2018년 1월 10일
우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.
이 프로토콜은 체외 신경생물학 모델 또는 신경 재생 요법으로 사용하기 위해 미크론 크기의 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 세로로 정렬된 성상세포체세포 및 공정의 자체 조립된 3차원 번들의 제작을 안내하는 것을 목표로 합니다. 외상과 신경퇴행성 질환은 중추신경계의 재생을 제한하는 억제 환경에서 제한된 신경인성 능력으로 인해 환자에게 특히 해롭습니다. 엔지니어링된 성상세포 다발은 주요 신경 해부학적 특징과 신경교세포 매개 발달 메커니즘을 복제하여 표적 세포 이동 및 축삭 경로 찾기를 촉진함으로써 현재 치료 전략의 한계를 해결합니다.
이 astrocytic scaffolds의 건축은 주로 rostral migratory stream의 glial tubes에서 정렬 된 astrocytic process에서 영감을 받았습니다. 멸균 비이커에 부피당 3%의 아가로스 용액과 DPBS를 준비하는 것으로 시작합니다. 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하기 위해 가열 및 교반을 유지하십시오.
구근 디스펜서의 하단 구멍에 침 바늘을 삽입합니다. 노출된 바늘 위에 모세관 튜브를 놓고 전구 디스펜서 실린더의 고무 부분에 바늘의 일부를 넣어 두 개를 고정합니다. 실린더를 마개하여 조립을 완료합니다.
1ml의 액체 아가로스를 빈 페트리 접시 표면으로 옮깁니다. 벌브 디스펜서의 고무 캡을 꼬집으면서 모세관 한쪽 끝을 아가로스에 삽입하고 캡의 압력을 해제하여 아가로스를 튜브로 끌어들입니다. 전구, 튜브, 바늘 어셈블리를 페트리 접시에 놓고 아가로스가 모세관 내부에서 5분 동안 응고되도록 합니다.
그런 다음 모세관 튜브에서 바늘을 당겨 빼내고 마이크로 컬럼이 바늘을 둘러싸고 있는 상태로 둡니다. 앞두의 끝을 사용하여 마이크로 컬럼을 바늘 끝으로 살짝 밀어 넣은 다음 열린 DPBS가 포함된 페트리 접시 위에 바늘을 놓고 마이크로 컬럼을 DPBS로 밀어 넣습니다. 이러한 구조체의 나중에 쉽게 처리 할 수 있도록 마이크로 컬럼 보트를 제작하려면 부피 당 4 % 중량의 아가로 스 용액을 만들고 용액을 가열하고 교반하는 것으로 시작하십시오.
집게를 사용하여 마이크로 컬럼을 빈 페트리 접시로 이동합니다. 그런 다음 입체경 아래에서 작업하는 동안 마이크로 메스를 사용하여 끝을 45도 각도로 자르고 마이크로 기둥을 원하는 길이로 자릅니다. 3개의 마이크로 열을 더 트리밍한 후 4개의 열을 병렬로 정렬합니다.
피펫에 50마이크로리터의 4% 아가로스 용액을 로드하고 마이크로 컬럼 어레이 위에 액체 라인을 분배하여 구조물을 보트에 연결하고 번들로 묶습니다. 4% 아가로스의 겔화를 허용하기 위해 1-2분 동안 식히십시오. 그런 다음 가는 집게를 사용하여 연결된 아가로스 다리 옆의 마이크로 기둥 보트를 들어 올립니다.
그리고 DPBS가 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다. 마이크로 컬럼 보트를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 30분 동안 자외선에 노출시켜 살균합니다. 생물 안전 캐비닛 내부에서 공동 배양 배지에서 쥐꼬리 유형 1 콜라겐의 밀리리터당 1mg 용액을 준비합니다.
그런 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. pH가 7.2에서 7.4 범위로 안정될 때까지 필요에 따라 산 또는 염기로 ECM 용액의 pH를 조정합니다. 집게를 사용하여 마이크로 컬럼 보트를 35 또는 60mL 페트리 접시에 옮깁니다.
입체경을 사용하여 마이크로 피펫의 10mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 흡입하여 DPBS 및 기포의 내강을 비웁니다. P10 마이크로피펫에 콜라겐 용액을 충전합니다. 10mL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 내강을 채울 수 있는 충분한 용액을 제공합니다.
그런 다음 마이크로 컬럼의 양쪽 끝에 ECM 저장소를 피펫팅합니다. 모든 컬럼이 채워지면 페트리 접시 주위에 고리 모양으로 피펫 공동 배양 배지를 만들어 컬럼이 마르는 것을 방지합니다. 마이크로 컬럼이 들어있는 접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 최소 1시간 동안 배양하여 세포를 추가하기 전에 콜라겐의 중합을 촉진합니다.
그런 다음 P10 마이크로피펫의 끝을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 약 5mL의 세포 용액을 내강으로 옮겨 채워 넣습니다. 보트에 모든 마이크로 컬럼을 장착한 후 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양하여 ECM에 성상세포의 부착을 촉진합니다. 배양 기간이 끝나면 장착형 마이크로 컬럼이 포함된 접시에 각각 35 또는 60mL 페트리 접시에 대해 3 또는 6mL의 공동 배양 배지를 조심스럽게 채웁니다.
도금된 마이크로 컬럼과 배양을 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 유지하여 6-10시간 후에 다발된 케이블과 같은 구조를 형성해야 하는 성상세포 다발의 정렬된 자체 조립을 촉진합니다. 도금 1시간 후, 성상세포는 구형이며 구조물 전체에 분산됩니다. 도금 후 5시간이 지나면 성상세포는 과정 확장 및 수축을 시작합니다.
도금 후 8시간이 지나면 성상세포가 정렬되고 수축합니다. 도금 후 24시간이 지나면 이 예에서 조밀한 성상세포 돌기 다발이 형성되었습니다. 도금 후 24시간이 지나면 완전히 형성된 이 성상세포 다발은 케이블 끝이 내강 벽의 뚜렷한 끝에 부착되는 지퍼 효과를 보여줍니다.
이 비디오는 도금 후 3-10시간 동안 번들링이 작동하는 모습을 보여줍니다. astrocytic scaffolds의 Immuno-labeling은 astrocytic process의 종적 정렬을 보여줍니다. 이 성상세포 다발의 컨포칼 이미지에서, 성상세포 마커 GFAP를 판독합니다.
그리고 핵은 파란색으로 보입니다. 이러한 다발의 더 높은 배율은 마이크로 컬럼 내에서 성상세포의 세포 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 재료 케이스 내에서 생물학적으로 영감을 받은 세포 구조를 가진 세로로 정렬된 성상 세포 다발로 구성된 살아있는 골격을 제작할 수 있을 것입니다.
이 절차에 따라, 생체 재료 케이스가 있거나 없는 성상세포 다발을 손상된 뇌 조직에 전달하여 신경인성 영역에서 유도된 세포 이동을 촉진하고 제한적인 CNS 미세환경에 대한 안내에 작용하도록 이식 전략을 설계할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 네이티브 3차원 환경의 모방과 체외 시스템의 고유한 실험적 제어에 의해 이점을 얻는 바이오피델릭 모델링 플랫폼 신경생물학 현상으로 확장될 수 있습니다.
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이 연구는 마이크론 크기의 하이드로겔 마이크로 기둥 내에서 종격방향으로 정렬된 성상교세포 체와 과정의 자기 조립 3차원 다발을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 공학적으로 제작된 성상교세포 다발은 중요한 신경해부학적 특징을 복제하고 신경 이주 및 축삭 경로 찾기를 지시함으로써 신경재생을 촉진하는 것을 목적으로 합니다.
Engineered aligned astrocyte networks provide a biologically inspired platform to study neurodevelopmental mechanisms and support neuroregeneration strategies. By mimicking natural glial scaffolds, these constructs enable hypothesis testing of axonal pathfinding and neuronal migration in a controlled in vitro system. This approach addresses a key discovery-stage challenge in CNS repair by offering a scalable, reproducible model for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease and neurotrauma research.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, supporting hypothesis-driven research on glial-guided neuroregeneration.