Name: 세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus) Swimmer and Swarmer Cells (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 학습하세요 Vibrio parahaemolyticus의 세포 분화 유도 및 형광 현미경 단일 세포 분석 방법을. 이 기술은 세포 주기와 형태 변화 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Max Planck Society에서 지원했습니다.

1. Electro-competent V. parahaemolyticus 세포의 준비 및 형질 전환 체 세포의 전기 영동 참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 electro-competent 세포의 준비 및 수영 세포에 플라스미드 DNA의 electroporation을 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 형광 단백질이 플라스미드로부터 정상적으로 발현되는 경우 중요합니다. <ol><li> 37 ° C에서 밤새 100 μg / ML 암피실린과 부화가 포함 된 신선한 LB 한천 플레이트에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 V.의 parahaemolyticus 세포를 스트레칭. </li><li> 다음날, V. parahaemolyticus 의 단일 식민지로 LB 배지 200 ML을 접종하고 OD 600 이 1.0에 도달 할 때까지 흔들어주는 조건하에 37 ° C에서 배양합니다. 보통 세포 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하기 위해 5 ~ 6 시간의 배양이 필요합니다. </li><li> 즉시 얼음과 퍼프로 세포를 옮긴다.얼음과 4 ℃ 사전 냉각 원심 분리기에서 모든 추가 단계를 수행하십시오. </li><li> 4 ℃에서 10 분간 2,000 x g에서 세포 수확. </li><li> decantation하여 상등액을 버리고 얼음 - 차가운 273 MM 자당 솔루션 (산도 7.4, KOH로 버퍼링) 25 ML의 세포 펠렛을 다시 일시 중단합니다. </li><li> 4에서 다시 세포를 수확 2000 x 10 분 10 분. 두 번 더 반복하십시오. </li><li> 얼음 추위 273 MM 자당 솔루션 400 μL에 씻어 셀 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이어서 글리세롤을 15 % vol / vol의 최종 농도로 첨가한다. 세포는 이제 electroporation을위한 준비가되어 있지만 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 70 μL의 일정량으로 동결 될 수 있습니다. </li><li> electroporation 들어, 플라스미드 DNA의 100 ~ 1,000 NG와 electro-competent 세포의 70 μL 나누기를 섞어 얼음처럼 차가운 electroporation cuvette (0.2 cm 전극 간격)에 혼합물을 전송하십시오. 25 μF, 2400 V 및 200 Ω 설정으로 전기 천공을 수행하십시오. </li><li> 일시 중지LB broth의 600 μL에 electroporation 큐벳의 세포, 2 ML 튜브에 전송하고 3 시간 37 ° C에서 떨고있는 동안 품어. </li><li> 5 분 2,000 XG에서 세포를 스핀하고 LB 국물의 100 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 필요한 항생제가 들어있는 선택적인 LB 한천 플레이트에 세포 현탁액을 퍼 내고 밤새 37 ° C에서 품을 수 있습니다. </li><li> 다음날 식민지 형성에 대한 접시를 확인하십시오. 자라는 콜로니는 플라스미드에 코드화 된 올바른 항생제 내성 유전자를 가지고 있으며 이제 더 많은 실험에 사용될 수 있습니다. </li></ol> 2. Swarmer 세포 분화의 유도 주 : 다음 단계는 V.parahaemolyticus의 분화 세포 수명주기로의 분화 를 유도하는 방법과 고체 표면에서의 증식을 자극하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 뭉툭한 판을 준비하기 위해 심장 주입 (HI) 한천 4 g을 100 mL ddH 2 O에 현탁하십시오. </li><li>조심스럽게 마이크로파에서 HI 한천 용액을 끓여서 분말이 용해 될 때까지 때때로 병을 흔든다. 121 ℃에서 20 분간 오토 클레이브한다. </li><li> 고압 증기 멸균 후, HI 한천을 60-65 ° C로 냉각시킵니다. 50 μM (100 % 에탄올 중 50 mM의 원액)의 최종 농도로 2,2&#39;- 비 피리 딜을 첨가한다. 4 mM의 최종 농도 (ddH 2 O에서 4 M의 원액)에 CaCl 2 를 첨가한다. 필요한 경우 플라스미드를 유지하기 위해 항생제를 용액에 첨가하십시오. 참고 : 유도 성 플라스미드를 사용하려는 경우 유도제를 최종 농도에 첨가하십시오. 주의 : 2,2&#39;- 바이 피리 딜 : 급성 독성 (경구, 피부, 흡입). 이 화학 물질을 취급 할 때는 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. </li><li> 둥근 150mm 배양 접시에 최종 HI 한천 솔루션 30 - 35 ML을 부어하고 한천이 고형하자. </li><li> 세포 배양 물을 발견하기 직전에 적어도 10 분 동안 37 ℃에서 한천 평판을 말린 다음 (또는 액체 잔류 물이 disa를 가질 때까지)ppeared하지만 더 이상은 아닙니다) 열린 뚜껑이있는 오른쪽 위. 참고 : 건조 시간은 사용 된 인큐베이터에 따라 크게 달라지며 건조 된 판은 V.parahaemolyticus의 덤불을 허용하지 않습니다. (이 단계는 매우 중요합니다!) 플레이트는 신선한 상태로 사용해야하며 2 ~ 3 시간 이상 경과되어서는 안됩니다. 오래된 플레이트는 너무 마르기 때문에 떼 지어 모이게됩니다. </li><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. OD 600 = 0.8이 될 때까지 37 ° C에서 흔들어주는 배양 물을 배양하십시오. 보통 2-3 시간 정도 걸립니다. 그 후에, 세포는 HI 떼 지어 다니는 한천 플레이트에 얼룩을지게 될 준비가되었습니다. </li><li> HI agar swarming plate ( 그림 1A )의 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓습니다. </li><li> 현장을 말리십시오 ( 그림 1B ). </li><li> 플레이트를 투명한 플라스틱 테이프로 밀봉하고 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 밤새 배양하는 동안 분리 될 수 있습니다 ( 그림 1C ). 참고 :인감이 완벽하다는 점이 매우 중요합니다. 공기 방울이 형성되는 것을 피하고 테이프를 적용 할 때 접 힙니다. </li><li> 24 ° C 밤새 플레이트를 품어. 이것은 군집 (swarm-colony)의 주변에서 뻗어 나온 떼 지어 발적과 함께 V. parahaemolyticus 군집 (swarm-colony)의 형성을 초래할 것이다 ( 그림 2 ). </li></ol> 3. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비 참고 : 다음 프로토콜은 현미경에 대한 단일 swarmer 세포를 얻기 위해 아가로 오스 패드에 득실 거리는 플레어의 현미경 아가로 오스 슬라이드 및 후속 임 프린팅을 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 현미경 검사를 위해 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 20 % vol / vol PBS와 10 % vol / vol LB broth 용액 100 mL에 1 g의 아가로 오스를 첨가하십시오. 조심스럽게 전자 레인지에서 용액을 끓여 아가로 오스를 녹이고 자기 교반기로 혼합하면서 65-70 ° C로 식히십시오. </li><li> 장소 AC기울기를 가진 현미경 슬라이드를 작업대의 완벽하게 수평 부분에 올려 놓습니다. 슬라이드의 양쪽 끝을 범용 실험실 라벨 테이프로 덮고 슬라이드를 작업대에 고정시킵니다. 두 테이프 사이의 거리는 약 3cm가되어야합니다. 참고 : 테이프의 두 레이어는 아가로 오스 패드의 높이를 결정하는 매우 작은 높이를 만듭니다. 세포가 현미경 분석을 위해 동일한 평면에 있는지 확인하기위한 작업 공간의 높이는 중요합니다. </li><li> 이전에 준비한 아가로 오스 용액 250 μL을 피복되지 않은 유리 표면에 피펫 팅하십시오. </li><li> 이제 두 번째 현미경 슬라이드를 아래쪽 상단과 동일한 방향으로 놓고 약간 아래로 눌러 잔여 아가로 오스가 측면으로 흘러 나오도록하십시오. </li><li> 아가로 오스가 1 ~ 2 분 동안 고형화되도록 한 다음 천천히 상단 유리 슬라이드를 수평 이동으로 하단 유리에서 빼냅니다. </li><li> 메스를 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하십시오.현미경 슬라이드의 측면과 천천히 현미경 슬라이드의 끝 부분에서 테이프를 제거합니다. 참고 : 아가로 오스 슬라이드는 이제 준비가되었으며 천천히 건조하기 시작하므로 최대한 빨리 사용해야합니다. </li><li> 스머머 세포에서 현미경 검사를 수행하려면 떼 지어 서식하는 콜로니 ( 그림 1D )의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 ~ 3mm x 10mm의 무리한 한천 조각을 잘라내십시오. 스 마머 셀을 현미경 슬라이드로 옮기기 직전까지 떼 지음 판의 테이프 씰을 끊지 않는 것이 매우 중요합니다. 일단 테이프가 제거되면, V. parahaemolyticus의 떼죽음 세포가 수영 세포로 분화를 시작합니다. 참고 : 떼 지어 서식하는 모서리 바깥 쪽에서부터 식민지 안쪽까지 컷을 향하게하십시오 ( 그림 1D ). 이런 식으로 당신은 군집하는 식민지의 가장자리로 &quot;헤엄 치는 사람 오염&quot;을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 아가로 오스 PA를 마주보고 현미경 아가로 오스 슬라이드에 무리 한천의 조각을 전송d ( 도 1E ). 이것은 덤불 세포를 아가로 오스 패드 위에 각인시킵니다. </li><li> ~ 30 초 기다린 후, 아가로 오스 패드 ( 그림 1F )에서 한천 조각을 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 세포가 각인 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 현미경 검사를 할 준비가되었습니다. 참고 : swarmer 세포가 수영 선수 상태로 천천히 분화를 시작하기 때문에 swarmer 세포를 즉시 이미지화하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus 수영 세포 배양의 준비 참고 : 프로토콜의이 섹션은 수영 세포 유형에 형광 현미경 검사 를 수행하기 위해 V.parahaemolyticus의 문화를 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. 37 ° C에서 1 시간 동안 또는 약간의 세포 성장이 보일 때까지 흔들어주는 배양 물을 인큐베이션한다. </li><li> 에서필요한 경우이 단계에서 관심 단백질의 발현 유도제를 추가합니다. 이 실시 예에서, L- 아라비 노스는 YFP-CheW 9의 발현을 유도하기 위해 0.2 % (w / vol)의 최종 농도로 첨가되었다. </li><li> 37에서 추가 2 시간 동안 흔들어 문화를 품어 ° C. </li><li> 현미경 검사 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 3.1-3.7 단계를 수행하십시오. </li><li> 아가로 오스 패드 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓고 마를 때까지 배양하십시오. </li><li> 세포가 발견 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미징 준비가되었습니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 프로토콜의이 부분은 이미지 분석을위한 작업 흐름, 특히 인구 통계 학적 분석을 위해 단일 셀의 형광 데이터를 추출하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 이미지 분석을 시작하기 전에 모든 현미경 이미지가 16 비트 TIF 형식으로 저장되었는지 확인하십시오. </li><li> DIC (또는 위상차) 및 해당 형광 채널 이미지를 소프트웨어에로드하십시오. </li><li> &quot;디스플레이 / 오버레이 이미지&quot;를 선택하여 두 채널의 오버레이 이미지를 생성하십시오. 사진 수 ( &quot;# Images :&quot;)를 2로 설정하고 첫 번째 채널의 DIC 이미지와 두 번째 채널의 형광 이미지를 선택하십시오. </li><li> 툴바에서 &quot;Multi-Line&quot;도구를 선택하고 셀 가운데를 통해 한 극에서 다른 극으로 셀을 표시하십시오. 생성 된 모든 선 (선 객체)의 목록을 가져 오려면 &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 엽니 다. 영역 레이블, 거리 및 평균 강도 만 표시하도록 영역 측정을 구성하십시오. </li><li> &quot;Measure / Calibrate Distance&quot;아래의 픽셀 크기를 현미경 설정에 맞는 픽셀 크기로 조정하고 &quot;열려있는 모든 이미지에 적용&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 모든 영역 (라인 객체)을 형광 채널 이미지로 전송합니다. &quot;지역 / Transf영역 &quot;에서 소스 이미지 (오버레이 이미지)와 대상 이미지 (형광 채널 이미지)를 선택하고&quot;All Regions &quot;를 선택하고&quot;OK &quot;를 누릅니다. 참고 : 정확한 선 (선 객체, 지역, ROI)을 나중에 다시 생성하려면 &quot;영역 / 영역 저장&quot;을 열고 영역을 저장하십시오. </li><li> &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 열고 &quot;로그 열기&quot;를 눌러 모든 지역 측정 값을 스프레드 시트로 내 보냅니다. 데이터를 열고 내보내려면 확인하십시오. 스프레드 시트가 백그라운드에서 열리면 마침내 &quot;F9 : 데이터 기록&quot;을 눌러 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 셀을 따라 형광 초점의 위치를 ​​결정하려면 &quot;Measure / Linescan&quot;을 엽니 다. 셀의 전체 너비가 이전에 만든 영역으로 덮여 지도록 &quot;선폭&quot;을 값으로 설정합니다. 라인 스캔 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &quot;그래프 데이터 표시&quot;를 선택하십시오. 라인 - 스캔을 따라 마우스 - 커서를 마우스 왼쪽 - 클릭하고 끌어서&quot;Graph Data&quot;창에는 두 지점 사이의 해당 픽셀 / 거리가 표시됩니다. 파란색으로 강조 표시된 행을 선택한 다음 내용을 복사하십시오. 참고 : 전체 라인 스캔 강도 프로파일은 &quot;라인 스캔&quot;창에서 &quot;로그 데이터&quot;를 눌러 스프레드 시트에 기록 할 수 있습니다. 추출 된 데이터는 이제 그래프 또는 추가 통계 분석에서 시각화에 사용할 수 있습니다. 세포주기에 걸친 현지화 패턴은 세포체와 세포의 길이에 따른 인구 통계 학적 표현으로 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 이러한 표현은 이전에 선택된 동일한 투자 수익 (ROI)을 사용하여 얻을 수 있습니다. 다음 단계는 그림 3C 및 4C에 표시된 것과 유사한 인구 통계를 생성하는 방법의 예를 제공합니다. <ol><li> &quot;Metamorph nd &amp; ROI 파일 임포터&quot;를 사용하여 소프트웨어 (단계 5.6)에서 이전에 생성 된 피지 / ImageJ로드 영역 표시 (.rgn); 또는 분석 할 셀의 관심 영역 (ROI)을 빌드 인 &quot;세그먼트 선&quot;도구를 사용하여 Fiji / ImageJ에서 직접 만들 수 있습니다. </li><li> &quot;Analyze / Tools / ROI manager&quot;를 열고 모든 활성 목록 항목을 표시하십시오. &quot; </li><li> 그런 다음 &quot;More / Multi Plot&quot;을 클릭 한 다음 새로운 &quot;Multi Plot&quot;창에서 &quot;List&quot;를 선택하십시오. 표 항목을 클릭 한 다음 &quot;모두 복사&quot;를 선택하십시오. 그런 다음 새 스프레드 시트에 붙여 넣습니다. 참고 : 스프레드 시트에서 가장 긴 셀 (가장 많은 행이있는 두 개의 해당 X 및 Y 열)이 마지막 것임을 확인하십시오. </li><li> 스프레드 시트를 &quot;CSV (쉼표로 구분) (* .csv)&quot;로 저장하십시오. </li><li> 여기에서 R 스크립트를 다운로드하십시오. &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;10. 스크립트는 길이별로 세포를 분류하고 모든 세포의 형광 강도 프로파일을 각 세포의 형광등의 평균으로 정규화합니다이자형. </li><li> 전체 스크립트 &quot;cell profiles function.R&quot;을 R [버전 3.0.1; 11 ]. </li><li> 30 번째 줄에있는 &quot;예제 plots.R&quot;스크립트를 편집하여 파일 경로가 이전에 생성 된 .csv 파일이 저장된 폴더를 참조하도록합니다. 또한 31 행의 &quot;profile.csv&quot;파일 이름을 5.9.4 단계에서 생성 한 .csv 파일에 대해 선택한 파일 이름으로 변경하십시오. 그런 다음 &quot;example plots.R&quot;을 실행하고 스크립트 파일의 설명뿐만 아니라 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;의 설명서를 따라 인구 통계 분석을 생성하십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

아무런 이해 상충이 없다고 선언했다.

이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 14 , 15 , 16 , 17 , 18 의 V. parahaemolyticus swarming 세포의 분석은 주로 밀도가 높은 세포 집단 내에 존재하고 세포 길이의 높은 변화 그림 2 ). 따라서 자동 셀 감지가 잘못되어 결과가 다소 신뢰할 수 없습니다. 이 프로토콜은 <em...

박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지 주요 변화를 포함한다 : 세포 분열의 억제를 통한 swarmer 세포 형태 형성 및 두 번째 편모 계의 유도. 그 결과 분열이 일어나고 매우 길어진 봉 모양의 swarmer 세포가 형성되는데, 분열 현상은 분열 현상을 일으켜 자손 swarmer 세포가되거나 swimer 세포로 다시 분화된다. swarmer differentiation을 유도하거나 영향을 미치는 몇 가지 요인이보고되었다. 1 차 자극은 V. parahaemolyticus 가 표면 편에 회전의 억제를 감지하는 촉각 센서로 극모를 사용하는 메토 노 센싱 (mechanosensing) 에 의해 구동되는 것처럼 보이지만 몇 가지 다른 요인이우물 1 . 연구실에서는 북극 편모의 회전이 phenamil의 첨가에 의해 인위적으로 억제 될 수 있는데, 이는 나트륨 채널 구동 편모의 회전을 차단하여 스머머 분화를 유도한다. 또한, 초기 연구에서, Vibrio alginolyticus 는 투명한 플라스틱 테이프로 봉인 된 페트리 접시의 성장 배지에서 세포가 증식 될 때 고체 배지에서 떼 지어 유도되었다. 알칼리가 포화 된 여과지는 이러한 조건에서 휩쓸 기를 방지하여 하나 이상의 휘발성 산이 휩쓸 기의 유도에 관여 할 수 있음을 암시합니다. 따라서, 페트리 접시를 플라스틱 테이프로 밀봉하면 판의 헤드 공간 내에 세포 대사의 부산물로 형성된 휘발성 산이 축적 될 가능성이 높습니다. H2O2를 밀봉되지 않은 배양 접시에서 성장 배지에 첨가하여 배지 성분을 가수 분해하여 휘발성 산을 인위적으로 생산할 때도 동일한 효과가 나타났다 <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . 그럼에도 불구하고 그러한 휘발성 산의 정체는 알려지지 않았습니다. 또한, 칼슘 6 과 철 제한 7 의 과도한 가용성은 모두 고체 표면보다 스와머 분화 및 증식을 강화시키는 것으로 나타났습니다. 세포는 화합물 2.2&#39;-Bipyridyl을 swarmer differentiation 8 에 영향을 미치는 것으로 보이는 성장 배지에 첨가함으로써 철분을 굶어 죽을 수있다. 분화를 조절하는 것으로 알려진 인자는 현재 스와머 세포로의 비장 세포 분화를 유도하고 고체 한천 표면에서 그의 증식을 재현 가능하게 유도하는 프로토콜의 설계에서 실행된다. 베로니카 parahemolyticus 의 분화는 세포 분열의 조절, 세포 형태 및 깃대와 같은 거대 분자 기계의 위치의 주요 변화를 포함한다화학 주성기구 (chemotaxis apparatus) - 세포주기에 따라 단백질의 특정 위치를 요구하는 과정. 따라서, 그러한 단백질의 세포 내 국지화를 연구하는 능력은 전술 한 세포 과정의 이해에 필수적이다. 이러한 연구를 수행하기 위해서는 단일 세포에서 형광 현미경 검사가 필요합니다. 이것은 swarmer 세포의 경우처럼 밀도가 높은 세균 집단 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 현미경 연구를 위해 잠재적으로 단일 세포를 생성 할 수있는 액체 배지에서 스머머 분화를 유도하려는 시도가 있었다. 그리고 전사 수준에서이 세포들은 부분적으로 swarmer-differentiation 프로그램을 유도하지만 고체 배지에서 완전히 분화 된 swarmer 세포와 동일한 형태 학적 변화를 겪지는 않습니다 8 . 이 논문은 강력하고 재현성있는 방법을 제안한다.한천 표면의 차별화. 이 프로토콜은 단일 셀 현미경 검사 및 후속 분석을 위해 쉽게 접근 할 수있는 스머머 세포 집단을 쉽게 생성합니다. 또한, 프로토콜은 수영과 swarmer 세포 유형 (섹션 1, 2, 3, 4) 모두에서 형광 라벨 단백질의 현지화 연구를 가능하게합니다. 또한이 프로토콜은 박테리아 사회의 인구 통계 학적 분석을 가능하게하는 형광 현미경 실험에서 생성 된 데이터를 처리하고 분석하는 방법에 대한 후속 작업 과정을 설명합니다 (섹션 5).

<table><tbody><tr><td>Media 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>LB 매체</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar BD</td><td></td><td>244400</td><td>HI 한천 군집 플레이트 Agarose NEEO의 준비</td></tr><tr><td>, 초고품질</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>현미경 아가로스 패드 제조용</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Additives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>pBAD 유도</td></tr>체 <tr><td>2,2'-Bipyridyl</td> <td>유도에 사용Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>HI 한천 군집 플레이트 준비</td></tr><tr><td>용 염화칼슘 이수화물</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>HI 한천 군집 플레이트 제조</td></tr> 용 <tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 완충액</td> <td>-</td><td></td> <td>인산염 완충 식염</td></tr><tr>수에 대한 표준 레시피<td>D (+) 설탕</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>전기 역량 세포 준비</td></tr><tr><td>용 글리세롤</td><td>로스</td><td>3783.5</td><td>전기 역량 세포 준비 용</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 150 mm x 20 mm 캠</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>HI 한천 군집 플레이트</td></tr><tr><td>제조 kelvitron t (B 6420)</td> <td>Heraeus-HI</td><td></td> <td>한천 군집 플레이트 건조에 사용</td></tr><tr><td>유전자 펄서 Xcell 미생물 시스템</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>플라스미드 DNA의 elctroporation에 사용</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Use</td> for <td>microscopecopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td> <td>Microsoft-used</td> <td>for microscopecopy data analsis</td></tr></tbody></table>

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (vibrio parahaemolyticus)</em&gt; swimmer and swarmer cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.

맹목적인 식민지의 분화 및 생성 유도 그림 1 은 V. parahaemolyticus ( 그림 1A-C )의 군집 콜로니 생산에 관련된 중요한 단계의 스키마를 제공합니다. Swarmmer 한천 배지를 24 ℃에서 배양하여 고형 한천 표면에서 스머머 분화 및 증식을 유도 하였다. 떼 지어 서식하는 콜로니의 대표적인 입체 현미경 이미지가 그림 2 에 나와 있습니다. 스테레오 현미경 이미징은 떼 지어 식민지 주변에서 뻗은 떼어 내기를 명확하게 보여줍니다. 더 높은 배율은 떼 지어 번쩍이는 곳에서 세포가 단층 또는 이중층으로 만 분류되는 반면 군집 - 식민지의 중간에서는 세포가 여러 층으로 쌓여 있음을 보여줍니다 ( 그림 ...

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

이 방법의 전반적인 목표는 박테리아 Vibrio parahaemolyticus의 세포 분화를 유도하고, 형광 현미경을 통한 단일 세포 분석에 용이한 분화된 swarmer cell 집단을 형성하는 것입니다. 이 방법은 과학자들이 세포 분화 및 형태 형성 과정 동안 박테리아가 세포 내 조직화를 어떻게 조절하는지 이해하는 데 도움을 줄 것입니다. 박테리아 군집 내의 세포를 이미징하는 것은 어려울 수 있으므로, 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 층으로 존재하여 단일 세포 현미경 분석에 즉시 사용할 수 있는 분화된 swarmer cell 집단을 생성한다는 점입니다.이 기술의 함의는 박테리아가 세포 분화 과정에서 세포 주기, 세포 형태 및 세포 내 조직의 변화를 어떻게 조절하는지에 대한 더 깊은 이해로 확장됩니다. 세포 분화의 신뢰할 수 있는 유도와 단일 세포 분석이 가능한 세포의 형성을 달성하기 어렵기 때문에, 이 방법의 입증은 매우 중요합니다. 스워밍 플레이트(swarming plates) 제작을 위한 한천 용액을 준비하려면, 4g의 하트 인퓨전(heart infusion) 또는 H.I.agar 분말과 100mL의 이중 증류수를 현탁하십시오.H.I.agar 용액을 전자레인지에서 조심스럽게 가열하여 끓이며, 가루가 완전히 용해될 때까지 병을 수시로 흔들어 줍니다. agar 용액을 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브로 멸균한 후, 지속적으로 저어주며 agar 용액을 60 ~ 65 °C로 식힙니다. 다음 단계에서는 독성이 매우 강한 2, 2'Bipyridyl을 취급하므로 반드시 장갑과 보안경을 착용해야 합니다.2, 2'Bipyridyl을 최종 농도 50 µM이 되도록 첨가합니다. 염화칼슘을 최종 농도 4 mM이 되도록 첨가합니다. 단일 콜로니의 가장자리에서 소량의 V.parahaemolyticus 세포를 채취하여 5 mL의 LB 배지에 접종합니다.배양액을 진탕 배양기에서 37 °C로 배양하여 600 nm에서의 광학 밀도가 0.8에 도달할 때까지 배양합니다. 이는 보통 2~3시간 정도 소요됩니다. 세포 배양액이 성장하는 동안, 최종 H.I.agar 용액 30~35 mL를 150 mm 원형 페트리 접시에 피펫으로 분주하고, 한천을 응고시킵니다.세포 배양액을 접종하기 직전에, 뚜껑을 연 상태로 한천 배지를 37 °C에서 최소 10분 동안 또는 액체 잔여물이 사라질 때까지 수직으로 세워 건조하되, 그 이상 건조하지 않도록 합니다. H.I.agar swarming 플레이트 중앙에 세포 배양액 1 µL를 점적하고 건조시킵니다. 테이프에 기포나 주름이 생기지 않도록 주의하며 투명 플라스틱 테이프로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트를 24 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그렇게 하면 이 타임랩스 비디오 클립에서 보는 것과 같이, 군집 중심에서 스웜 플레어(swarm flares)가 뻗어 나오는 V.Parahaemolyticus 스웜 군집이 형성됩니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 현미경 관찰을 위한 아가로스 슬라이드를 준비하는 것입니다.20% PBS와 10% LB 배지 용액 100 mL에 아가로스 1 g을 첨가합니다. 전자레인지에서 용액을 조심스럽게 가열하여 아가로스를 녹인 후, 마그네틱 스터 바를 이용하여 섞으면서 65~70 °C까지 식힙니다. 깨끗한 현미경 슬라이드를 작업대의 완전히 수평인 구역 위에 놓습니다.슬라이드의 양 끝을 범용 실험실 라벨링 테이프로 두 겹씩 덮어 벤치에 고정합니다. 두 테이프 조각 사이의 거리는 약 3 cm가 되어야 합니다. 이전에 준비한 아가로스 용액 약 250 µL를 테이프가 덮이지 않은 유리 표면에 피펫으로 분주합니다.두 번째 현미경 슬라이드를 아래쪽 슬라이드와 동일한 방향으로 그 위에 놓은 다음, 남은 아가로스가 측면으로 흘러나올 수 있도록 살짝 누릅니다. 아가로스가 1~2분 동안 굳도록 둡니다. 메스를 사용하여 현미경 슬라이드 측면에 붙어 있는 잔여 아가로스를 잘라냅니다.아가로스가 응고되면, 위쪽 유리 슬라이드를 아래쪽 슬라이드로부터 수평 방향으로 천천히 떼어냅니다. 현미경 슬라이드 양 끝의 테이프를 천천히 제거합니다. 아가로스 슬라이드는 시간이 지나면 서서히 마르기 시작하므로 가능한 한 빨리 사용해야 합니다.스와머 세포(swarmer cells)를 현미경 슬라이드로 옮기기 직전에, 메스를 사용하여 미리 준비한 스와머 플레이트의 플라스틱 테이프를 잘라냅니다. 스와밍 한천(swarming agar)을 절제할 때는, 군락 중앙에서 유래한 세포가 스와밍 플레어(swarming flares)를 오염시키는 것을 방지하기 위해 반드시 군락의 바깥쪽에서 안쪽 방향으로 절단하는 것이 중요합니다. 새 메스를 사용하여 스와밍 군락의 가장 바깥쪽 가장자리에서 3 mm × 10 mm 크기의 스와밍 한천 조각을 잘라내며, 이때 반드시 스와밍 군락 가장자리의 바깥쪽에서 군락 안쪽 방향으로 절단하십시오.swarming agar 조각을 현미경용 agarose 슬라이드로 옮겨, 세포가 agarose 패드 방향을 향하게 하여 swarming 세포를 agarose 패드에 각인시킵니다. 약 30초 동안 기다린 후, agarose 패드에서 agar 조각을 조심스럽게 제거합니다. 세포가 각인된 agarose 패드 위에 유리 커버슬립을 덮습니다.이제 세포들이 형광 현미경 관찰을 위한 준비가 되었습니다. V.parahaemolyticus 스워머 군집(swarmer colony)을 배율을 높여 실체 현미경으로 촬영하면, 군집의 주변부에서 뻗어 나오는 스웜 플레어(swarm flares)를 확인할 수 있습니다. 플레어 내의 세포들은 단층 또는 이층으로만 그룹화되어 있는 반면, 스워머 군집 중앙의 세포들은 여러 층으로 쌓여 있습니다.DIC 현미경 이미징 결과, 플레어(flare)는 완전히 분화된 스워머 세포(swarmer cells) 집단으로만 구성되어 있는 반면, 스웜 군집의 중앙에 있는 세포들은 길이가 훨씬 짧으며 스위머 세포(swimmer cells)와 스워머 세포가 혼합되어 있을 가능성이 높은 것으로 나타났습니다. 개념 증명(proof of principle)을 위해, 필수 화학성 단백질인 YFP-CheW를 이소성으로 발현시킨 야생형 V.Parahaemolyticus 스위머 세포와 스워머 세포를 대상으로 DIC 및 형광 현미경 이미징을 수행하였습니다. 스위머 세포에서 YFP-CheW는 단극성(unipolar) 또는 양극성(bipolar) 방식으로 국소화되지만, 스워머 세포에서 YFP-CheW는 항상 양극성으로 국소화되며 세포 길이를 따라 무작위로 배치된 클러스터를 형성합니다.swimmer 세포에서 swarmer 세포로의 분화 과정 중 YFP-CheW의 국소화 패턴 변화는 foci 분포의 시각화 및 형광 강도 프로필의 인구통계학적 분석을 통해 나타났습니다. 이 기술은 개발 이후, 미생물 세포 생물학 분야의 연구자들이 박테리아 Vibrio parahaemolyticus가 swimmer 및 swarmer 세포라는 뚜렷한 분화 상태 동안 내부 조직을 어떻게 조절하는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 박테리아 Vibrio parahaemolyticus의 세포 분화를 유도하는 방법과 형광 현미경을 이용한 단일 세포 분석을 위해 분화된 swarmer 세포 집단을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.Vibrio parahaemolyticus는 인체 병원균이므로, 해당 지역의 BSL 2 병원체 취급에 관한 적절한 절차와 규정을 준수해야 함을 유념하십시오.

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Heering, J., et al. Vibrio parahaemolyticus 수영 및 떼 세포의 세포 분화 유도 및 단일 세포 이미징. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 특별히 준비된 한천 배지를 사용하여 Vibrio parahaemolyticus 에서 군집 세포 분화 유도를 보여줍니다. 철분 고갈, 칼슘 보충 및 표면 접촉과 같은 환경 신호를 조작함으로써 박테리아는 수영 형태에서 측면 편모가 있는 길쭉한 떼 세포로 전환하도록 자극됩니다. 이러한 분화된 세포는 고체 표면 전체에 퍼져 성공적인 형태학적 변화를 의미하는 특징적인 군집 플레어를 형성합니다.

Vibrio parahaemolyticus의 군집 세포로의 분화 유도

근원: Heering, J., 외., 세포 분화 유도 및 Vibrio parahaemolyticus 수영 및 떼 세포의 단일 세포 이미징. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 형광 이미징을 위해 Vibrio parahaemolyticus 콜로니에서 군집 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 박테리아는 수영 세포에서는 단극성으로, 길쭉한 군집 세포에서는 양극성으로 국한되는 형광단 태그 단백질을 발현하도록 유전자 조작되어 시각적 분화를 가능하게 합니다. 현미경 슬라이드 위에 아가로스 패드를 준비하고, 그 위에 콜로니 섹션을 배치하고 제거하여 부착 세포를 남긴 다음 이미징을 위해 커버슬립으로 덮습니다.

이미징을 위한 Vibrio parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비

출처: Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.

박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석

군집 운동성은 물리적, 환경적 요인의 영향을 받습니다. 우리는 군집 분석 준비 및 데이터 수집과 일반적으로 관련된 문제를 우회하기 위한 2단계 프로토콜과 지침을 설명합니다. 현재의 분석 기술로는 제공되지 않는 떼 행동에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 거시적 이미징 기술이 사용됩니다.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

살모넬라 균 은 살모넬라 특이 적 액포와 세포질에서 자유 (과다 복제) 모두에서 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제합니다. 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜은 ImageJ를 통한 두 가지 보완 이미지 분석을 통해 살모넬라균 의 세포 내 표현형을 정량화하여 단일 세포 분해능 및 스코어링에 도달하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

학습하세요 Vibrio parahaemolyticus의 세포 분화 유도 및 형광 현미경 단일 세포 분석 방법을. 이 기술은 세포 주기와 형태 변화 연구에 활용됩니다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도

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