Name: 혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 혈액뇌장벽 메쉬 형성 및 분열을 평가하는 in vitro 시험법을 통해 질병 관련 과정의 역할을 규명하고 잠재적 치료제를 테스트하는 방법을 알아보세요.

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레온 타이 (Leon Tai)는 일리노이 대학 시카고 스타트 업 펀드가 자금을 지원합니다.

모든 실험은 시카고 기관 동물 관리 및 사용위원회의 일리노이 대학 (University of Illinois)을 따른다. 1. 일반 준비 참고 : 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)는 광범위하게 특성화 된 불멸화 인간 BEC 라인 14 , 15 , 16 , 18 , 19 입니다. 기저 내피 성장 기초 배지에서 콜라겐 유형 I (종아리 피부, 칼슘 2 + 및 Mg 2+를 함유 한 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 0.1 % 솔루션의 1:20 희석)로 코팅 조직 배양 플라스크에 hCMEC / D3 세포를 문화 (FBS), 10 % 아스 코르 빈산, 10 % 겐타 마이신 설페이트, 25 % 하이드로 코티 존 및 공급 된 성장 인자 보충제의 총량의 1/4을 포함하는 배양액 (EBM-2) 혈관 내피 세포(VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 사람의 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF)와 관련이있다. 참고 : FBS 및 성장 인자가있는 EBM-2 배지를 &quot;EBM-2 complete&quot;라고합니다. FBS와 보충제가없는 EBM-2는 &quot;EBM-2 basal&quot;이라고합니다. 완전한 합류점에서, hCMEC / D3 세포는 ~ 1 x 105cells / cm2이다. <ol><li> 5 분 동안 5 ML 트립신 / EDTA (0.25 %)와 분리 후 칼슘 2 + 및 MG 2 + 없이 3 분 먼저 HBSS와 incubating하여 1시 5 분의 비율로 hCMEC / D3 세포를 통과. EBM - 2 완료 (1시 1 분 중화)를 사용하여 트립신을 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 290 XG에서 원심 분리하십시오; 상등액을 버린다. 펠렛을 EBM - 2 완료 및 1시 5 분 비율로 다시 접시에 Resuspend. </li><li> 공급 업체의 프로토콜 [ Table of Materials ]에 따라 주요 인간의 혈관 주위 세포 및 성상 교세포를 배양합니다. 문화FBS와 pericyte 성장 보충을 가진 pericyte 기본적인 매체에있는 pericytes. </li><li> 성상 세포 성장 인자를 함유 한 성상 세포에서의 인간 성상 세포 배양. 세포 부착을위한 폴리 -L- 라이신 (PLL) 3 ML로 코팅 조직 배양 플라스크의 pericytes과 astrocytes 모두 문화와 통로 2와 5 사이의 세포를 활용하십시오. </li><li> 7 마리의 마우스를 안락사시키고 포셉으로 뇌간과 소뇌를 제거하십시오. 신중하게 거즈에 두뇌를 굴려하여 meninges를 분리하십시오. 멸균 면도날과 HEPES (뇌 당 5 ML)와 최소 필수 매체 (MEM) 페트리 접시에 남아있는 뇌 조직을 말하다. 참조 된 프로토콜 20 에 따라 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 기본 마우스 BEC를 분리합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 다진 뇌 조직을 전송합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 290 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 제거하고 papain (뇌 당 833.33 μL)과 DNase (뇌 당 41.7 μL)에 조직을 품어용액을 37 ° C 수 욕조에서 1 시간 동안 처리하여 조직을 소화시킨다. </li><li> 19 및 21 게이지 바늘을 통해 균질 물을 순차적으로 분쇄하고 22 % Bovine Serum Albumin (BSA) 용액으로 1 : 1 비율로 혼합하고 4 ℃에서 10 분 동안 1360 xg에서 원심 분리하십시오. </li><li> 4 ML에서 5 분 290 XG에서 1 ML EBM - 2 완료 및 원심 분리기에서 결과 펠렛을 Resuspend ° C. 다시 1 ML EBM - 2에 Resuspend 및 콜라겐 (우물 당 ~ 1 두뇌)로 코팅 6 잘 접시에 세포 (1 ML / 잘) 판. </li><li> 24 시간 후 4 μg / mL 퓨로 마이신 하이드로 클로라이드가 함유 된 EBM-2 완충액으로 배지를 교체하십시오. 2 일 후에 EBM-2로 교체하십시오. 1 차 BEC는 hCMEC / D3 세포와 마찬가지로 배양되고 1 x 105 세포 / cm2에서 완전히 합류한다. </li><li> 분석 전 24 시간 동안 oAβ 100 μM을 준비하십시오. 참고 : oAβ는 A의 질병 관련 형태로 간주됩니다. oAβ의 경우, Dahlgren et al. 21 . </li><li> 튜브 당 140 μL 지하 막에서 살균 PCR 튜브 스트립 (8 튜브)로 4 ° C 및 나누어지는에서 하룻밤 지하 멤브레인 주식 솔루션을 해동. -20 ° C에서 각 스트립 및 저장소를 재 윤활하십시오. 분석 4 시간 전에 96- 웰 플레이트 당 1 개의 스트립을 해동 (24 시간). 응고를 피하려면 피펫 팁을 미리 냉각하십시오. 참고 : 신속한 응고를 피하기 위해 기저막 매트릭스의 모든 취급은 얼음에서 수행해야합니다. 분석 당일 10 μL의 기저막이 사용되므로 각 스트립은 하나의 96- 웰 플레이트에 충분합니다. </li><li> 분석 전 24 시간 동안 EBM-2 기저부에서 완전히 융합하는 BEC를 배양하십시오. 참고 : 이론적 근거는 다음과 같습니다. EBM-2 complete는 보충 인자와 FBS가 최적의 세포 성장을 촉진 할 목적으로 포함되어 있습니다. 그러나, 세포 성장을 촉진하는 동일한 분자 경로는 뇌 내피 세포 커버 리지 및 역학에있어서, 존재 및 아울러 모두 중요하다스트레스 원의 nce. 따라서 우리는 혈청과 보충제가 세포 신호 전달 경로의 잔류 활성화의 교란 효과를 줄이기 위해 BEC를 굶어 죽인다. 주목할 것은, 세포는 분석 전에 트립신 처리 된 세포의 중화 동안 FBS에 간단히 노출된다 (5 분). BECs와는 달리, 혈장 기아에 대한 반응으로 이들 세포 유형의 성장 및 상대적 불안정성 (타이 실험실, 미발표 관측)에 대한 상이한 요인의 요구 때문에 혈관 주위 세포 및 성상 교세포는 혈청이 굶어지지 않는다. 참고 : EBM - 2 기초는 단일 및 삼중 문화 meshwork 형성 및 중단 assays에 대한 분석하는 동안 활용됩니다. 이것은 스트레스 요인이나 치료에 의존하는 신호 전달을 막는 데 중요합니다. </li></ol> 2. Meshwork와 같은 형성 및 파괴 Assays <ol><li> 단일 BEC 배양 검사 : 참고 : BEC의 단일 문화에 대한 세 가지 패러다임은 그림 1A에 표시됩니다 </strong&gt;. 각 패러다임은 서로 다른 선박 적용 모델에서 BEC의 반응을 평가하도록 설계되었습니다. 패러다임 1은 망사 형성이다. 이 패러다임은 혈관 신생 및 망막 형성에 대한 스트레스 요인 및 / 또는 치료의 영향을 조사하기 위해 고안되었습니다. BECs, oAβ 및 처리제는 모두 0 시간 시점에서 플레이트에 첨가된다. 패러다임 2는 망사 방해를 방지합니다. 세포를 성장 인자 또는 약물의 존재하에 도금하고 4 시간 동안 배양하여 망사 형 구조를 형성시켰다. 이 경우 스트레스 요인 인 oAβ가 4 시간 후에 첨가됩니다. 이 패러다임은 미리 형성된 망사 형 구조물에 대한 스트레스 요인에 의한 손상을 방지하기위한 치료의 능력을 평가합니다. 패러다임 3은 망사 혼란을 동시에 처리합니다. 세포를 플레이 팅하고 4 시간 동안 망사 형 구조물을 형성하도록 허용한다. 이어서, 처리 및 oAβ를 4 시간 시점에서 동시에 첨가하여, 예비 처리 된 세포 네트워크가 다양한 치료에 반응하는 능력을 평가한다. 모든 패러다임 fo치료 추가시기의 차이를 제외하고는 비슷한 공통 단계를 거칩니다. <ol><li> 분석 당일에, 96- 웰 플레이트의 바닥에 10 μL / 웰의 기저막 매트릭스를 피펫 팅하고 37 ℃에서 1 시간 동안 세팅하도록 허용한다. </li><li> 10 MM 스톡 용액을 생성하기 위해 10 μL DMSO에서 동결 건조 녹색 세포 추적 염료 ( 자료 표 참조)를 일시 중지하고 EBM - 2 기저부에서 10 μM (1 : 1000)로 희석합니다. 완전히 합류 플라스크에서 미디어를 제거하고 녹색 세포 추적 염료 (75cm 2 플라스크 5 ML)를 포함하는 EBM - 2 기초로 바꿉니다. 분석 시작 20 분 전에 BEC에 녹색 세포 추적 염료를 미리 담그십시오. </li><li> 37에서 20-30 분 동안 세포를 품어 ° C, 세포 추적 염료와 매체를 제거하고 단계 1.1에서 설명한대로 세포를 분리하십시오. 10 % FBS를 포함하는 EBM - 2로 매체를 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 240 XG에서 원심 분리하십시오. 펠렛을 1 ML의 EBM - 2 기저부에 Resuspend. </li><li> EBM - 2 기초 (모든 패러다임에서 0 시간 시점)에서 10,000 세포 / 잘에서 96 - 웰 플레이트에 BECs를 판다. 참고 : 활용되는 패러다임에 따라 치료, 스트레스 요인 또는 차량 컨트롤이 지정된 시점에 추가됩니다. 모든 패러다임에서, 배지는 후속 분석 ( 예 : ELISA 분석)을 위해 수확하고 인산 완충 혈청 (PBS)에서 새로 준비한 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 24 시간 고정합니다. 메쉬 형성에 대한 oAβ의 효과를 결정하기위한 또 다른 접근 방법으로 프로토콜을 수정하여 컨 플루 언트 세포 배양 플라스크에 oAβ를 미리 배양 한 다음 망사 형성 패러다임 (+/- oAβ)을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 모든 패러다임에 대한 각 웰의 최종 부피는 70 μL입니다. 모든 치료 (oAβ, EGF 등 )는 1:20 희석, 즉 치료 당 3.5 μL에서 각각의 우물에 첨가됩니다. 패러다임 1의 경우, 세포를 63 μL / w의 세포 현탁 용액에 넣습니다엘. 즉시 oAβ, 원하는 치료법 및 대조군을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 패러다임 2의 경우, 세포 현탁액 63 μL 및 치료 3.5 μL ( 예 : 100 ng / mL EGF)를 0 시간 시점에 추가합니다. 4 시간 배양 한 후, 3.5 μL의 oAβ 스톡을 첨가한다 ( 예 : 100 nM 최종 oAβ 농도, 3.5 μL의 2 μM oAβ 스톡). Paradigm 3의 경우, 세포 현탁액 63 μL를 0 시간 시점에서 첨가하고 4 시간 후 oAβ와 원하는 치료법을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 이 부피는 치료법에 따라 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 단 한 번의 치료가 필요한 경우 세포 현탁액을 66.5 μL (10,000 세포 / 웰을 유지)로 조절할 수 있으며 치료 용량은 3.5 μL로 유지 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 삼중 배양 분석 : 참고 : BEC의 단일 배양 검사뿐만 아니라,( 예 : oAβ)에 대한 예비 형성된 네트워크 내의 BECs, 혈관 주위 세포 및 성상 세포의 반응을 결정하기 위해 triple culture assay 패러다임 ( 그림 1B )을 개발했다. BEC는 0 시간에서 원하는 치료가있는 상태에서 도금됩니다. 4 시간 후, 혈장 주위 세포를 부드럽게 플레이트에 첨가 하였다. 7 시간에, 성상 교세포를 플레이트에 첨가 한 다음, 11 시간에 스트레스 인자를 첨가 하였다. 세포를 24 시간 시점까지 배양한다. 참고 : 3 배 배양 검사의 경우 모든 세포가 동시에 융합되도록 타이밍을 고려하는 것이 중요합니다. 인간의 성상 세포 및 혈관 주위 세포는 분석 1 주 전에 배양해야하며, hCMEC / D3 세포는 분석 일 4 ~ 5 일 전에 도금 또는 계대해야합니다. 또한, 표현형 표류를 피하기 위해 낮은 통과 (2-5) 기본 세포를 사용하는 것이 중요합니다. <ol><li> 분석을 시작하기 전에 hCMEC / D3 세포에 녹색 세포 추적 염료 작동 솔루션을 20 분 추가합니다. 10시 hCMEC / D3 세포를 플레이트, EBM-2 기초 (0 시간 시점)에서 000 세포 / 웰. 사용 된 부피는 세포 현탁액 45 μL와 치료 3.5 μL입니다 ( 즉, 최종 EGF 농도 50 ng / mL, 100 ng / mL 또는 20 배 이상 농축 된 스톡에서 1,000 ng / mL). </li><li> 37 ° C에서 3.5 시간 보육 다음, 인간의 기본 혈관 주위 세포에 파란색 셀 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μM 세포 추적기 파란색)을 추가합니다. 4 시간 시점 (세포 추적 염료와 함께 ~ 30 분 보육)에서 6 μL / 잘 볼륨 hCMEC / D3을 포함하는 플레이트에 2,000 pericytes / 잘 추가합니다. </li><li> 추가 2.5 시간 부화 (0 시간 시점에서 총 6.5 시간) 후, 인간의 기본 astrocytes에 오렌지 세포 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μm의 세포 추적기 오렌지)를 추가합니다. 7 시간 시점에서, 부드럽게 12 μL 볼륨에 접시에 10,000 astrocytes를 추가합니다. 따라서, 내피 세포에 대한 전체 세포 비율 : pericytes : astrocytes 내가s 5 : 1 : 5. 또한이 지점까지 도달 한 양은 66.5 μL입니다. </li><li> 4 시간 후 (0 시간 시점에서 총 11 시간) oAβ (100μM 스톡 3.5μL)를 첨가한다. </li><li> PBS에서 갓 준비한 4 % paraformaldehyde에서 13 시간 후 세포를 고정합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드를 취급하는 동안 보호 복, 장갑 및 안경을 착용하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 정량화 <ol><li> 해부 현미경을 사용하여 50 % 최대 전력에서 2 초 노출 시간과 1.6X 배율에서 96 - 웰 플레이트의 전체 우물의 형광 이미지를 캡처합니다. 참고 : 동등한 현미경을 사용할 수 있습니다. 그러나 포괄적 인 분석을 위해 전체 우물을 포획하는 것이 중요합니다. </li><li> 정량 분석을 위해 ImageJ 혈관 신생 분석기 플러그인 22 를 사용하여 이미지를 처리하여 분기 수, 메시 수 및 총 셀 길이를 계량합니다 (이 판독 값은 소프트웨re). 이 단계의 상세한 시각적 프로토콜은 그림 2에 나와 있습니다. <ol><li> 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 피지 ImageJ를 엽니 다. </li><li> 툴바의 끝에있는 두 개의 빨간색 화살표를 클릭하고 &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 이미지 파일이있는 폴더를 선택하고 &quot;열기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> &quot;분석 설정&quot;상자가 나타나면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 처리 할 이미지 수를 나타내는 &quot;이미지 처리 중&quot;상자가 나타나면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 예상 처리 시간을 나타내는 &quot;일괄 진행 창&quot;상자가 나타납니다. 이 시간 동안 프로그램은 분기 수, 메쉬 수 및 전체 셀 길이를 포함한 출력을 계량합니다. 참고 : 모든 이미지가 정량화되면 결과 파일이 원본 이미지 폴더에 스프레드 시트 문서로 나타납니다. </li><li> 고르다스프레드 시트 파일에는 결과가 포함되어 있으며 그룹간에 분기, 메쉬 및 총 셀 길이의 수를 비교합니다. 참고 : Triple culture assay에서 ImageJ는 pericyte / astrocyte 적용 범위와 수를 분석하기 위해 추가로 활용됩니다. 맹인 실험자가 임계 값을 설정하고 판독 값을 생성하는 데 사용되는 &quot;입자 분석&quot;기능을 사용합니다. 고정 세포 및 튜브와 같은 구조는 또한 Aβ 17 또는 다른 마커에 대해 면역 염색 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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기술 된 방법은 뇌 혈관 커버리지를 둘러싼 몇 가지 근본적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있다. 구체적으로, 그들은 수용체 및 신호 전달 경로가 혈관 신생, 암 조직에서의 혈관 확장 및 뇌와 관련된 말초 내피 세포에서 역할을하는지 확인할 수있다. 예를 들면, 혈관 신생 성장 인자 수용체, 산화 질소, 마이 토겐 활성화 단백질 키나아제 신호 전달 및 칼슘 신호 전달 25,26,27이 있습니다. hCMEC / D3 및 기본 BEC는 이러한 노력을 용이하게하는 유전자 조작 방법으로 개정 할 수있다. 기계적 통찰력은 설명 된 방법으로 핵심 단백질의 전체 또는 내피 세포 특이 적 knockdown과 생쥐에서 격리 BECs를 배양에서 얻을 수 있습니다. 또한, 삼중 배양 분석을 통해 성상 세포와 혈관 주위 세포의 영향을 심층적으로 분석 할 수 있습니다뇌 내피 세포 기능에 대한 정보. 예를 들어, 혈관 주위 세포 및 성상 교세포는 용해성 매개체 ( 예 : angiopoietin, cytokines)의 생성을 통...

<html> 대뇌 모세 혈관의 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 혈액 대 뇌 접촉의 가장 큰 경계면이며 중추 신경계 (CNS) 1 , 2 의 항상성에 중심 역할을합니다. BBB의 동적 인 과정은 혈액에서 원하지 않는 분자의 섭취를 막고, CNS에서 폐기물을 제거하고, 필수 영양소와 신호 분자를 CNS에 공급하고, 신경 염증 1 , 2 , 3 , 4 , 5를 조절 합니다. BBB 손상은 노화 및 알쯔하이머 병 (AD), 다발성 경화증 및 뇌졸중 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. 따라서 BBB 기능 장애는 치료 목표를 포함 해 신경 퇴행성 장애에 핵심적인 역할을 할 수 있습니다. 혈관 커버리지를 유지하는 것은 BBB의 항상성 기능에 중요합니다. 그러나, 생체 내 및 시험 관내 자료가 신경 퇴행성 장애에 관련된 과정이 AD에서 특히 BBB 적용 범위를 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 증가시키는 지에 대해 충돌합니다. 따라서 BBB 범위의 역학을 평가하고보다 포괄적으로 이해하기 위해 관련 세포 유형을 사용 하는 시험 관내 모델의 개발에 대한 강력한 근거가 있습니다. 대뇌 모세 혈관은 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BEC) 3 입니다. 일반적으로 BBB 기능을 평가하기위한 세포 배양 기술은 스트레스 원 14 , 15 , 16 모두를 첨가 한 후 필터 삽입물에서 키운 세포에서 수행 된 투과성 분석 또는 주요 BEC 단백질의 수준 평가입니다. 중요한 것은이 검사는 뇌 혈관 검사에 초점을 두지 않는다는 것입니다. 여기에서 우리의 이전 방법 17 은 불멸화 된 인간 BEC의 단일 배양, 일차 마우스 BEC의 단일 배양 및 인간화 된 삼중 배양을 사용하여 BEC 적용 범위 및 망사 형 구조를 평가하기 위해 상세화된다모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes) BBB. 목표는 BEC 적용 범위에서 AD 진행에 중요한 공헌자로 간주되는 oAβ의 해로운 영향을 입증하는 것이 었습니다. 표피 성장 인자 (EGF)의 보호 효과는 치료 선별 도구로서의 기술의 잠재력을 강조합니다. 이 기술은 1) 혈관 신생 및 혈관 범위에 대한 특정 경로의 역할을 묘사하는 것, 2) 혈관 신생 및 혈관 형성에 질병 및 노화 관련 요인의 영향을 평가하는 것, 3) 약리학 적 특성을 확인하는 것 목표.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 세포</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 기저 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 ThermoFisher</td><td></td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>없음 ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>EBM2 매체에 대한 SingleQuot 성장 인자 보충제의 최종 농도</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% 아스코르빈산</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% 겐타마이신 황산염</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% 하이드로코르티손</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>공급 성장 인자의 1/4 부피 : 섬유 아세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain 세포 해리 시스템 (파파인 및 DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte 성장 보조제</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>기저막(Matrigel 성장 인자 감소)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 주황색</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 블루</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>폴리-l-라이신</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>시그마-알드리치</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>및</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 스트립</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 스테레오 디스커버 v.8 해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 in vitro 시험 법

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) ​​범위는 중추 신경계 (CNS)의 항상성에 중요한 역할을합니다. BBB는 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BECs)에 의해 동적으로 유지됩니다. 여기, 우리는 불멸의 인간 BEC의 단일 문화, 기본 마우스 BEC의 단일 문화, BBB의 인간화 트리플 문화 모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes)를 사용하여 BBB 범위를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다. 질병 상태에 대한 분석법의 적용 가능성을 강조하기 위해 우리는 BBB 적용 범위에서 알츠하이머 병 (AD) 진행에 중요한 기여를하는 oligomeric amyloid-β (oAβ)의 효과에 대해 설명합니다. 또한 우리는이 기술의 약물 스크리닝 가능성을 조명하기 위해 표피 성장 인자 (EGF)를 이용합니다. 우리의 결과는 단일 및 삼중 배양 BECs은 기초 조건 하에서 meshwork와 같은 구조를 형성하고, oAβ는이 세포 망 조직 형성을 방해하고 예비 형성된 메쉬 구조를 퇴화시키고,EGF는 이러한 혼란을 차단합니다. 따라서 기술 된 기술은 BBB 적용 범위를 조절하는 근본적이고 질병 관련 프로세스를 해부하는 데 중요합니다.

단일 문화에서는 hCMEC / D3 세포 ( 그림 3A )와 기본 마우스 BEC ( 그림 3B ) 모두 우물 전체에 망사 모양의 구조를 형성합니다. 구조는 상호 연결된 노드들의 망목을 특징으로합니다 ( 그림 3 ). 설명 된 모든 패러다임 ( 그림 1 )에서, meshwork와 같은 구조는 24 시간 후 대조군에서 유사하여 총 세포 길이가 ~ 10,000 픽셀 인 ~ 20 meshwork와 유사한 구조를 형성합니다. 질병 관련 스트레스 요인에 대한이 방법의 적용 가능성을 강조하기 위해 hAAβ가 hCMEC / D3 및 일차 마우스 BEC에 두 가지 ...

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

본 분석의 목적은 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 피복 파괴에서 질병 관련 프로세스의 역할을 분석하고, 근본적인 메커니즘을 규명하며, 잠재적 치료법을 in vitro에서 테스트하는 것입니다. 이 방법은 혈뇌장벽 및 신경 퇴행 분야의 핵심적인 기초 및 응용 연구 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 질병 관련 스트레스가 미리 형성된 네트워크 구조를 파괴하는지 여부를 확인하고 그 근저에 있는 경로를 규명함으로써 가능합니다. 추가 스크리닝을 통해 스트레스로 인한 혈뇌장벽 파괴를 방지하는 치료법을 찾아내어 향후 in vivo 테스트에 활용할 수 있습니다. 인지 기능에 있어 혈뇌장벽의 항상성 유지 기능이 중요하므로, 이 기술의 함의는 알츠하이머병의 메커니즘 이해 및 치료로 확장됩니다. 이 방법은 알츠하이머병의 혈뇌장벽 기능 장애에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 뇌졸중과 같이 혈뇌장벽 기능 장애를 동반하는 다른 신경 퇴행성 질환에도 적용될 수 있습니다. 먼저 hCMEC/D3 불멸화 내피 세포 시트를 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS로 3분간 배양하여 1:5 비율로 계대 배양을 시작합니다. 그다음 0.25% trypsin EDTA 5mL를 사용하여 5분 동안 세포를 탈착합니다. 5mL의 EBM-2 완전 배지를 추가하여 trypsin을 중화합니다. 세포를 수집하고 4°C에서 290 ×g로 5분간 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 EBM-2 완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 1:5 비율로 다시 플레이팅합니다. 마우스 뇌에서 내피 세포를 준비하려면, 안락사시킨 마우스 7마리에서 핀셋으로 뇌간과 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 거즈 위에 뇌를 조심스럽게 굴려 뇌막을 제거합니다. 이어서 뇌 조직을 HEPES가 포함된 최소 필수 배지가 담긴 페트리 접시에 넣고, 멸균 면도날을 사용하여 남은 뇌 조직을 잘게 다집니다. 다진 뇌 조직을 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그리고 4°C에서 290 ×g로 5분간 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후 papain 및 DNase 용액을 추가하고, 37°C 항온 수조에서 1시간 동안 배양하여 조직을 소화시킵니다. 배양 후 19게이지 바늘과 21게이지 바늘을 사용하여 균질물을 마쇄합니다. 마쇄가 끝나면 22% bovine serum albumin 용액을 1부피 추가합니다. 그런 다음 4°C에서 1,360 ×g로 10분간 원심 분리합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 플루오레세인나트륨 분자를 사용하여 체외 혈액-뇌 장벽의 투과성을 평가하기 위한 투과성 분석에 대해 설명합니다.

Blood-Brain Barrier 모방 투과성 분석: 추적자 분자에 대한 BBB 모방의 투과성을 평가하기 위한 체외 분석

이 비디오는 in vitro에서 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포에서 경내피 전기 저항(TEER)을 평가하는 방법을 보여줍니다. TEER 값이 높으면 내피 세포 접합이 손상되지 않았음을 나타내고, 활성화된 T 세포가 추가되면 TEER 값이 낮아져 접합 장벽의 파괴를 반영합니다.

In Vitro Blood-Brain barrier 모델에서 경내피 전기 저항 평가

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

이 프로토콜은 카베올라 매개 세포 횡단 수송 과정에서 세포를 가로질러 양 고추냉이 과산화 효소를 운반하는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포의 능력을 측정하여 내부 혈액 망막 장벽 투과성을 평가하는 모델로서 시험관 내 내피 세포 트랜스사이토시스 분석을 보여줍니다.

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

배우세요 혈액뇌장벽 메쉬 형성 및 분열을 평가하는 in vitro 시험법을 통해 질병 관련 과정의 역할을 규명하고 잠재적 치료제를 테스트하는 방법을 알아보세요.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

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