3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

본 프로토콜은 인 비트로(in vitro) 신경 생물학적 모델 또는 신경 재생 치료제로 사용하기 위해, 마이크론 크기의 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 종방향으로 정렬된 성상교세포 세포체와 돌기의 자가 조립된 3차원 번들을 제작하는 방법을 안내하는 것을 목적으로 합니다. 외상 및 신경 퇴행성 질환은 중추신경계 내의 재생을 제한하는 억제성 환경으로 인해 신경 발생 능력이 제한되어 환자에게 특히 치명적입니다. 공학적으로 설계된 성상교세포 번들은 주요 신경해부학적 특징과 글리아(glia) 매개 발달 기전을 재현하여 표적 세포 이동 및 축삭 경로 탐색을 촉진함으로써 현재의 치료 전략이 가진 한계를 해결하고자 합니다.

이 성상교세포 스캐폴드의 구조는 주로 로스트랄 이동 경로(rostral migratory stream)의 글리아 튜브 내에 정렬된 성상교세포 돌기에서 영감을 얻었습니다. 먼저 멸균 비커에 3% w/v agarose 용액과 DPBS를 준비하십시오. 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하기 위해 가열 및 교반 상태를 유지하십시오.

벌브 디스펜서의 하단 개구부에 침술용 바늘을 삽입합니다. 노출된 바늘 위에 모세관을 배치하고, 모세관의 일부를 벌브 디스펜서 실린더의 고무 섹션에 끼워 두 장치를 고정합니다. 실린더의 캡을 닫아 조립을 완료합니다.

1 mL의 액체 아가로스를 빈 페트리 접시 표면에 옮깁니다. 벌브 디스펜서의 고무 캡을 꼬집은 상태에서 모세관의 한쪽 끝을 아가로스에 넣고, 캡의 압력을 풀어 아가로스가 관 안으로 빨려 들어가게 합니다. 벌브, 튜브, 바늘 조립체를 페트리 접시 위에 놓고 모세관 내부의 아가로스가 5분 동안 응고되도록 둡니다.

그런 다음, 마이크로 컬럼이 여전히 바늘을 감싸고 있는 상태에서 바늘을 모세관 튜브에서 뽑아냅니다. 포셉 끝을 사용하여 마이크로 컬럼을 바늘 끝으로 밀어낸 후, 바늘을 DPBS가 담긴 열린 페트리 접시 위에 대고 마이크로 컬럼을 DPBS 안으로 밀어 넣습니다. 이러한 구조물의 이후 취급을 용이하게 하는 마이크로 컬럼 보트를 제작하려면, 먼저 4% weight per volume 아가로스 용액을 만들고 용액을 가열하며 교반 상태로 유지하십시오.

핀셋을 사용하여 마이크로 컬럼을 빈 페트리 접시에 옮깁니다. 그다음, 실체 현미경 하에서 마이크로 메스로 마이크로 컬럼의 끝부분을 45도 각도로 잘라 원하는 길이로 다듬습니다. 세 개의 마이크로 컬럼을 더 다듬은 후, 네 개의 컬럼을 나란히 정렬합니다.

피펫에 4% agarose 용액 50 µL를 취하여, 마이크로 컬럼 어레이 위에 액체 선을 분사해 구조체들을 연결하여 하나의 보트 형태로 묶어줍니다. 4% agarose가 겔화될 수 있도록 1~2분 동안 냉각시킵니다. 그 다음 정밀 핀셋을 사용하여 연결된 agarose 브릿지 부분을 잡아 마이크로 컬럼 보트를 들어 올립니다.

그리고 이를 DPBS가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. 마이크로 컬럼 보트를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮기고 30분 동안 자외선에 노출시켜 멸균합니다. 생물안전작업대 내부에서 공배양 배지에 rat tail type 1 collagen을 1 mg/mL 농도로 용해하여 준비합니다.

그런 다음 얼음에 놓습니다. ECM 용액의 pH가 7.2에서 7.4 범위 내에서 안정될 때까지 필요에 따라 산 또는 염기를 사용하여 pH를 조정합니다. 핀셋을 사용하여 마이크로 컬럼 보트를 35 또는 60 mL 페트리 접시에 옮깁니다.

실체 현미경을 사용하여 안내하며, 마이크로 파이펫의 10 mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 위치시키고 흡입하여 루멘 내부의 DPBS와 기포를 제거합니다. P10 마이크로 파이펫에 콜라겐 용액을 채웁니다. 10 mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 밀착시키고, 루멘을 채울 만큼의 용액을 주입합니다.

그런 다음 마이크로 컬럼의 양 끝에 ECM 저장소를 피펫으로 분주합니다. 모든 컬럼이 채워지면, 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위해 페트리 접시 가장자리를 따라 고리 모양으로 공동 배양 배지를 피펫으로 분주합니다. 세포를 추가하기 전 콜라겐의 중합 반응을 촉진하기 위해 마이크로 컬럼이 담긴 접시를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

그 후, P10 마이크로피펫의 팁을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 대고 약 5 mL의 세포 용액을 루멘으로 옮겨 채웁니다. 모든 마이크로 컬럼을 보트에 안착시킨 후, 성상교세포가 ECM에 부착되도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면, 마이크로 컬럼이 안착된 배양 접시에 35 mL 또는 60 mL 페트리 접시 기준에 따라 각각 3 mL 또는 6 mL의 공배양 배지를 조심스럽게 채웁니다.

플레이팅된 마이크로 컬럼과 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 유지하여 성상교세포 다발의 정렬된 자기 조립을 촉진하며, 6~10시간 후에는 다발 형태의 케이블 유사 구조가 형성되어야 합니다. 플레이팅 1시간 후 성상교세포는 구형이며 구조물 전체에 분산되어 있습니다. 플레이팅 5시간 후부터 성상교세포는 돌기 신장 및 수축을 시작합니다.

세포 도말 8시간 후, 성상교세포가 정렬되고 수축되었습니다. 본 예시에서는 도말 24시간 후에 성상교세포 돌기의 조밀한 다발이 형성되었습니다. 도말 24시간 후 완전히 형성된 이 성상교세포 다발은 케이블의 끝단이 루멘 벽의 서로 다른 끝단에 부착되는 지퍼 효과(zippering effect)를 보여줍니다.

이 영상은 세포 도말 후 3~10시간 사이에 일어나는 번들링(bundling) 과정을 보여줍니다. 성상교세포 지지체의 면역 표지는 성상교세포 돌기의 종방향 정렬을 입증합니다. 성상교세포 번들의 이 공초점 이미지에서는 성상교세포 마커인 GFAP가 읽힙니다.

그리고 핵은 파란색으로 보입니다. 다발을 더 높은 배율로 관찰하면 마이크로 컬럼 내 성상교세포의 세포 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 재료 외피 내에 생물학적 영감을 받은 세포 구조를 갖춘, 세로로 정렬된 성상교세포 다발로 구성된 살아있는 스캐폴드를 제작할 수 있게 될 것입니다.

이 절차에 따라, 신경발생 부위로부터의 지향성 세포 이동을 촉진하고 제한적 중추신경계(CNS) 미세환경에 대한 유도 작용을 수행하기 위해, 생체재료 캡슐화 여부와 관계없이 성상교세포 다발을 손상된 뇌 조직에 전달하는 이식 전략을 설계할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 천연 3차원 환경의 모사와 인비트로(in vitro) 시스템의 고유한 실험적 제어 능력을 활용하여, 글리아(glia) 매개 신경생물학적 현상을 연구하는 생체 충실도 모델링 플랫폼으로 확장될 수 있습니다.