Name: 마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 마우스 심장 형태학을 평가하는 경제적인 심장초음파 및 조직학 분석 방법을. 이 프로토콜은 다양한 형질전환 마우스 모델에서 심장 기능과 형태를 정밀하게 측정하여 연구자들에게 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

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작품 "미래 위한 투자" LABEX SIGNALIFE 프로그램 (참조 ANR-11-LABX-0028-01) (국립 연구 기관, ANR) 프랑스 정부에 의해 지원 되었다 하 고 공화국을 교부 금에 의해 협회에서 D. W. 부 la Recherche 쉬르 르 암, Fondation 드 프랑스, 고 암 Inserm 계획입니다. D. B.와 A. V. 받은 장학 Fondation 부 라 검색 Médicale에서에서와 니스의 도시에서 각각. 필립스에 의해 제공 되는 echocardiograph와 변환기를 친절 하 게 했다. 우리가 그들의 숙련 된 기술 지원에 대 한 A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini, 및 S. M. 바그너 감사합니다.

여기에 설명 된 실험 관련 기관 및 프랑스 동물 복지 법률, 지침 및 정책에 따라 실시 했다. 그들은 프랑스 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 (위원회 회의 Institutionnel d &#39; Ethique 부 l &#39; 동물 드 응용; 번호 후부 터/2012-106).
 1. 심장 초음파 <ol><li>꼬리 가볍게 잡고 적절 한 위치를 표준 실험실 균형을 사용 하 여 마우스의 몸 무게를 확인.</li>
	<li>50 mg/kg pentobarbital 25 , 26의 복 (i.p.) 주입에 의해 동물 anesthetize. 
	참고: 연구를 통해 동일한 프로토콜을 사용 하는 경우 마 취의 다른 종류를 사용할 수 있습니다. 장단점은 아래에 설명 될 것 이다.</li>
	<li>마우스 응답 하지 않는 때까지 그것의 자신의 감 금 소 및 대기에 다시, 그것은 보여줍니다 지속적인 호흡, 그리고 후방 발 반사는 결 석. 이 테스트 하려면 약간 발을 짜 내 고 다리는 여전히 리트랙트 여부 관찰.</li>
	<li>왼쪽 흉부와 상업 설치류 면도기를 사용 하 여 왼쪽된 겨드랑이 면도. 
	참고: 전용된 설치류 면도기를 사용 하 여 정밀한 마우스 머리의 완전 한 제거를 위한 echocardiographic 측정에 간섭을 유발 하지 않도록 허용 됩니다. 상업적인 머리 제거 크림 또는 솔루션 피해 야 한다로 그들은 일반적으로 향수, 그것은 일어나 야 후 동물을 방해 합니다. 열 손실을 증가, 과도 한 면도 하지 마십시오.</li>
	<li>따뜻한 패드 12 머리 얕은 왼쪽 양면 위치, 40-42 ° C로 설정 자 고 동물을 넣어 o &#39; 시계와 6 꼬리 o &#39; 시계. 테이프로 왼쪽된 팔, 왼쪽된 다리, 그리고 꼬리 수정.</li>
	<li>적용 사전 예 열 변환기의 머리 면도 가슴에 심장 초음파 젤.</li>
	<li>배치 변환기 parasternal-왼쪽, 젖꼭지 근육의 수준에 2 차원 (2D) parasternal 긴 축 보기를 목의 오른쪽으로 그것을 지시 합니다. Papilary 근육 수준에서 짧은 축 보기를 시계 방향으로 90 ° 변환기를 설정 합니다. 최소 깊이 설정과 확대/축소를 사용 하 여 이미지 품질 및 프레임 속도 최대화 하기 위해. 스윕 속도 최대로 설정.
	이러한 설정, 다른 확대/축소 및 깊이 옵션 설정 <ol><li>컴퓨터와 소프트웨어에 따라 사용할 수 있습니다. 2D 기반 M 모드 이미지를 기록 짧은 축에 27 볼. 그림 1A와 B 27을 참조 하십시오. 
		참고: 주의 가슴에 과도 한 압력을 적용 하지 않도록이 bradycardia을 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>각 동물에 대 한 3 마음 이길 시 네 루프의 기록 이상 3 시리즈. 
	참고:이 연구에 사용 된 echocardiograph 소프트웨어에 대 한 누르십시오는 &#34; 취득/저장 &#34; 버튼을 한 번만. 이 방법론은이 특정 소프트웨어와 함께 echocardiograph에 적용 됩니다. 다른 컴퓨터와 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>성공적인 기록, 닦아는 심장 초음파 젤 마우스 흉부, 생리대, 및 변환기에서 후. 사지 및 꼬리에서 테이프를 제거.</li>
	<li>관찰 하 난방 패드, 손실을 방지 하기 위해 불필요 한 빛 노출 및 열, 최대 절전 모드 해제 될 때까지 조직으로 덮여에 마우스를 두고</li>
	<li>동물의 장에 다시.</li>
	<li>분석 parasternal 짧은 축 보기 왼쪽된 심 실 (LV) 치수 및 기능 결정에서 M 모드 이미지 기록. Systole와 심장 (LVAWs 및 LVAWd), LV 내부 끝 심장 수축 및 끝 확장기 직경 (LVIDs 및 LVIDd), 및 systole와 심장 (LVPWs 및 LVPWd)를 사용 하 여 LV 후부 벽 두께 (LVPW)에서 LV 앞쪽 벽의 두께 측정 합니다 저장 된 이미지에 조직 혈액 인터페이스의 식별.</li>
	<li>명백한 최대한 LV 확장기 차원 시 확장기 치수를 측정 하 고 끝 심장 수축 차원 LV 후부 벽의 가장 앞쪽 수축 여행 시 LV. 터치 스크린에 꼭지는 &#34; 분석 &#34; 아이콘 다음에 &#34; LVAWd &#34; 아이콘. 오른쪽 심 실 구멍 및 심장에 LV 앞쪽 벽 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스 위치.</li>
	<li>전자 캘리퍼스 LV 앞쪽 벽와 LV 확장기 앞쪽 벽 두께를 LV 구멍 사이의 인터페이스에 위치, 소프트웨어 직접 LV 내부 끝 확장기 측정으로 전환 됩니다.</li>
	<li>LV 구멍 및 LV 직경 내부 끝 확장기를 LV 후부 벽 사이의 인터페이스에는 캘리퍼스를 위치, 소프트웨어 LV 후부 벽 두께 측정으로 전환 됩니다.</li>
	<li>LV 후부 벽과 LV 확장기 후부 벽 두께를 심장 막 간의 인터페이스에는 캘리퍼스를 배치 합니다. LV 수축 차원에 대 한 스크린에 터치에는 &#34; LVAWs &#34; 아이콘 및 위치 오른쪽 심 실 구멍 및 LV 앞쪽 벽 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스 systole.</li>
	<li>LV 앞쪽 벽와 LV 수축 앞쪽 벽 두께를 LV 구멍 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스를 배치 합니다. LV 내부 끝 수축 기 직경 및 LV 수축 후부 벽 두께 대 한 위에서 설명한 대로 프로세스를 반복 합니다. 심장 초음파 검사의 미국 사회에 의해 채택-첨단 규칙을 사용 하 여 추적 endocardial epicardial 테두리 13 , 27. 
	참고: LV 수축 함수 매개 변수 자동으로 계산 됩니다 이전 측정을 사용 하 여. 분수 (FS) 단축 LV FS (%)로 정의 됩니다 [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd =] x 100. LV 방출 분수 (EF) 수정된 Teicholz 수식으로 계산 됩니다 어디 EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. 그림 1A와 B를 참조 하십시오.</li>
	<li>USB 메모리 스틱 또는 콤팩트 디스크에 데이터를 저장 하 고 백업 복사본.</li>
	<li>가져오기, 분석, 그리고 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 내보냅니다. 
	참고: 이러한 기준선 측정 후 실험 수 일시 정지 됩니다. 녹아웃 동물 및 야생-타입 littermates 사이 직접적인 비교를 수행 하는 경우 진행 조직학 분석 6. Cre-ERT2;에 대 한 lox/lox 마우스 라인 설명된 5 , 24로 i.p. 주입 tamoxifen 유도 함께 다음 날 계속. Echocardiographic 측정 후 직접 수술을 수행할 수 왼쪽된 관상 동맥 5 , 28의 결 찰 하 여 실험적인 심근 경색을 유도 하는 경우 때 쥐 마 취를 받고 있다입니다. 그렇지 않으면, 1 주일 사이 마 취의 두 라운드의 최소 지연 수술 치의 속도 제한에 유지 되어야 합니다.</li>
</ol> 2. 조직학 평가 위한 심장 샘플의 준비 <ol><li>경부 전위에 의해 동물 희생. 그들의 몸 무게를 측정 합니다. 가슴 및 복 부를 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 소독.</li>
	<li>게 가로 절 개 피부 1cm에에서 원심 흉 골. 무딘 집게를 사용 하 여, 가슴, 머리의 방향으로 이동에서 피부를 제거 합니다. 좋은 집게와 흉 골을 가볍게 잡고 하 고 좋은 위의 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 여 횡 경 막 엽니다.</li>
	<li>흉 골에 평행 하 게 양쪽에 흉 곽을 잘라. 흉 골의 머리 방향으로 이동 합니다. 가슴에서 마음을 찾습니다. 좋은 집게와 심장의 혈관 트렁크를 누른 좋은 위를 사용 하 여 아래 컷.</li>
	<li>가슴을 열고 삭제할 흉부에서 전체 심장, 심장 무게를 측정 고 설정 마음-몸 무게 비율 4 , , 5 6 , 23 , 29 , 30 .</li>
	<li>수정 2 ml 15 mL 튜브에 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 솔루션의 심장 4에서 하룻밤 ° C. 
	주의: 위험! 화학 증기 두건;에 말린 솔루션 작업을 수행 해야 합니다. 착용 장갑 및 안전 안경. 
	참고: 말린 솔루션에 대 한 버퍼 구성 다른 공급 업체에 따라 다릅니다, 연구를 통해 동일한 공급 업체 사용.</li>
	<li>다음 날, 마음, 중간에서 가로 평면에서 잘라내어 파라핀 포함, 카세트에 그들을 전송는 자동된 삽입 장치를 사용 하 여 병 리 실험실에서 수행 됩니다.</li>
	<li>단면 수행.
	<ol><li>섹션 파라핀 톰와 40 ° C 물에 포함 된 증류수 목욕 float를 사용 하 여 3 µ m의 두께에서 차단.</li>
		<li>이전 슬라이드에 섹션. 37 ° C 배양 기에서 건조 하룻밤 슬라이드를 허용 하 고 사용을 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 저장. 
		참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 사용자 얼룩 (3 단계)에 대 한 준비가 될 때까지.</li>
	</ol></li> <li>Deparaffinize 및 리하이드레이션 조직 슬라이드.
	<ol><li>얼룩이 지는 파라핀을 녹여 10 분 55 ° C 오븐에 유리 삽입과 함께 항아리에 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>Deparaffinize 크 실 렌 또는 크 실 렌 대신 5 분의 200 mL의 두 변경에서 슬라이드. 
		주의: 매우 가연성 및 독성! 화학 증기 두건;에서 일 착용 장갑 및 안전 안경.</li>
		<li>는 100% 알코올 200ml에 슬라이드를 전송합니다. 3 분 동안 두 변경 하 고 3 분에 대 한 95% 알콜 200 mL를 통해 한 번 전송 
		주의: 가연성! 멀리 점화;의 소스 금연.</li>
		<li>린스 200 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 5 분에 두 번 3, 4, 또는 5 단계를 계속 하 고.</li>
	</ol></li></ol> 3. 되며 고 오신 얼룩 <ol><li>증류수에 그들의 단면도 가진 슬라이드 린스.</li>
	<li>8 분에 대 한 되며 솔루션 핵 얼룩</li>
	<li>실행 하는 10 분에 대 한 수돗물에 씻어</li>
	<li>2 분에 오신 솔루션 얼룩</li>
	<li>Dehydrate 100% 에탄올 (EtOH)에 2 분 동안 세 번. 크 실 렌 또는 크 실 렌 대신에 2 분 동안 세 번을 선택을 취소 합니다. 크 실 렌 기반 설치 매체에 마운트.</li>
	<li>는 슬라이드 사진 하 고 interventricular 심장의 경도 섹션에서 핵의 수준에서 cardiomyocyte 직경을 측정 한다. 심장 당 세 섹션 및 섹션 당 적어도 100 셀 측정.</li>
</ol> 4. WGA 얼룩 <ol><li>tetramethylrhodamine (또는 다른 형광 성 염료) 2.7 단계에서 가져온 슬라이드를 품 어-습 한 챔버에 실 온에서 60 분에 대 한 WGA (PBS에 1: 100)를 활용.</li>
	<li>PBS를 가진 5 분 세 번 세척.</li>
	<li>마운트 형광 DAPI 포함 된 미디어를 탑재와 함께입니다. 분석 하기 전에 어둠 속에서 4 ° C에서 저장소. 
	주의: 눈 보호와 호환 화학 내성 장갑 착용.</li>
	<li>슬라이드 사진.
	<ol><li>사용 현미경 epi 조명 형광 및 필터 DAPI와 tetramethylrhodamine (테이블의 자료를 참조)를 설정 합니다. 최대 밝기를 자동 노출 조리개 설정.</li>
		<li>취득 파란색과 빨간색 채널에 대 한 400 x 배율에서 이미지를 구분합니다. ImageJ에서 이미지를 엽니다. 밝기를 조정 하 고 필요한 경우를 대비 (이미지 &#62; 조정 &#62; 밝기/대비).</li>
		<li>8 비트 각 이미지 설정 (이미지 &#62; 유형 &#62; 8-비트). DAPI WGA 이미지 오버레이. DAPI를 빨강 채널 파랑 채널을 사용 하 여 WGA;에 대 한 없음으로 녹색과 회색 채널 설정 (이미지 &#62; 색상 &#62; 채널 병합) 31.</li>
	</ol></li> <li>Cardiomyocyte 직경 interventricular 심장의 횡 근 섹션에서 핵의 수준에서 결정.
	<ol><li>정의 ImageJ에 이미지의 규모. 이 목적을 위해 (예를 들어, 심장 섹션으로 같은 확대 hemocytometer 챔버; 단계 4.4) 알려진된 크기의 사진.</li>
		<li>처음부터 끝까지 선을 그리는 직선 도구를 사용 하 여 알려진 구조 (분석 &#62; 규모 설정). 
		참고: 픽셀에서 거리 표시 됩니다 자동으로; 알려진된 거리와 길이 단위 입력 해야 합니다. 핵의 수준에서 cardiomyocyte 측정 진행.</li>
		<li>WGA-긍정적인 세포 막의 반대 사이트에 DAPI 긍정적인 핵 통해 WGA 긍정적인 막에서 직선을 그릴 (분석 &#62; 측정). 결과 창에서 길이 값 소수 자릿수의 의미 있는 수 있는지 확인 (분석 &#62; 측정을 설정 &#62; 소수 자릿수).</li>
		<li>심장 당 세 섹션 및 섹션 당 적어도 100 셀을 측정합니다. 결과 Excel로 내보내기 (결과 클릭 &#62; 파일 &#62;로 저장 &#62;.csv) 6 , 31.</li>
	</ol></li></ol> 5. Pecam-1 Immunostaining <ol><li>항 unmasking 수행.
	<li>나트륨 시트르산의 추가 1, 600 mL <ol>버퍼 (10 m m 나트륨 구 연산 염, 0.05% 트윈 20, pH 6.0) 압력 밥 솥입니다. 열판에 압력 밥 솥을 놓고 전체 전력에 그것을 설정 합니다. 이 시점에서; 압력 밥 솥의 뚜껑을 확보 하지 마십시오 단순히 위에 휴식. 
		주의: 핫!</li>
		<li>나트륨 구 연산 염 버퍼 끓는 일단 단계 2.5에서에서 압력 밥 솥 슬라이드를 전송. 압력 밥 솥 뚜껑을 보호 합니다. 밥 솥 전체 압력에는, 7 분을 기다립니다. 7 분 경과 열판을 해제 하 고 빈 싱크대에 압력 밥 솥을 배치. 압력 방출 벨 브를 활성화 하 고 밥 솥을 통해 냉 수를 실행. 그것은 드 가압, 일단 뚜껑 열고 냉 수 5 분 장소에 대 한 솥에 슬라이드에서에서 실행 200 mL PBS의. 
		참고: 또는, 마이크로웨이브 항 unmasking 사용할 수, 과열 위험 증가.</li>
	</ol></li> <li>사용 0.3%의 5 분에 대 한 블록 내 인 성 과산화 효소 활동에 메탄올에 과산화 수소 3 시간 2 분에 대 한 PBS의 각에서 200 mL에 대 한 슬라이드를 린스. 
	주의: 가연성 및 독성!</li>
	<li>희석된 정상적인 차단 혈 청 (PBS에 5% 정상 염소 혈 청) 또한 avidin 블록 (4 방울 1 ml에서)을 포함 하는 15 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 섹션에서 액체 누르고 토끼에서 Pecam-1 항 체, mL 당 biotin 블록의 2.5% 정상 염소 혈 청 및 4를 포함 하는 PBS에 희석된 1시 50분으로 그들을 품 어. 4 습 한 챔버에 하룻밤 슬라이드를 품 어 ° c.</li>
	<li>는 PBS의 200 mL에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어. Biotinylated 염소-토끼 IgG 항 체 희석 1: 200 실 온에서 1 h 2.5% 정상 염소 혈 청을 포함 하는 PBS에로 섹션을 품 어. PBS의 200 mL에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>품 어 t그는 20 분 (시 약 A와 결합 된 30 분 이전 해야 시 B 사용)에 대 한 과산화 효소 avidin/biotin 기반 시스템 섹션입니다. PBS의 200 mL에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>분해 1 3, 3 &#39;-diaminobenzidine (한 덩어리)와 과산화 수소 1 요소 두 번 증 류 물 5 mL에 태블릿. 약 3 분, 컬러 개발을 신중 하 게 모니터링 DAB 솔루션 섹션을 품 어. 부드럽게 200 ml PBS의 슬라이드를 세척 하 여 발 색 반응을 중지. 
	주의: 발암 성; 화학 방지 장갑 착용!</li>
	<li>는 Hematoxylin와 6 분에 대 한 핵 counterstain. 100% 알코올 200ml에 2 분을 위한 3 시간 2 분 Dehydrate의 수돗물을 실행에 린스. 크 실 렌 또는 크 실 렌 대신에 각 200ml 3 시간 2 분 대 한 선택을 취소 합니다. 크 실 렌 기반 설치 매체에 마운트.</li>
	<li>(적어도 10 필드 각 심장의 interventricular 심장에서 40 x 확대) 슬라이드 사진 하 고 자유롭게 사용할 수 ImageJ 소프트웨어 31를 사용 하 여 Pecam-1 영역 밀도 측정 한다. DAB 및 되며 색상 deconvolution 32 플러그인을 사용 하 고 같은 수준으로 이미지 대비를 조정. 
	참고: 갈색과 보라색/파란색 색상 색상 deconvolution 어려움이 발생할 수 있습니다, 중요 한 스펙트럼 중복 경우에 하나를 명확 하 고, 밝은 파란색 핵 얼룩 되며 솔루션의 다른 브랜드를 시도할 수 있습니다. 면역 형광 검사 또는 모 세관의 수동 계산을 수행할 수 또는.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

다른 방법은 심장 구조와 쥐, 심장 초음파, 등 대비 강화 된 MRI, 마이크로 CT, PET 스캔 기능을 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 비용 효율성과 단순함, 심장 초음파는 마우스11기능 분석에 대 한 가장 널리 사용 되 기술입니다. 마음과 쥐에서 심장 박동, 주파수 변환기의 높은 주파수의 작은 크기 때문에 일반적으로, &#62; 10 MHz 해야 사용할 수 있지만 성공적인 측정 8 또는 9 MHz 변환기4,7 보고 되었습니다 . 심장 기능은 체온과 심장 주파수에 밀접 하 게 관련 된다, 그것은 연구를 통해 이러한 매개 변수를 제어 하는 것이 중요입니다. 생리대에 마우스를 배치 마 취 동물의 체온 일정 유지 필수적 이다. 이상적으로, 몸 온도 38 ° C를 설정 하는 직장 프로브 제어 난방 패드를 사용 해야 합니다. 이 사용할 수 없는 경우에가 열 패드 2이 값 보다 3도 설정...

유전자 변형된 마우스 모델의 큰 다양 한 사용할 수 있습니다, 하 고 약리 연구에서 쥐의 수는 높은1,2. 심장 초음파 및 MRI은 심장 기능과 형태학이 마우스 모델3의 phenotypic 특성 일반적으로 사용 되 접근법입니다. 제시 프로토콜의 목적은 심장 기능과 성인 쥐에 형태 분석입니다. 그것은 echocardiographic, 조직학, 결합 및 immunohistochemical 측정. Echocardiographic 시험 쥐4,5,6,7,,89,10,11에서 널리 이용 된다 12. Pachon 외. 11 식별 205 연구 2012과 2015 사이의 순환, 순환 연구, 미국의 저널의 생리-심 혼과 순환 상 생리학, 및 심장 혈관 연구 에 게시 동물에 echocardiographic 검사를 사용합니다.
심장 초음파는 심장 고기 유전자 변형된 쥐5,6,13,,1415,16, 를 식별 하는 데 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, 또한 만성 과부하 유발 비 대, 심근 허 혈, 및 쥐 (12에서 검토) 심장 근육 병 증 모델에서 심장 기능 분석으로. 향상 된 심장 초음파 장비에 대 한 수는 왼쪽 심 실 (LV) 수축 기 및 diastolic 차원, 조직 도플러 영상, 심근 대비 진단법, 그리고 라스베가스 지역 기능과 관상 예비 의 평가의 표준 측정 12. 이상적으로, echocardiographic 시험 수축 기능, 자율 반사 제어에 마 취의 부정적인 영향을 피하기 위해 의식 쥐에서 수행 해야 하 고 심장 속도11. 그럼에도 불구 하 고,이 방법은 동물; 훈련 요구에 의해 제한 됩니다. 안정적인; 체온 유지에 어려움 운동 유물; 스트레스; 매우 높은 심장 주파수; 그리고 동물의 많은 수는 조사 하는 경우에 특히 실험을 수행 하기 위해 두 개 이상의 조사에 대 한 요구 사항. 흥미롭게도, 최근 연구 보고 훈련 하 고 훈련 되지 않는 동물19에 echocardiographic 매개 변수에서 차이가. 우리는 마 취 쥐에 echocardiographic 측정을 수행합니다. 다른 마 취 프로토콜 아래에 설명 될 것 이다.
비록 표준 해상도 심장 초음파 (&#62; 10 MHz)은 측정 LV 수축 기 및 diastolic 크기와 성인 쥐에 심장 기능에 충분 한, 메서드를 기본 구조 현상의 설명에 제한 됩니다. 따라서, 우리가 결합 조직학을 vivo에서 측정 및 측정, 예를 들어 cardiomyocyte 직경 및 배 밀도를 immunohistological 분석. 동일한 유형의 다른 조직학 및 immunohistological 조사, 확산의 결정, apoptosis, 경색 크기 측정, 섬유 증, 및 특정 마커 식의 검사를 수행할 수 있습니다. 조직 처리 하지만이 프로토콜의 대상이 되지 않습니다. 조직학 분석 비보에 echocardiographic 시험의 기본 구조 변경에 대 한 추가적인 통찰력을 제공합니다. 추가 단계에서 우리는 분자와 울트라 구조 조사와이 측정을 완료할 수 있습니다. 조직학 분석 echocardiographic 시험 완료 뿐만 아니라 또한 불가결 될 때 심장 초음파의 해상도 충분 하지 않습니다. 이것은 유전자 변형된 생쥐 배아 치명적인23,24의 모델의 경우 특히.

<table><tbody><tr><td>밀 배아 응집소 (WGA) 공액 테트라메틸로다민</td><td>Life Technologies, Molecular Probes</td><td>W849</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 염소 항토끼 IgG 항체</td><td>Vectorlabs</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Avidin/Biotin 차단 키트</td><td>Vectorlabs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td><td>Vectorlabs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-디아미노벤지딘 정제</td>가 포함된 VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 배지 <td>Sigma</td><td>D4168</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pecam-1 (CD31) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>초음파 투과 젤, Aquasonic 100</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>젤선형 초음파 프로브, L15-7io</td><td>필립스 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>심초음파, IE33 xMATRIX</td><td>필립스 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경, 라이카 DMi8</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 필터 세트 DAPI</td><td>라이카</td><td>11525304</td><td></td></tr><tr><td>필터 세트 TxR</td><td>라이카</td><td>11525310</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라, SPOT RT3 컬러 슬라이더</td><td>스폿 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어, SPOT 5.2 고급 및 기본 소프트웨어</td><td>스폿 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 컴퓨터</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>대형 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Fine Science Tools</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>설치류 면도기</td><td>하버드 장치</td><td>34-0243</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩용 카세트</td><td>사쿠라</td><td>4155F</td><td></td></tr><tr><td>중립 완충 포르말린</td><td>사쿠라</td><td>8727</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>사쿠라</td><td>8733</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 TEK III</td><td>사쿠라</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>자동 임베딩 장치, Tissue-Tek VIP</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 스테이션 Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드, Accu-Edge S35</td><td>Sakura</td><td>4685</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체 Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>1408</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 박스</td><td>, Sakura</td><td>3958</td><td></td></tr><tr><td>에오신 용액</td><td>, Sakura</td><td>8703</td><td></td></tr><tr><td>헤마톡실린 용액</td><td>, Sakura</td><td>8711</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰, RM2125RT</td><td>Leica</td><td>720-1880 (VWR)</td><td></td></tr> <tr><td>수조, Leica HI1210</td><td>Leica</td><td>720-0113(VWR)</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>ACRO444220050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>스테인딩 글라스 접시</td><td>VWR</td><td>MARI4220004</td><td></td></tr><tr><td>염색 항아리</td><td>VWR</td><td>MARI4200005</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>9010-0012</td><td></td></tr><tr><td>DAB 및 요소 과산화수소 정제, SIGMAFAST 3,3&prime;-Diaminobenzidine 정제</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

유전자 변형된 마우스 모델의 증가 최근 몇 년 동안에서 가능한 되고있다. 또한, 약리 연구에서 쥐의 수는 높다. 이 마우스 모델의 phenotypic 특성에는 심장 기능과 형태학의 검사를 필요합니다. 심장 초음파 및 자기 공명 영상 (MRI)은 심장 기능과 마우스 형태학 특성을 일반적으로 사용 되 접근법입니다. Echocardiographic 및 MRI 장비 전문 사용 작은 설치류에 비싼 하 고 전용된 공간이 필요 합니다. 이 프로토콜 15 MHz 인간의 혈관 프로브 임상 echocardiographic 시스템을 사용 하 여 마우스에 심장 측정을 설명 합니다. 측정은 마 취 성인 쥐에 수행 됩니다. 적어도 3 개의 이미지 시퀀스는 기록 하 고 parasternal 짧은 축 보기에서 M 모드에서 각 동물에 대 한 분석. 나중에, 심장 조직학 검사 수행 및 cardiomyocyte 직경 hematoxylin에 결정 됩니다-오신-또는 밀 세균 agglutinin (WGA)-파라핀 섹션 스테인드. 배 밀도 Pecam-1 immunostaining 후 결정된 morphometrically입니다. 프로토콜 약리 연구에 성공적으로 적용 하 고 다른 유전 동물 모델의 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (영구 결 찰 하 여 실험적인 심근 경색 후에 뿐만 아니라 초기 조건 되었습니다. 젊은이)입니다. 우리의 경험에서는, echocardiographic 조사 마 취 동물에 제한 되 고 적어도 무게 성인 쥐에 가능 25 g.

그림 1, 대표 echocardiographic 녹음 유전자 변형 쥐에서 심장 고기를 식별 하기 위해 심장 초음파의 유용성을 보여 줍니다. 정상적인 심장 기능 (그림 1A)와 마우스 및 넓혀 진된 좌 심 실 및 감소 된 LV 기능 (그림 1B)와 동물의 차이 쉽게 확인 될 수 있다. 그림 2 에서는 cardiomyocyte 비교 직경 측정 (그림 2A) 없이 동물 및 심장 비 대 (그림 2B) 되며 오신 스테인드 파라핀 심장 섹션의 측정을 사용 하 여 심 혼 직물의 경도 섹션입니다. 그림 3 에서는 c...

Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

본 심초음파 검사와 조직학적 조사의 종합적인 목표는 기저 상태 및 병태생리학적 조건 하에서 서로 다른 형질전환 마우스 모델의 심장 기능과 형태를 조사하는 것입니다. 우선, 마우스의 꼬리를 가볍게 잡은 상태에서 표준 실험용 저울을 사용하여 동물의 체중을 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취시킨 후, 뒷발을 가볍게 눌러 다리가 수축하는지 관찰합니다.시판되는 설치류용 제모기를 사용하여 흉부 왼쪽과 왼쪽 겨드랑이를 제모합니다. 40~42°C로 설정된 가온 패드 위에 동물을 왼쪽으로 약간 기울어진 자세로 배치하며, 머리가 12시 방향, 꼬리가 6시 방향으로 오게 합니다. 그런 다음 테이프를 사용하여 왼쪽 팔, 왼쪽 다리와 꼬리를 고정합니다.미리 데워둔 심초음파 젤을 제모한 흉부와 탐촉자 헤드에 바릅니다. 다음으로 심초음파 탐촉자를 흉골 좌측에 배치하고, 목의 오른쪽 방향으로 향하게 하여 유두근 수준에서 2차원 흉골 좌측 장축 뷰를 얻습니다. 그 후 탐촉자를 시계 방향으로 90도 회전시켜 단축 뷰를 얻습니다.이미지 품질과 프레임 속도를 최대화하기 위해 최소 깊이 설정과 줌을 조정합니다. 스윕 속도를 최대로 설정합니다. 단축축 뷰(short axis view)에서 2D 유도 M-모드 이미지를 기록합니다.동물마다 심박동 세미루프(semiloops) 3회씩, 최소 3세트를 기록하십시오. 성공적으로 기록을 마친 후, 사지와 꼬리에서 테이프를 제거하십시오. 마우스 흉부 가열 패드와 트랜스듀서에 묻은 심초음파 젤을 닦아내십시오.마우스가 깰 때까지 불필요한 빛 노출과 열 손실을 방지하기 위해 티슈로 덮어 가열 패드 위에서 관찰하며 둡니다. 그 다음 동물을 케이지에 다시 넣습니다. 기록된 단축 뷰(short axis view)의 M-모드 영상을 분석하여 좌심실(LV)의 크기와 기능을 측정합니다.저장된 이미지에서 조직과 혈액의 경계면을 확인하여, 수축기 및 이완기의 LV 전벽 두께, LV 내부 수축기말 및 이완기말 직경, 그리고 수축기 및 이완기의 LV 후벽 두께를 측정합니다. 이완기 치수는 LV 이완기 치수가 최대가 되는 시점에 측정하고, LV 수축기말 치수는 LV 후벽의 가장 전방 수축기 이동이 끝나는 시점에 측정합니다. 터치스크린에서 분석 아이콘을 누른 다음 LVAWd 아이콘을 누릅니다.이완기에 우심실강과 좌심실 전벽 사이의 경계면에 전자 캘리퍼를 배치합니다. 다음으로, 좌심실 전벽과 좌심실강 사이의 경계면에 전자 캘리퍼를 배치하여 좌심실 이완기 전벽 두께를 측정합니다. 좌심실강과 좌심실 후벽 사이의 경계면에 캘리퍼를 배치하여 좌심실 이완기 내부 직경을 측정합니다.LV 이완기 후벽 두께를 측정하기 위해 캘리퍼를 LV 후벽과 심낭 사이의 경계면에 위치시킵니다. LV 수축기 치수를 측정하려면 터치스크린의 LVAWs 아이콘을 누르고, 수축기에 전자 캘리퍼를 우심실강과 LV 전벽 사이의 경계면에 위치시킵니다. 전자 캘리퍼를 LV 전벽과 LV 강 사이의 경계면에 위치시켜 LV 수축기 전벽 두께를 측정합니다.LV 강(cavity)과 LV 후벽 사이의 경계면에 캘리퍼를 배치하여 LV 내부 및 수축기 직경을 측정합니다. LV 후벽과 심낭 사이의 경계면에 캘리퍼를 배치하여 LV 수축기 후벽 두께를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 희생시킨 후 체중을 측정합니다.그 다음 70% 알코올 솜을 사용하여 흉부와 복부를 소독합니다. 흉골에서 말단 방향으로 1cm 떨어진 피부에 가로 절개를 가합니다. 이어서 둔단 핀셋을 사용하여 흉부의 피부를 머리 방향으로 제거합니다.미세 핀셋으로 흉골을 가볍게 잡고, 미세 가위의 뭉툭한 끝부분을 삽입하여 횡격막을 엽니다. 흉골과 평행하게 양측 늑골을 절개합니다. 그런 다음 흉골을 머리 방향으로 이동시킵니다.흉강 내에서 심장의 위치를 확인합니다. 미세 핀셋으로 심장의 혈관 줄기를 잡고, 미세 가위를 사용하여 장기 하단을 절단합니다. 그 후 심장 무게를 측정하여 심장-체중 비율을 산출합니다.심장을 15 mL 튜브에 담긴 2 mL의 10% 중성 완충 포르말린 용액으로 옮기고 4 °C에서 하룻밤 동안 고정합니다. Wheat Germ Agglutinin 또는 WGA 염색을 수행하려면, 미리 준비한 슬라이드를 Tetramethylrhodamine 결합 WGA에 넣고 습윤 챔버 내 실온에서 60분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 샘플을 5분씩 3회 세척합니다.그런 다음 DAPI가 포함된 형광 마운팅 매질을 사용하여 절편을 마운팅합니다. 분석 전까지 4 °C의 암소에 보관하십시오. 이러한 대표적인 심초음파 기록은 유전자 변형 마우스의 심장 표현형을 식별하는 데 있어 심초음파 검사의 유용성을 보여줍니다.정상적인 심장 기능을 가진 마우스와 좌심실(LV)이 확장되어 LV 기능이 저하된 동물 사이의 차이는 쉽게 식별할 수 있습니다. 여기에서는 H&E 염색된 파라핀 심장 절편과 심장 조직의 종단면 측정을 통해, 심비대증이 없는 동물과 있는 동물의 심근세포 직경 측정값을 비교하여 보여줍니다. 이 그림은 대조군 마우스와 심비대증 동물의 심장에서 얻은 WGA 염색 파라핀 절편을 이용한 심근세포 횡단 직경 측정 과정을 나타냅니다.이 패널들은 정상 심장 조직과 혈관 신생이 증가한 심장의 혈관 밀도를 결정하기 위한 심장 절편의 PECAM1 면역조직화학 염색의 유용성을 보여줍니다.

echocardiographic-histological-examination-cardiac-morphology

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Transthoracic echocardiography는 생쥐에서 심장 기능의 평가에 대한 비침 투 방법을 제공합니다. 초음파 및 도플러 영상 modalities의 조합이 심장과 함께 심장 수축기 및 diastolic 성능 평가를 제공 intracardiac 혈액 흐름의 차원 측정을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스에 Transthoracic Echocardiography

이 동영상은 anesthetized 마우스 echocardiography을 수행하는 레일 마운트 고주파 초음파 프로브의 사용을 보여줍니다. 방법은 컬러 도플러, 스트레인 분석뿐만 아니라 일반 목표 대비 이미징과 같은 새로운,보다 강력한 도구 이외에도 심장 기능을 모두 종래의 2 차원 및 M 모드 측정을 설명합니다.

Murine Echocardiography 및 초음파 이미징

이 비디오는 실험실 마우스에서 심장 초음파를 수행하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

마우스 심초음파: 심장 형태를 평가하기 위한 비침습적 기법

이 문서에서는 우심실의 크기와 생쥐의 폐 고혈압의 심 초음파 평가를위한 프로토콜을 제공합니다. 응용 프로그램은 유전자 변형과 심장 근육 병증 및 폐 혈관 질환의 독소 유발 마우스 모델에서 표현형 결정 및 직렬 평가를 포함.

마우스의 오른쪽 심장의 심 초음파 평가

이 프로토콜의 목적은 비 침습적 및 M B- 모드 초음파 심장 검진 및 컬러 / 맥파 도플러 촬상을 이용하여 횡 대동맥 수축에 의해 생성 된 심장 질환의 마우스 모델에서 심장 구조적 및 기능적 변화를 평가하는 것이다.

심 초음파 이미징에 의해 가로 대동맥 수축의 마우스 모델에서 심장 형태 학적 평가 및 기능 변경

이 프로토콜은 마우스의 심장 및 심장 판막 기능의 포괄적인 표현형을 위한 심초음파 접근 방식에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

마우스의 심장 판막 질환의 종합 표현형 특성에 대한 심 초음파 접근 및 프로토콜

다음 프로토콜은 마우스의 왼쪽 심방 볼륨 (LAV), 대동맥 (아오) 직경 및 폐 동맥 (PA) 직경을 얻기 위해 사용 심 초음파 이미지의 수집 및 분석을위한 방법을 설명합니다. 이 기술은 심폐 기능 평가를 할 수있는 비 침습적 비 단자 절차이다.

왼쪽 아트리움, 대동맥과 폐동맥의 쥐 심 초음파

여기서 우리는 마우스에서 정점 4 챔버 뷰를 얻기 위한 두 위치를 설명하고 비교한다. 이러한 위치는 우심실 기능의 정량화를 가능하게 하고, 비교 가능한 결과를 제공하며, 상호 교환적으로 사용될 수 있습니다.

마우스의 우심실 확장기 매개변수의 심초음파 측정

이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

본 프로토콜은 7일령 신생아 마우스에서 좌심실 형태, 기능, 및 관상동맥 혈류의 심초음파학적 평가를 기술한다.

신생아 마우스의 좌심실 구조, 기능 및 관상 동맥 흐름의 심 초음파 특성

이 기사에서는 태아 심 초음파, 부검 및 episcopic confocal 현미경 (ECM)을 사용한 episcopic 형광 이미지 캡처 (EFIC)를 사용한 쥐 선천성 심장병 (CHD) 진단 방법에 대해 자세히 설명합니다.

태아 마우스의 구조적 심장 결함을 특성화하는 파이프라인

배우세요 마우스 심장 형태학을 평가하는 경제적인 심장초음파 및 조직학 분석 방법을. 이 프로토콜은 다양한 형질전환 마우스 모델에서 심장 기능과 형태를 정밀하게 측정하여 연구자들에게 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

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