지 않도록 벌떼 형성 군체의 바깥쪽에서 안쪽으로 절단면을 향하게 하는 것이 중요합니다. 새 메스를 사용하여 떼를 지어 다니는 군체의 가장 바깥쪽 가장자리에서 3mm x 10mm 크기의 한천 조각을 잘라내고, 군집 가장자리 바깥쪽에서 군체 내부로 절단한 부분을 향하게 합니다.

군집 한천 조각을 세포가 아가로스 패드를 향하도록 하여 현미경 아가로스 슬라이드로 옮겨 군집 세포를 아가로스 패드에 각인합니다. 약 30초 동안 기다린 후 아가로즈 패드에서 한천 조각을 조심스럽게 제거합니다. 세포가 각인된 아가로스 패드에 유리 커버슬립을 놓습니다.

이제 세포는 형광 현미경 검사를 할 준비가 되었습니다. V.parahaemolyticus 스웜머 군체의 실체 현미경 이미징은 점점 더 확대되어 군집 주변에서 뻗어나가는 벌 플레어를 보여줍니다. 플레어의 세포는 단층 또는 이중층으로만 그룹화되는 반면, 군집 군집의 중간에 있는 세포는 여러 층으로 쌓

DIC 현미경 이미징은 플레어가 완전히 분화된 스웜머 세포 집단으로만 구성되어 있는 반면, 스웜 군체의 중간에 있는 세포는 훨씬 더 짧고 헤엄치는 세포와 스웜머 세포가 혼합되어 있을 가능성이 있음을 밝혔습니다. 원리를 증명하기 위해 DIC 및 형광 현미경 이미징을 야생형 V.Parahaemolyticus swimmer 및 swarmer 세포에서 수행하여 필수 화학주성 단백질인 YFP-CheW를 이소적으로 발현했습니다. 헤엄치는 세포에서 YFP-CheW는 단극성 및 양극성 방식으로 국소화되지만, 스워머 세포에서 YFP-CheW는 항상 양극성 국소화되며 세포 길이를 따라 무작위로 배치된 클러스터를 형성합니다.

수영 선수에서 스웜머 세포 분화 중 YFP-CheW의 국소화 패턴의 변화는 형광 강도 프로파일의 병소 분포 및 인구 통계학적 분석을 통해 나타났습니다. 개발 후 이 기술은 미생물 세포 생물학 분야의 연구자들이 박테리아 Vibrio parahaemolyticus가 헤엄치는 세포와 군집 세포의 뚜렷한 분화 상태에서 내부 조직을 어떻게 조절하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Vibrio parahaemolyticus 박테리아의 세포 분화를 유도하는 방법과 형광 현미경 검사에 의한 단일 세포 분석을 위해 분화된 스워머 세포 집단을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

Vibrio parahaemolyticus는 인간 병원체이며 해당 지역에서 BSL 2 병원체를 처리하는 방법에 대한 적절한 절차와 규정을 적용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.