Name: 3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 3차원 수성겔 마이크로컬럼 내에서 자가조립된 별아교세포 번들을 제작하는 방법을 통해 신경재생을 촉진하는 기술입니다. 이 프로토콜은 체외 신경생물학 모델 개발 및 축삭 경로유도 연구에 활용됩니다.

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재정 지원 건강의 국가 학회 [U01-NS094340 (컬) & F31-NS090746 (Katiyar)], 마이클 제이 폭스 재단 [치료 파이프라인 프로그램 #9998 (컬)], 펜 의학 신경 과학 센터 조종사 상 (컬 린)에 의해 제공 되었다 국립 과학 재단 [대학원 연구 장학 DGE-1321851 (Struzyna)], 재향 군인의 부서 담당 [RR & D 장점 검토 #B1097-난 (컬)], 미국 육군 의료 연구 및 물자 명령 [#W81XWH-13-207004 (컬) & W81XWH-15-1-0466 (컬)].

저자는 공개 없다.

PNS 더 지원 환경에 비해, CNS neurotrauma 및 neurodegeneration의 해로운 결과 처리에 특히 제한 됩니다. 포유류 CNS에 심각한 모욕 후 glial 흉터 형성, 분열된 반응 이다 축 삭 발전이 억제 proteoglycans14분 비의 조밀한 meshwork에 둘러싸인 거리 및 염증 세포의 핵심 구성. 이 흉터는 축 삭 엔딩12의 재생에 대 한 물리적 및 생화학 방해 역할을 합니다. 또한, 성인 포유류 CNS 복원 손실된 셀 다음 외상 또는 neurodegeneration, neurogenic 센터는 SVZ, hippocampal가 뇌와 잠재적으로 다른 일반적으로 비활성 제한 때문에 새로운 신경 세포의 제한 된 소스를가지고 지역54 이상적인 전략 주소로 현재 접근 실패 CNS의 제한 된 회복 기능의 두 측면을 우회할 것 이다. 따라서, 우리의 연구 그룹 사이토 기반 건설 기...

중앙 신경 조직 (CNS) 중화 손실 및/또는 신경의 외상 성 뇌 손상 (TBI), 같은 조건이 동반 axonal 경로 장애 제한 용량이 뇌졸중, 척수 상해 (SCI), 및 신경 퇴행 성 질병1 ,2,3,,45. CNS에 신생 방해 손실된 신경6,7의 복원, 두뇌에 있는 영역의 제한 된 수에 제한 됩니다. 또한, CNS에서 손실된 axonal 통로의 재생 감독된 지침의 부족, 파생물 억제제, 및 신경 조직2,8에 손상 다음 반응 astrogliosis의 존재 충분 하지 않습니다. 9,10. 이다는 일반적으로 이온 항상성, 신경 전달 물질 클리어런스, 시 냅 스 형성, 및11를 커플링 하는 혈관과 신경 지원에 다양 한 기능을가지고. 그럼에도 불구 하 고, 신경 조직에 가벼운 손상, 다음 이다 수 있습니다 받을 분자, 구조적, 기능적 변화 그들은11hypertrophic 상태 전환. 심한 neurotrauma에 대응, 이러한 변경 결과 흉터의 형성에 포함 된 마이그레이션 반응성 이다는 파열된 혈액-뇌 장벽 (BBB) microglia에서 유출 하는 백혈구를 포함 하는 병 변 코어 penumbra oligodendrocytes, 그리고 섬유 아 세포11,,1213. 이러한 반응성 이다 달성 filamentous, 비 조직 프로세스의 형태 그리고 중간 필 라 멘 트 단백질 및 신경 재생12방해 콘 proteoglycans (CSPGs)의 증가 식 전시. Glial 흉터 처음 BBB 무결성을 복원 하 고 건강 한 티슈를 에워싸는 것 염증 반응의 전송을 방지 하는 데 도움이, 비록 그것은 축 삭 재생12,14에 대 한 물리적 및 생화학 장벽 역 ,,1516. 예를 들어, glial 흉터 발생 axons 주먹코 dystrophic 성장 콘을 표시 하 고 성장12저하. 또한, 부상 후 astrocytic 프로세스의 해체는 축 삭17회생의 확장을 방해 한다. 이러한 억제 특성의 결과 종종 영구 신체적, 신경 장애 환자 겪는 심각한 neurotrauma, TBI 및 문화를 포함 한 후에 각 성
외부 직면 CNS 기능 재생에 축 삭 재생성 하는 본질적인 능력을가지고 표시 되었습니다. 예를 들어, glial 흉터 문의 dystrophic 성장 콘의 동적 특성 제안 이러한 엔딩 확장12하 그들의 능력을 유지 합니다. 따라서, 그것은 있다고 믿고 axonal 다시 성장에 주요 방해 후 부상 CNS와 감소 glial 흉터 및 흉터에서 재생 다리 것 제공을 통해 더 환경을 제공 하는 금지 환경 유리. 실제로, 이전 학문은 설명 했다 CNS 뉴런 축 삭 재생12,18에 대 한 더 많은 유리한 환경을 제시, 교량으로 주변 신경 이식 술을 사용 하 여 병 변을 통해 축 삭 연장 가능 했다 19. 여러 가지 다른 전략이 흔적 재생 능력을 악용 하 추구 되어 있다. 예를 들어 다양 한 부상 모델에서 세포 성장 신호 통로의 조작 axonal 재생 및 glial 흉터 감소10,,2021에 결과 있다. 또한, 연구 치료 chondroitinase CSPGs에 설탕 체인의 대부분을 앞, ABC CSPGs 반응 이다22분 비의 억제 효과 줄이는 나타났습니다. 도 불구 하 고 고무적인 결과, 이러한 방식을 벗어난 재생12, 잠재적으로 발생할 수 있습니다 하 고 또한 신경의 손실에 대 한 계정을 하지 않습니다 성장 콘의 지도 감독을 제공 하지 않습니다. 셀 기반 접근 시도 glial 흉터의 효과 극복 하 고 보충 손실된 세포, 특히 신경에 이용 되어 있다. 다른 CNS 병 변 축 삭 재생23,24, 을 추진 하 고 다시 상해 지역에 신경 조상 세포를 이식 하는 동안 일부 그룹 뉴런으로 반응 이다를 dedifferentiated는 그러나 25., 줄기 세포 이식 혼자 낮은 생존 율, 불 쌍 한 통합 및 손상 된 조직을5겸손 보존에 의해 제한 됩니다. 또한, 이러한 세포 기반 전략 제어 방식 특히 장거리 axonal 책자를 복원 실패. 따라서, 다른 접근에와 함께 바이오는 다양 한 신경에 대 한 배달 차량으로 탐험 되 고 조상 세포 및 성장 요인26. 소재 기반 접근 디자인 컨트롤 구문 특정 물리적, haptotaxic 모방 생산의 높은 학위와 대상 호스트 조직27의 3 차원 (3D) microenvironment chemotaxic 단서 제시 28,29,30,31,32,,3334. 이러한 환경 신호 복제는 네이티브 같은 형태학, 확산, 마이그레이션, 및 다른 neurobiological 특성29중 신호 이식된 세포에 대 한 최고입니다. 이러한 유리한 속성 시드 전통적인 셀 소재 건설 기계 넘어 발전은 동시에 감독된 장거리 axonal 재생을 촉진 하 고 손실 된 신경 세포를 대체 하는 데 필요한.
"생활 건설 기계", 다른 네이티브 neuroanatomy를 에뮬레이트하는 미리 형성한 cytoarchitecture와 살아있는 신경 세포의 존재로 인해 다른 셀 기반 접근을 설계 유망한 다른 접근은 신경 조직 기반 및 타겟된 교체, 개조, 및 신경 회로4,35의 재생을 촉진 하기 위하여 발달 기계 장치. 건설 기계 생활의 디자인에 대 한 고려 사항 포함 고기 그리고 신경 세포, 기계/물리 속성의 소스 및 생 화 확 적인 신호 어떤 동반 바이오35의 구성에 의해 결정. 제조 후 체 외에, 이러한 생활 건설 기계 이식 수 비보에 현재 세포 접착 분자 및 혈 및 科 신호 신경 세포 이동과 축 삭 가지 상태에 따라 적극적으로 규제를 하 고 재생의 진행35를처리합니다. Glial 세포는 이후 다양 한 개발 메커니즘에 vivo에서이 세포 중재 건설 기계 생활 설계 된 cytoarchitecture에 대 한 기준으로 사용할 수 있습니다. 두뇌 개발, 새로운 신경 세포 기저 프로세스 개발 외피 격판덮개로 심 실 영역에서 방사형 명과 감독된 마이그레이션36,37건설 기계 생활으로 확장에 의존 합니다. 또한, 콘은 도표 glial 세포, elicited 매력적이 고 구 충 제 신호를 감지 하 여 스스로 방향을 표시 하 고 소위 "개척" 축 삭 성장 확장 제안 하 고 폐해 미리 패턴을 따라 확장 하 여 올바른 목표 도달 35,,3839투어 따라서, glial 세포는 축 삭, 나중으로 축 삭을 기반으로 봉사 하는 개척의 지도에 필요한 "건설 기계 생활" "추종자" 축 삭의 투영을 직접. 또한, 명과 중재 성장 메커니즘 표시 되었습니다 유지 postnatally, neuroblasts 따라 rostral 철새 스트림 (RMS) 帯 (SVZ), 성체 뇌에서 신생의 몇 가지 남아 있는 분야 중 하나에서 탐색 하는 후 각 전구 (OB)40. RMS에서이 neuroblasts 경도 정렬 astrocytic 프로세스, 직접 셀 유착을 통해 이루어진 고 성 요인37, 지역화 glial 튜브 (그림 1A-1), 내 마이그레이션 41. 마지막으로, 포유류 원인에 CNS 손상 중단 astrocytic 프로세스 배열 axonal 재생17를 물리적으로 방해 glial 흉터를 형성 하는 동안 많은 비 포유류 시스템 부족 해로운 glial 흉터의 형성. 오히려, 비 포유류 종의 glial 세포 유지 더 조직, 부상된 지역17,,4243를 통해 가이드로 사용 되는 패턴을 정렬 합니다. 예를 들어, 비 포유류 과학 모델에서 축 삭 glial 다리 건너 기판 axonal 재생과 기능 회복 (촉진으로 조직 된 폐해 건설 기계에 대 한 중요 한 역할을 제안 하는 병 변와 가까운 협회에서 성장에 표시 됩니다. 그림 1A -2) 42 , 44 , 45. 신경 해부학 기능 및 위에서 설명한 발달/재생 메커니즘의 재현 부 동시에 미 숙 신경 마이그레이션 구동할 수 조작된 폐해-기반 생활 장비의 새로운 클래스를 얻을 수 있습니다 및 axonal 그렇지 않으면 비 허용 환경, 그로 인하여 잠재적으로 신경의 효과 완화를 통해 길 및 축 삭으로 변성 CNS 상해 및 질병과 관련 된.
연구 그룹은 이전 여러 종류의 재건을 위한 건설 기계 생활 설계 및 CNS와 말 초 신 경계 (PNS) 마이크로 조직 통해 axonal 책자의 재생 신경 네트워크 (마이크로-TENNs) 및 조직 설계 신경 이식 (TENGs), 각각27,,4647,48를 설계. 두 전략 biomimicry에 근본적으로 근거한 다. 마이크로-TENNs는 해부학 영감 구조 구조적 및 기능적으로 연결 하는 뇌의 뚜렷한 신경 인구 axonal 책자를 대체 하도록 설계 되었습니다. TENGs 축 삭 촉진 axonal 중생, 타겟된 호스트 axonal 재생35,,4648를 달성 하기 위해 "선구자" 축 삭을 따라 "추종자" 축 삭 성장에 의해 exemplified의 개발 메커니즘을 악용 합니다. 우리는 최근 생활 발판의 다양성에 대문자로 기술 개발을 통해 제시 하는 마이크로 TENNs로 비슷한 넣음 스키마를 사용 하 고 명과 기반 메커니즘에서 영감을 추구. 여기, 우리는 히드로 마이크로 열49의 collagenous 루멘에 걸친 정렬된 astrocytic 번들으로 구성 된 구조를 개발 했다. 이러한 astrocytic 생활 건설 기계 만들 해당 직경의 하는 외경 (OD) 및 내경 (ID)와 함께 빈 원통형 히드로 액체 agarose는 모 세관 튜브-침술 바늘 어셈블리를 작성 하 여 개발 되는 튜브와 바늘, 각각. Agarose 겔 화와 히드로 마이크로 열 모 세관 튜브에서 추출, 빈 내부는 유형 나 사이토 접착을 위한 관대 한 환경을 제공 하는 콜라겐 코팅 및 정렬 번들 형성 (그림 1B -1)입니다. 이후에, 루멘은 대뇌 피 질 이다 출생 후 쥐 새끼 (그림 1B-2)에서 절연 된 시드. 2 차원 (2D) 정렬 기법 (ECM) 단백질 패턴, 전기 분야, micropatterned 홈 및 세포 외 매트릭스의 응용 프로그램에 의존 하는 생활 발판에서 사이토 맞춤 반대로 기술에 의존 자기 조립 제어 변수 같은 기판 곡률 (열 ID), 셀 밀도 및 콜라겐 농도50,,5152에 따르면. 이다 계약, 콜라겐을 리 모델링 하 고 바이 폴라, 경도 정렬 형태에서 관찰 vivo에서 (그림 1B-3) 자연 건설 기계와 유사한 취득. 실제로, 우리는 적극적으로 추구 하 고이 케이블 같은 구조를 사용 하 여 미 성숙한 신경 세포 이주 특히 손상 된 CNS의 불리 한 환경을 통해 axonal 재생 촉진의 대상된 지도 대 한 실제 기판으로 포유류 glial 흉터 (그림 1C). 이 문서는 astrocytic 마이크로-열에 대 한 자세한 제작 방법을 제시, 단계 예상된 cytoarchitecture의 현재 한계에 대 한 포괄적인 토론 명암과 면역 형광 이미지 및의 미래 방향에 기술입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> 그림 1: 영감, 제조 프로토콜 및 정렬된 Astrocytic 네트워크에 대 한 제안 된 응용 프로그램. (A) Neurobiological 영감: neurogenic 帯 (SVZ)에서 발생 하는 (1) Neuroblasts 후 각 전구 (OB); 향해 감독 마이그레이션 rostral 철새 스트림 (RMS)에 경도 정렬된 glial 관 활용 (2) 비-포유류 양서류, 물고기 등 신경 조직의 병 변 (예: transected 척수)의 끝을 연결 하 고의 지도 위한 비 계 역할 glial 다리의 형성으로 인해 일부 손상 후 재생을 유지할 수 있는 축 삭 재생 (B) 제조 개요: ECM, 코팅 루멘과 미크론 크기, 빈 히드로 마이크로 열의 건설 (1) (2) 기본 외피 이다 출생 후 쥐 새끼, 경도 중심의 (3) 자기 조립에서 고립의 시드 문화와 미래 이식 연구 소재 넣음에서 번들의 (4) 추출에서의 번들 (C) vivo에서 응용 프로그램: (1) 이러한 생활 건설 기계 신경 결핍 지역; 다시 neurogenic 센터에서 감독된 신경 마이그레이션에 대 한 설계 glial 튜브 역할을 수 있습니다 (2) 축 삭 지도 개척의 발달 메커니즘 및 비 포유류에서 glial 교량의 재생 메커니즘의 재현 부 비 허가 걸쳐 축 삭 재생을 직접 수 용량을 가진이 astrocytic 건설 기계를 부여 수 있습니다. 포유류 glial 흉터의 환경입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>침 (300 &micro; m 직경)</td><td>Lhasa Medical</td><td>HS.30x40</td><td>직경은 마이크로 컬럼 루멘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Fisher</td><td>08772B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>마이크로리터 유리 모세관 (701 &micro; m)</td> <td>Fisher</td><td>21-170J</td><td>직경은 마이크로 컬럼 쉘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로캡 전구 디스펜서</td><td>Fisher</td><td>21-170J</td><td>전구는 마이크로캡 튜브와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Fisher</td><td>SP88857200</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 바</td><td>Fisher</td><td>1451352</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Sigma</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>25mm 게이지 바늘</td><td>Fisher</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6270</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>펜셉</td>스 <td>월드 정밀 기기</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>시그마</td><td>Z378550-1EA</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>니콘</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주걱</td><td>피셔</td><td>S50821</td><td></td></tr><tr><td>쥐 꼬리 타입 I 콜라겐</td><td>코닝</td><td>354236</td><td>4 &ordm에서 유지 관리; C를 선택하고 필요할 때만 제거하십시오. 사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>02-681-256</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨 (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>SS2661</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td><td>Fisher</td><td>SA48-1</td><td></td></tr><tr><td>리트머스 종이</td><td>Fisher</td><td>09-876-18</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170112</td><td>Store at 4 &ordm;C.</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>-20 &ordm에 저장합니다. C 및 37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>소 췌장 데옥시리보뉴클레아제(Dnase) I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>-20 &ordm에 저장; C 및 37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>Ham의 F-12 영양 혼합물을 사용한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>4 &ordm;C에 보관.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11195</td><td>-20&ordm;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>출생 후 0 일 또는 1 일 Sprague Dawley 쥐 새끼</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 배아 뉴런 기저 매체</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>Store at 4&ordm; C 및 37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>-20 &ordm; C 및 37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>-20 &ordm에 저장; C 및 37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>G5 astrocytic supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley 배아 일 18 쥐</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심 분리기 튜브</td><td>EMESCO</td><td>1194-352099</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Fisher</td><td>05-413-115</td><td></td></tr><tr><td>혈구분석기</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Fisher</td><td>13 998 076</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 40%</td><td>Fisher</td><td>F77P-4</td><td>포름알데히드는 발암성이 있는 것으로 알려진 독성 화합물로 별도의 용기에 담아 폐기해야 합니다.</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Fisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>전자 현미경 과학(EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>플루오로몬트 장착 매체</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td>-20&ordm;C.에 보관.</td></tr><tr><td>마우스 항베타-튜불린 III 1차 항체</td><td>Sigma</td><td>T8578</td><td>-20°C에 보관.</td></tr><tr><td>토끼 항 콜라겐 I 1 차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>-20&ordm;C에 저장.</td></tr><tr><td>토끼 안티 vimentin</td><td>Millipore</td><td>AB3400</td><td>-20&ordm;C에 저장.</td></tr><tr><td>마우스 안티 네스틴</td><td>Millipore</td><td>AB5326</td><td>-20°C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 568 2 차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>4&ordm; C에 저장.</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 568 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>4&ordm;C에 저장.</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 488 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>4&ordm;C에 저장.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Store at 4&ordm;C. Hoechst는 발암 물질로 취급해야 하는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다. 따라서 별도의 용기에 폐기해야 합니다.</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigma</td><td>C1359</td><td>무수 DMSO</td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Life Technologies</td><td>E1169</td><td>DMSO/H2O 1:4 (v/v</td></tr><tr><td>)Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td></td>에서 4 mM <td>면역 표지 구조체의 컨포칼 재구성을 수행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-S Microscope</td><td>Nikon</td><td></td>: <td>위상차 이미지를 촬영하는 데 사용됩니다. Nikon Elements Basic Research 소프트웨어(4.10.01)와 인터페이스된 QiClick 카메라를 사용한 디지털 이미지 획득.</td></tr></tbody></table>

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma 및 신경 퇴행 성 질환 자주 손실된 신경 대체 axonal 경로 재생성 하 중앙 신경 시스템 (CNS)의 제한 된 용량으로 인해 신경학 상 적자 지속 될. 그러나, 신 시스템 개발, 신경 마이그레이션 및 axonal 확장 하는 동안 자주 발생 "건설 기계 생활"로 다른 세포에 의해 형성 하는 경로 따라 합니다. 이러한 메커니즘을 에뮬레이션 circumvents CNS의 금지 환경 전략을 디자인 하 고 추구,이 원고 제공 조직 설계를 조작 하는 프로토콜 사이토 기반 "건설 기계 생활". 이러한 구조를 만들려면, 우리는 바이 폴라 경도 정렬 somata 및 프로세스의 고밀도 3 차원 번들으로 조립 자체 이다 유도 하는 소설 소재 넣음 구조 고용. 첫째, 빈 히드로 마이크로-열 조립 했다, 그리고 내부 루멘 기질-콜라겐 코팅 했다. 해리 대뇌 피 질 이다 다음의 중요 한 내부 직경, 및 원통형 마이크로 열의 루멘으로 배달 되었다 < 350 µ m, 자발적으로 자기 정렬 및 밀도 번들으로 구성 된 긴 섬유 같은 케이블을 생산 하는 계약을 체결 사이토 프로세스와 콜라겐 소 측정의 < 150 µ m 직경에 길이 몇 cm를 확장. 이러한 전시 생활 건설 기계 설계 > 97% 생존 세포와 거의 독점적으로 했다 이다 표현 하는 중간 필 라 멘 트 단백질 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), vimentin의 조합 및 nestin의 구성. 이 사이토 네트워크 신경 첨부 파일에 대 한 관대 한 기질을 제공 하는 것을 발견 했다 고 neurite 연장 정렬 정렬. 또한, 이러한 구조에 맞춤 히드로 넣음, CNS 이식 적합 하에서 추출 될 때 무결성 유지 관리 합니다. 이러한 미리 형성한 구조는 구조적으로 자연스럽 게 발생의 주요 cytoarchitectural 요소를 에뮬레이션 "건설 기계 생활" glial 기반 에 비보. 따라서, 이러한 설계 생활 건설 기계 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘에서 생체 외에서 연구 또는 신경 마이그레이션 및 CNS 변성 vivo에서 다음 axonal 길 여 neuroregeneration 촉진 역할 수 있습니다. .

처음에, 단계 대조 현미경 검사 법 사이토 접착 및 번들 형성의 진행과 시간의 함수로 cytoarchitecture의 전반적인 안정성을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 도금 후 1 시간에서 이다 둥근 형태 (그림 2A)와 마이크로 열의 루멘을 통해 발견 되었다. 5 h 이다 시작 프로세스를 확장 하 고 8 h 여 계약 셀 완전 한 프로세스 베어링 형태를 전시 케이블 마이크로 열 (그림 2A)의 경도 축 중심 구조로 형성. 특히, 마이크로 열 셀의 처음 분산된 존재에 비해, 이다 나타나 인테리어 따라 밀도 번들의 네트워크를 형성 하는 계약을 체결 (그림 2B). 초기 셀 맞춤, 세로 축 따라 자주 뽑 사이토 네트워크 후 마이크로 열 (그림 2C</...

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

본 프로토콜은 인 비트로(in vitro) 신경 생물학적 모델 또는 신경 재생 치료제로 사용하기 위해, 마이크론 크기의 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 종방향으로 정렬된 성상교세포 세포체와 돌기의 자가 조립된 3차원 번들을 제작하는 방법을 안내하는 것을 목적으로 합니다. 외상 및 신경 퇴행성 질환은 중추신경계 내의 재생을 제한하는 억제성 환경으로 인해 신경 발생 능력이 제한되어 환자에게 특히 치명적입니다. 공학적으로 설계된 성상교세포 번들은 주요 신경해부학적 특징과 글리아(glia) 매개 발달 기전을 재현하여 표적 세포 이동 및 축삭 경로 탐색을 촉진함으로써 현재의 치료 전략이 가진 한계를 해결하고자 합니다.이 성상교세포 스캐폴드의 구조는 주로 로스트랄 이동 경로(rostral migratory stream)의 글리아 튜브 내에 정렬된 성상교세포 돌기에서 영감을 얻었습니다. 먼저 멸균 비커에 3% w/v agarose 용액과 DPBS를 준비하십시오. 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하기 위해 가열 및 교반 상태를 유지하십시오.벌브 디스펜서의 하단 개구부에 침술용 바늘을 삽입합니다. 노출된 바늘 위에 모세관을 배치하고, 모세관의 일부를 벌브 디스펜서 실린더의 고무 섹션에 끼워 두 장치를 고정합니다. 실린더의 캡을 닫아 조립을 완료합니다.1 mL의 액체 아가로스를 빈 페트리 접시 표면에 옮깁니다. 벌브 디스펜서의 고무 캡을 꼬집은 상태에서 모세관의 한쪽 끝을 아가로스에 넣고, 캡의 압력을 풀어 아가로스가 관 안으로 빨려 들어가게 합니다. 벌브, 튜브, 바늘 조립체를 페트리 접시 위에 놓고 모세관 내부의 아가로스가 5분 동안 응고되도록 둡니다.그런 다음, 마이크로 컬럼이 여전히 바늘을 감싸고 있는 상태에서 바늘을 모세관 튜브에서 뽑아냅니다. 포셉 끝을 사용하여 마이크로 컬럼을 바늘 끝으로 밀어낸 후, 바늘을 DPBS가 담긴 열린 페트리 접시 위에 대고 마이크로 컬럼을 DPBS 안으로 밀어 넣습니다. 이러한 구조물의 이후 취급을 용이하게 하는 마이크로 컬럼 보트를 제작하려면, 먼저 4% weight per volume 아가로스 용액을 만들고 용액을 가열하며 교반 상태로 유지하십시오.핀셋을 사용하여 마이크로 컬럼을 빈 페트리 접시에 옮깁니다. 그다음, 실체 현미경 하에서 마이크로 메스로 마이크로 컬럼의 끝부분을 45도 각도로 잘라 원하는 길이로 다듬습니다. 세 개의 마이크로 컬럼을 더 다듬은 후, 네 개의 컬럼을 나란히 정렬합니다.피펫에 4% agarose 용액 50 µL를 취하여, 마이크로 컬럼 어레이 위에 액체 선을 분사해 구조체들을 연결하여 하나의 보트 형태로 묶어줍니다. 4% agarose가 겔화될 수 있도록 1~2분 동안 냉각시킵니다. 그 다음 정밀 핀셋을 사용하여 연결된 agarose 브릿지 부분을 잡아 마이크로 컬럼 보트를 들어 올립니다.그리고 이를 DPBS가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. 마이크로 컬럼 보트를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮기고 30분 동안 자외선에 노출시켜 멸균합니다. 생물안전작업대 내부에서 공배양 배지에 rat tail type 1 collagen을 1 mg/mL 농도로 용해하여 준비합니다.그런 다음 얼음에 놓습니다. ECM 용액의 pH가 7.2에서 7.4 범위 내에서 안정될 때까지 필요에 따라 산 또는 염기를 사용하여 pH를 조정합니다. 핀셋을 사용하여 마이크로 컬럼 보트를 35 또는 60 mL 페트리 접시에 옮깁니다.실체 현미경을 사용하여 안내하며, 마이크로 파이펫의 10 mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 위치시키고 흡입하여 루멘 내부의 DPBS와 기포를 제거합니다. P10 마이크로 파이펫에 콜라겐 용액을 채웁니다. 10 mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 밀착시키고, 루멘을 채울 만큼의 용액을 주입합니다.그런 다음 마이크로 컬럼의 양 끝에 ECM 저장소를 피펫으로 분주합니다. 모든 컬럼이 채워지면, 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위해 페트리 접시 가장자리를 따라 고리 모양으로 공동 배양 배지를 피펫으로 분주합니다. 세포를 추가하기 전 콜라겐의 중합 반응을 촉진하기 위해 마이크로 컬럼이 담긴 접시를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 1시간 동안 배양합니다.그 후, P10 마이크로피펫의 팁을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 대고 약 5 mL의 세포 용액을 루멘으로 옮겨 채웁니다. 모든 마이크로 컬럼을 보트에 안착시킨 후, 성상교세포가 ECM에 부착되도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면, 마이크로 컬럼이 안착된 배양 접시에 35 mL 또는 60 mL 페트리 접시 기준에 따라 각각 3 mL 또는 6 mL의 공배양 배지를 조심스럽게 채웁니다.플레이팅된 마이크로 컬럼과 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 유지하여 성상교세포 다발의 정렬된 자기 조립을 촉진하며, 6~10시간 후에는 다발 형태의 케이블 유사 구조가 형성되어야 합니다. 플레이팅 1시간 후 성상교세포는 구형이며 구조물 전체에 분산되어 있습니다. 플레이팅 5시간 후부터 성상교세포는 돌기 신장 및 수축을 시작합니다.세포 도말 8시간 후, 성상교세포가 정렬되고 수축되었습니다. 본 예시에서는 도말 24시간 후에 성상교세포 돌기의 조밀한 다발이 형성되었습니다. 도말 24시간 후 완전히 형성된 이 성상교세포 다발은 케이블의 끝단이 루멘 벽의 서로 다른 끝단에 부착되는 지퍼 효과(zippering effect)를 보여줍니다.이 영상은 세포 도말 후 3~10시간 사이에 일어나는 번들링(bundling) 과정을 보여줍니다. 성상교세포 지지체의 면역 표지는 성상교세포 돌기의 종방향 정렬을 입증합니다. 성상교세포 번들의 이 공초점 이미지에서는 성상교세포 마커인 GFAP가 읽힙니다.그리고 핵은 파란색으로 보입니다. 다발을 더 높은 배율로 관찰하면 마이크로 컬럼 내 성상교세포의 세포 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 재료 외피 내에 생물학적 영감을 받은 세포 구조를 갖춘, 세로로 정렬된 성상교세포 다발로 구성된 살아있는 스캐폴드를 제작할 수 있게 될 것입니다.이 절차에 따라, 신경발생 부위로부터의 지향성 세포 이동을 촉진하고 제한적 중추신경계(CNS) 미세환경에 대한 유도 작용을 수행하기 위해, 생체재료 캡슐화 여부와 관계없이 성상교세포 다발을 손상된 뇌 조직에 전달하는 이식 전략을 설계할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 천연 3차원 환경의 모사와 인비트로(in vitro) 시스템의 고유한 실험적 제어 능력을 활용하여, 글리아(glia) 매개 신경생물학적 현상을 연구하는 생체 충실도 모델링 플랫폼으로 확장될 수 있습니다.

three-dimensional-tissue-engineered-aligned-astrocyte-networks-to

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 성상세포와 뉴런을 공동 배양하여 3D 구를 형성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 3D 구체는 시냅스 형성 및 신경망 통합을 조사하기 위한 고유한 플랫폼을 제공하여 발달 신경 과학, 신경 퇴행성 질환 및 신경 약리학적 중재 연구를 위한 잠재적 모델 역할을 합니다.

시냅스 형성을 유도하기 위해 성상세포와 뉴런의 3D 공동 배양 구체 생성

이 동영상은 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 3차원 성상세포 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 미세기둥의 내부는 콜라겐으로 코팅되어 있습니다. 성상세포(astrocyte)가 도입되어 콜라겐에 부착하고 추가 배양을 통해 3차원 골격으로 자가 조립됩니다.

하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 성상세포 스캐폴드를 생성하는 In Vitro 방법

이 비디오는 바이오잉크 용액에 부유하는 성상세포를 사용하여 3D 바이오프린팅 구조를 만드는 과정을 보여줍니다. 바이오프린팅 구조체는 가교 후 성상세포 부착과 확산을 촉진하여 신경과 같은 조직을 형성합니다.

3D 바이오프린팅 방법 쥐 피질 성상세포(Murine Cortical Astrocyte)

출처: Struzyna, LA 외, 신경계 재건, 변조 및 모델링을 위한 해부학적으로 영감을 받은 3차원 미세 조직 공학 신경망. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 세포외 기질 코어가 있는 하이드로겔 마이크로 컬럼을 사용하여 미세 조직 공학 신경망의 개발을 보여줍니다. 시드된 신경 응집체는 부착하고, 투영을 확장하며, 구조화된 신경망을 형성하여 신경 발달 및 신경치료 연구의 발전에 기여합니다.

하이드로겔 기반 마이크로컬럼을 이용한 미세조직 공학 신경망 개발

뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

배우세요 3차원 수성겔 마이크로컬럼 내에서 자가조립된 별아교세포 번들을 제작하는 방법을 통해 신경재생을 촉진하는 기술입니다. 이 프로토콜은 체외 신경생물학 모델 개발 및 축삭 경로유도 연구에 활용됩니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

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