Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝 체외에서 : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전체 해마 준비를 추출하고 광유전학적 자극뿐만 아니라 필드, 단일 및 패치 클램프 기록을 사용하여 리드미컬한 신경 네트워크의 생성을 탐색하는 절차를 제시하는 것입니다. 이 방법은 해마의 리듬 진동의 기초가 되는 세포 및 시냅스 메커니즘에 대한 연구를 크게 촉진함으로써 학습 및 기억의 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최적화된 준비를 사용하여 해마 의존 기억 정보에서 중요한 역할을 하는 상세한 진동의 회로를 조사한다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 뇌를 해부 접시에 똑바로 세우고 면도날로 소뇌를 제거한 다음 중간 시상면을 따라 뇌를 반으로 자르고 두 개의 고립된 반구를 보관실로 되돌립니다. 다음으로, 반구가 있는 단일 뇌를 해부 접시 위에 똑바로 세웁니다. 중간 시상 구조가 실험자를 향하고 중격 복합체의 내장 된 윤곽이 시상 내부의 얇은 배 모양의 조직 층으로 보일 때까지 접시를 회전시킵니다.

그런 다음 코팅된 주걱을 중격 아래에 삽입하고 박리 접시에 도달할 때까지 팁을 아래로 이동하여 중격 영역을 따뜻하게 연결하는 섬유를 절단합니다. 이제 중격의 앞쪽 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하고 뇌의 전두엽에 연결된 섬유를 자릅니다. 주걱으로 해마 바로 위의 피질 안쪽 부분을 똑바로 세운 상태에서 마이크로 주걱을 사용하여 시상핵, 시상하부핵 및 나머지 뇌간핵을 조심스럽게 아래로 당깁니다.

그런 다음 주걱을 사용하여 뽑아낸 조직을 잘라 제거합니다. 그 후, 코팅된 주걱을 등쪽 해마의 상부 끝 아래 외심실에 삽입합니다. 반절제된 뇌의 중간 시상면과 정렬된 주걱을 수평으로 잡고 끝이 따뜻하게 나올 때까지 심실 벽의 부드러운 윤곽을 통해 밀어 넣습니다.

해마 아래에 주걱을 잡고 해마가 위에 있는 피질과 결합하는 내부 층을 따라 연결 섬유에 가볍게 누른 다음 이 층의 바깥쪽에 마이크로 주걱을 바르고 코팅된 주걱에 눌러 연결 섬유를 절단합니다. 추출을 완료하려면 해부 접시를 회전시키고 코팅된 주걱을 복부 해마 아래에 삽입합니다. 주걱으로 해마를 가볍게 잡고 주걱에 대해 자르는 동작을 사용하여 내분비 연결을 절단합니다.

격리가 완료되면 해마를 접시 위에 올려 놓고 얼음처럼 차가운 자당 용액 한 방울을 넣어 시원하게 유지합니다. 남아 있는 피질과 섬유를 조심스럽게 잘라내고 면도날을 포닉스에 부드럽게 대어 해마와 중격을 분리합니다. 그 후, 제제를 실온 자당 용액에 옮기고 15-30 분 동안 회복시킨 후 기록 챔버로 옮깁니다.

이 단계에서는 산소화된 ACSF의 연속 고속 흐름이 가능하도록 중력 공급 관류 시스템을 설정합니다. 다음으로, ACSF 흐름을 중지하고 유리 피펫의 넓은 끝을 사용하여 해마를 기록 챔버로 옮깁니다. 자당이 포화 된 제제가 바닥에 가라 앉고 가라 앉도록하십시오.

준비물을 녹음실 중앙에 놓고 CA1과 subiculum의 매끄러운 표면이 위에 오도록 합니다. 중격 및 측두엽 말단의 작은 무게로 해마를 안정화하고 ACSF 흐름을 다시 시작합니다. 이 절차에서 LFP 전극을 해마 표면으로 내립니다.

매개변수 층을 통해 LFP 전극을 전진시키고 개별 뉴런에서 단일 단위 방전이 감지됨에 따라 세포 외 스파이크 활동의 증가를 관찰합니다. 전극을 더 낮추고 팁이 방사 원자로 교차할 때 스파이크가 다시 희미해지기 시작하는 점에 유의하십시오. 세타 주파수 범위에서 명확하게 보이는 네트워크 진동이 명백해지고 기록 위치가 방사 원자를 통해 낮아짐에 따라 최대 진폭에 도달하는 것을 관찰합니다.

CA1 영역에서 자발적인 세타 진동의 공간적 속성을 테스트하려면 두 번째 LFP 전극을 CA1 위치에 배치하고 CA1 세타 진동이 먼 거리에서 동기화되는지 관찰합니다. 해마층을 가로지르는 세타 진동의 특성을 테스트하려면 CA1 방사선 원자 부위에 기준 LFP 전극을 남겨 두십시오. 오리엔스 지층 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 매개변수 세포층과 방사선 원자를 통해 낮춥니다.

파라미터 계층에서 LFP 신호의 점진적인 반전을 관찰합니다. 온전한 해마에서 감마 진동과 세타 감마 결합을 테스트하려면 CA1 subiculum 경계에 필드 전극을 놓고 매개변수와 분자층 사이의 계면에 위치할 때까지 낮춥니다. 이 수준에서, 위상이 국소 세타 리듬에 고정된 진폭의 변화에 따라 명확한 감마 진동을 표시하는 필드 전위를 기록할 수 있습니다.

그런 다음 스케일링을 조정하여 세타 감마 커플링의 느린 시간 스케일을 관찰합니다. 감마 버스트는 느리고 빠른 감마 범위에서 진행 중인 LFP 신호 동안 대역별로 드러날 수 있는 두 개의 고유한 주파수 대역에서 발생합니다. 체외 해마 세타 진동 중 전체 세포 패치 클램프 기록의 경우, 저배율 및 고배율 배율의 형광 비디오 현미경을 사용하여 PV 탐 마우스의 해마 제제 표면 근처에 위치한 tdTomato 양성 중간뉴런을 시각화합니다.

해마의 저배율 보기에서 CA1 subiculum에 LFP 전극을 배치하여 패치 클램프 실험을 준비하는 동안 세타 진동을 모니터링합니다. 그런 다음 40배 배율로 전환하고 목표 영역에 대물렌즈를 담그십시오. 최상층이 보일 때까지 낮추고 형광 현미경 아래에서 형광 PV 탐 세포를 선택하고 표준 세포 간 솔루션으로 채워진 패치 피펫으로 접근합니다.

전체 세포 구성에 들어가면 자발적인 해마 진동 동안 식별된 PV 세포의 생리학적 특성을 검사합니다. 진행 중인 CA1 subiculum theta rhythm과 동기화된 빠른 스파이크 거동 및 활동 전위의 폭발을 특징으로 하는 PV 세포의 세포막 전위 기록을 관찰합니다. 이 절차에서는 CA1 subiculum 영역에 LFP 전극을 배치하고 마우스의 격리된 해마에 있는 인근 매개변수 세포를 패치하여 PV 인터뉴런에서 청색광에 민감한 흥분성 옵신(chr2)을 발현합니다.

해마 준비 위에 광섬유 광 가이드를 놓고 기록된 영역의 중앙에 놓습니다. 10-20밀리초의 광 펄스 또는 세타 주파수에서 전달되는 사인파 전압 명령으로 구성된 광학 유전자 자극을 위해 LED 광원의 청색광을 사용합니다. 전류 클램프에서 자발적인 세타 진동 동안 기록된 세포의 활동을 특성화합니다.

그런 다음 자극 프로토콜을 시작하고 광 반응을 기록합니다. 자기장 진동과 시냅스 활동 및 기록된 뉴런이 광유전학적 자극 중에 점점 더 동기화되고 PV 세포의 리드미컬한 페이싱이 세타 진동의 주파수와 전력 모두를 강력하게 제어하는 결과를 관찰합니다. 여기에 표시된 것은 세타 진동 동안 매개변수 셀에서 기록된 전기생리학적 활성입니다.

현재 클램프 트레이스는 정지 상태에서 자발적이지만 리드미컬하지 않은 발사와 천천히 나타나는 LFP 진동과 명확하게 동기화되지 않은 억제성 시냅스 후 전위를 보여줍니다. 전압 클램프 기록은 해당 억제 후 시냅스 전류가 약 -70밀리볼트에서 반전 전위를 갖는다는 것을 보여줍니다. 그리고 여기는 세타 진동 동안 빠르게 스파이킹하는 형광 PV 인터뉴런에서 기록된 전기생리학적 활성입니다.

전류 클램프에서 이 세포는 정지 상태에서 자발적으로 발화했으며 안정적인 LFP 진동으로 위상 고정된 리드미컬한 흥분성 시냅스 후 전위에 의해 강력하게 구동되었습니다. 전압 클램프 기록에서 여기 후 시냅스 전류 반전 전위는 약 0 밀리 볼트였습니다. 이 기술을 숙달하면 2-3시간 내에 수행할 수 있으며, 이 절차를 시도하는 동안 용액에 산소를 격렬하게 공급하고 전기 생리학적 기록 중 준비 중에 무장 ACSF의 고속이지만 안정적인 흐름을 허용하는 관류 시스템을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 특정 세포 유형 집단의 광유전학 자극 또는 침묵과 같은 다른 방법을 사용하여 해마에서 세타 발진기를 형성하는 세포 하위 유형을 식별하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 체외 해마의 중격 측두축을 가로지르는 세타 진동의 역학을 체계적으로 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 광유전학적 자극뿐만 아니라 필드, 단위 및 패치 클램프 기록을 사용하여 리드미컬한 신경 네트워크의 기능을 탐색하기 위해 전체 해마 제제를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.