Name: Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝 체외에서 : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 격리된 설치류 해마에서 쎄타 및 감마 진동을 필드, 유니터리, 패치클램프 기록 및 광유전학 자극을 사용하여 연구하는 방법을. 이 기법은 해마 의존 기억의 신경 회로와 세포 메커니즘을 탐구하는 데 필수적입니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소 (Canadian Institute of Health Research and Natural Sciences)의 지원을 받았다.

모든 절차는 McGill 대학 동물 관리위원회 및 동물 관리에 관한 캐나다위원회에서 승인 한 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 급성 해마 in vitro 준비 참고 : 손상되지 않은 해마 준비를 분리하는 것은 (1) 솔루션 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 본질적인 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정. 이 프로토콜에서 해부에서 기록에 이르기까지 적시에 수행되는 절차는 격리 된 해마가 밀도가 높지만 섬세한 준비를 이루기 때문에 중요합니다. 즉, 생체 외 구조의 기능적 연결성을 유지하는 데는 많은주의가 필요합니다. 모든 것을 사전에 준비하면 세포 d를 최소화하기 위해 적절한 수준의 재관류를 가능한 한 빨리 사용할 수 있습니다.생리 기능을 상실하고 유지하십시오. <ol><li> 자당 기반의 인공 척수액 (aCSF) 용액 <ol><li> 해부 및 해부 후 부화에 사용되는 1X 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 표 1에 열거 된 모든 성분을 CaCl 2를 제외하고 1L의 탈 이온수에 넣고 4 ℃에서 2 주 동안 보관한다. </li></ol></li><li> 표준 aCSF 솔루션 <ol><li> electrophysiological 녹음 동안 격리 해마의 높은 유속 관류에 대한 표준 aCSF를 준비합니다. 농축 (5X) 스톡 aCSF를 만들기 위해서는 탈 이온수 2 L에 CaCl 2를 제외한 표 2에 열거 된 모든 성분을 녹이고 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 장비 준비 <ol><li> 해부를 시작하기 전에 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이 (30 x 20 x 5cm), 카보 겐 연결 튜브 라인 및 three 유리 페트리 접시 (10 x 2 cm) ( 그림 1 참조). </li><li> carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)과 칼슘을 추가 2+ [1.2 mm]가 함께, 500㎖의 비커에 거품을 수크로오스 용액 300 ㎖ (1X 스톡)를 추가한다. </li><li> 이 페로쉬 액 60mL를 유리 배양 접시에 옮기고 실온에서 방치한다. 나머지를 4 ° C의 냉동고에 10-15 분 동안 놓습니다. </li><li> 해부를 통해 carbogen과 얼음 차가운 자당 솔루션을 버블 링하십시오. </li><li> 두 번째 페트리 접시 (차가운 체임 챔버)를 자당 용액 (4 ° C)으로 채우고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 빙 냉한 자당 용액 30 mL를 50 mL 비커에 넣는다. </li></ol></li></ol> 2. 전 해마 해부 참고 : 격리 된 해마를 해부하는 방법을 개발하는 것과 본질적으로 동일하며 원래 22 만 체육에 대한 자세한 내용 및 변경 설명rfusion 속도 및 녹음 기술. <ol><li> 뇌 절개 <ol><li> 바구니에 추가되는 이소 플루 란 (100 %) 1 ML로 담가 작은 종이 타월로 퓸 후드 아래 마우스 (P20 - 35) 마취. </li><li> 마취 된 마우스를 처치하고 얼음으로 찬 자당 용액 (50 mL 비이커, 약 5 초)에서 머리를 빠르게 담그십시오. 종이 타월로 옮깁니다. </li><li> 메스를 사용하여 내측 피부 절개를하고 (옆구리에 꼬리 쪽) 피부를 양쪽으로 밀어서 두개골을 노출시킵니다. </li><li> 작은 가위로 두개골을 열어 주걱을 사용하여 신속하게 두뇌를 추출하고 얼음 차가운 자당 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 놓습니다. 두뇌가 식을 때까지 1-2 분 정도 기다리십시오. </li><li> 두뇌가 회복하는 동안, 얼음에 렌즈 종이 덮여 페트리 (해부) 요리에 2 - 3 ML 자당 솔루션을 추가합니다. </li></ol></li><li> 해마 분리 <ol><li> 똑바로 positio에 해부 접시에 두뇌를 놓으십시오엔. </li><li> 면도날로 소뇌와 전두엽 피질을 제거하십시오. midsagittal 비행기를 따라 반으로 뇌를 잘라내고 두 격리 반구를 들고 챔버로 반환합니다. 회복을위한 추가 1 ~ 2 분을 허용하십시오. </li><li> 단일 hemisected 두뇌를 해부 접시에 똑바로 놓습니다. </li><li> midsagittal 구조가 관찰자와 마주 치게 될 때까지 접시를 회전시키고 중격 복합물의 삽입 된 윤곽이 시상선 앞쪽에 얇은 배 모양의 조직으로 보입니다. </li><li> hemi - sected 두뇌를 microspatula로 고정하고 polyptetrafluoroethylene (PTFE) 코팅 된 주걱의 작은 끝을 septal 영역 바로 뒤에 (caudal) 놓습니다. </li><li> 중격 아래에 코팅 된 주걱을 삽입하고 해부 접시에 도달 할 때까지 팁을 아래로 이동하십시오. septal 영역을 연결하는 섬유를 절단합니다. 중격의 앞쪽 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하고 두뇌의 정면 부분에 연결하는 섬유를 잘라. </li><li> 주걱으로 직립 위치에 해마 바로 위의 피질의 안쪽 부분을 가볍게 잡고, 시상 하부, 시상 하부 및 남아있는 뇌간 핵을 조심스럽게 내려 오기 위해 미세 주걱을 사용하십시오. 뽑아 낸 티슈를 잘라내어 제거하려면 주걱을 사용하십시오. </li><li> 고립 된 반구를 돌려서 해마의 윤곽을 확인하십시오. </li><li> 코팅 된 주걱을 등쪽 해마의 주둥이 끝 부분 아래쪽 측면 심실에 삽입합니다. </li><li> 주걱을 hemi - sected 두뇌의 midsagittal 비행기와 수평으로 정렬 잡고 팁이 꼬리로 나타날 때까지 심실 벽의 부드러운 윤곽을 통해 밀어. </li><li> 해마 아래의 주걱을 잡고 해마가 위에있는 피질과 결합하는 내부 층을 따라 연결 섬유 위로 가볍게 누르십시오. 이 층의 외부면에 미세 주걱을 바르고 코팅 된 주걱에 대해 슬라이드시켜 연결하는 fi맥주. </li><li> 추출을 완료하려면 해부 접시를 회전하고 복부 해마 아래에 코팅 된 주걱을 삽입합니다. 피질 주름의 내부를 주걱으로 가볍게 잡고 미세 주걱에 대한 슬라이싱 동작을 사용하여 엔도르린 연결부를 절단합니다. 참고 : 전체 septohippocampal 복잡한은 전체 해마 아래에 코팅 된 주걱을 배치하고 아래에서 나머지 뇌 조직을 꺼내 제거 할 수 있습니다. </li><li> 일단 고립이 완료되면, 해마를 접시에 휴식을 유지하고 차가운 유지하기 위해 얼음 차가운 자당 솔루션의 방울을 추가합니다. 조심스럽게 남은 피질과 섬유를 잘라내어 면도날을 천천히 가해 중격에서 해마를 분리합니다. 참고 : 패치 클램프 녹음이 피라미드 세포 (4.6 절 참조)에서 수행되어야하는 경우 격리 된 해마는 CA1의 피라미드 층을 노출시키기 위해 45 ° 각도로 횡 방향으로 절단 될 수 있습니다 ( &quot;angle- 컷 &quot;준비) 해마의 나머지 부분에서 로컬 네트워크 회로를 손상시키지 않습니다. </li><li> 제제를 상온의 자당 용액에 옮기고 15 ~ 30 분간 회복시켜 녹음 챔버로 옮긴다. </li></ol></li></ol> 3. 격리 된 해마 기록을위한 빠른 관류 설정 <ol><li> 20 - 25 mL / min에서 산소가 공급 된 aCSF를 연속적으로 고속 유입 할 수 있도록 중력 식 관류 시스템을 설치하십시오. <ol><li> 미리 aCSF (1X) 플라스크를 준비하고 실험 시작 15 분 전에 예열 욕조 (~ 30 ° C)에 담그십시오. 인라인 용액 히터 시스템을 켜십시오 (30 ° C). </li><li> 실험 전반에 걸쳐 aCSF에 산소를 공급하는 카보 겐 탱크에 연결된 수족관 버블 러와 튜빙 라인을 사용하고 재관류 시작 전에 CaCl 2 [2 mM]를 첨가하십시오. </li><li> aCSF 흐름을 중지하고 와이드를 사용하여 기록 챔버에 해마를 전송유리 피펫의 끝입니다. 자당 포화 제제가 침전되어 바닥에 침전되도록하십시오. </li><li> CA1과 SUB의 매끄러운 표면을 맨 위에 놓고 녹음 챔버의 중심에 (입구 - 출구 축과 일치하여) 준비물을 놓습니다. septal과 temporal extremes에서 작은 무게로 해마를 안정화시키고 aCSF flow를 다시 시작하십시오. </li></ol></li></ol> 고립 해마에서의 전기 생리학 <ol><li> 생체 외 hippocampal 쎄타 발현의 세포 외 기록 <ol><li> LVD (Local Field Potential) 또는 체외 격리 된 해마로부터의 단일 단위 활동의 ​​세포 외 모니터링을 위해 aCSF로 채워진 유리 마이크로 피펫 (1 - 3 MΩ)을 사용하십시오. 이득 x1000의 패치 클램프 증폭기, 온라인 대역 통과 필터링 0.1 - 500 Hz 및 5-20 kHz의 샘플링 속도로 저잡음 AC 결합 필드 전위 신호를 기록하십시오. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 맞춤형 현미경는 해마의 저배율보기를위한 저배율 (2.5X) 및 고배율 (40X) 대 상뿐만 아니라 단일 셀 인식을위한 적외선 비디오 현미경 및 후광 형광을 갖추고 있습니다. 이 시스템의 구성 요소로는 직립 형광 현미경, 형광 필터 큐브, 이미징 소프트웨어가있는 아날로그 비디오 카메라 및 디지털 프레임 그래버, 단계별 사용자 지정 관류 챔버 ( 그림 2A , 삽입 된 i) 및 연결 기록 용 고정밀 미세 조절기 및 광섬유 배치. </li><li> 현미경에 장착 된 카메라를 사용하고 컴퓨터 디스플레이에 연결하여 저배율 (2.5 배)에서 해마 준비를 검사하고 언더컷이 없거나 외부 표면이 손상되지 않았는지 신속하게 확인합니다. CA1의 매끄러운 표면을 따라 대각선 방향으로 배치 된 새우 섬유 배열은 해마 (hippocam)를 통해 투과 된 빛을 비출 때 가시적이어야한다 ( 그림 2A , 삽입 2)고름. </li><li> 격리 된 해마와 특정 기록 위치에 LFP 전극을 배치하려면 저배율 와이드 필드 대물 렌즈를 사용하십시오. 참고 : 서로 다른 녹음 위치에 배치 된 여러 개의 전극이있는 격리 된 해마 준비의 레이아웃이 그림 2A에 나와 있습니다. </li><li> CA1 영역의 표면 (alveus)에 닿을 때까지 LFP 전극을 조에 넣으십시오. 참고 : 이것은 일반적으로 전극이 기록 매체에 닿으면 발생하는 것과 유사한 AC 결합 기록에서 빠른 과도 현상을 일으 킵니다. 오디오 모니터는이 단계 후에 LFP 채널 신호를 청취하는 데 유용 할 수 있습니다. 참고 : 종종 활동의 초기 징후는 10-15 분 후에 만 ​​나타나므로 준비 단계로 빨리 넘어 가지 않는 것이 중요합니다. 이 기간이 지난 후에도 표면 LFP 전극이 여전히 활동을 포착하지 못하면 지층 oriens를 조금 더 아래로 전진하십시오주요 셀 레이어에 접근하는 동안 어떤 형태의 활동이 발생하는지 주기적으로 확인하십시오. 5 ~ 10 분 후에 아무 것도 감지되지 않으면 조심스럽게 전극을 집어 넣고 같은 지역의 다른 곳에 두십시오. </li><li> 피라미드 층을 통해 LFP 전극을 전진시킵니다. 개별 뉴런 (주로 피라미드 및 억제 성 바스켓 세포)으로부터의 단일 단위 방출이 검출됨에 따라 세포 외 스파이크 활동이 초기에 증가하는 것을 관찰하십시오. 전극을 더 낮추고 팁이 방사선에 교차하면서 스파이크가 다시 흐려지기 시작합니다. 시타 - 주파수 범위 (4 - 12 Hz)에서 명확하게 보이는 네트워크 발진이 분명 해지고 방사 위치를 통해 방사 크기가 낮아짐에 따라 최대 진폭 (~ 100 - 300 μV)에 도달한다는 것을 관찰하십시오. </li></ol></li><li> 단일 영역의 세타 진동 <ol><li> CA1 영역에서 자발적인 세타 진동의 공간 특성을 시험하기 위해 팁중앙 CA1 부위 (길이 방향의 중격 - 측두 축을 따라 중간에 위치)에서 LFP 전극을 참조하고 이전에 설명한대로 방사체로 내립니다. </li><li> 두 번째 LFP 전극을 CA1 사이트 (200 - 800 μm septal 또는 첫 번째 LFP에서 일시적)에 배치하고 CA1 쎄타 진동이 비교적 큰 거리에서 동기화 될 수 있음을 관찰합니다. </li></ol></li><li> 레이어를 통한 쎄타 진동 <ol><li> 해마 층의 세타 진동의 특성을 시험하기 위해 CA1 라지 타텀 사이트에 기준 LFP 전극을 남겨 둡니다. 지층 oriens 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 피라미드 세포층으로 내리고 radiatum을 통과시킵니다. 피라미드 층을 가로 지르는 LFP 신호의 점진적인 반전 (상대 위상 역전)을 관찰하십시오. 참고 : 이러한 유형의 활동에 대한 대표적인 예는 그림 2B를 참조하십시오. 층류 / 깊이 프로파일 및 전류 소스 밀도 (CSD) 분석기의 예고립 해마에서의 위상 반전 위치가 이전에 23 , 24 , 25 로 발표되었다. </li></ol></li><li> 손상되지 않은 해마에서 감마 진동과 theta-gamma 커플 링 <ol><li> 필드 전극을 CA1 / SUB 경계에 놓고 피라미드 층과 분자 층 사이의 계면에 위치 할 때까지 낮추십시오. 이 레벨에서 로컬 세타 리듬으로 위상 고정되는 진폭 변화로 명확한 감마 진동을 표시하는 필드 전위를 기록 할 수 있습니다 24 . 쎄타 - 감마 커플 링의 느린 시간 스케일을 관찰하기 위해 스케일링을 조정하십시오. 감마 버스트는 두 개의 다른 주파수 대역에서 발생하며 저속 (25 - 50 Hz) 및 빠른 감마 (150 - 250 Hz) 범위에서 진행중인 LFP 신호를 대역 통과 필터링하여 나타낼 수 있습니다 ( 그림 2C 참조) 흔적). </li></ol></li><li> 체외 hippocampal theta oscillations 동안 전체 세포 패치 클램프 녹음 참고 : 프로토콜의이 부분에서는 PV promoter (tdTomato)의 제어하에 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 형질 전환 PV-TOM 마우스로부터 격리 된 해마에서 확인 된 신경 세포로부터 시각적으로 유도 된 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻는 것이 목표입니다 자세한 내용은 참고 자료 및 참조 26 ). <ol><li> PV - TOM 마우스 ( 그림 3 )에서 hippocampal 준비 표면 근처에 tdTomato 긍정적 인 interneurons을 시각화하기 위해 낮은 (2.5X) 및 높은 전력 (40X) 확대와 형광 비디오 현미경을 사용하십시오. PV-TOM 뉴런은 알 부스 (최대 100 μm)를 통한 패치를 성공적으로 시각화하고 표적화 할 수 있지만, 해마가 앵글 컷 기술로 준비 될 때 비 형광성 피라미드 세포에 비교적 쉽게 도달 할 수 있음을 유의하십시오 (참조 섹션 2.2.14 주).</li><li> 해마의 낮은 배율보기에서 패치 클램프 실험을 준비하면서 세타 진동을 모니터링하기 위해 CA1 / SUB에 LFP 전극을 배치하십시오. </li><li> 배율을 40X로 전환하고 대상 영역에 목표물을 담그십시오. 상단 레이어가 보일 때까지 낮추십시오. 반대쪽에서 패치 피펫 접근을위한 충분한 오픈 액세스를 보장하기 위해 현미경의 위치를 ​​조작. </li><li> 형광 현미경 검사에서 형광 PV-TOM 세포를 선택하고 표준 세포 내 용액으로 채워진 패치 피펫 (2 - 3 MΩ)으로 접근하십시오. </li><li> 마우스 피스를 사용하여 가벼운 양의 압력을 피펫에 가하고 전극이 세포로 내려갈 때 저항을 모니터링합니다. 팁이 표적 세포를 만날 때, 피펫 저항이 증가하고 양성 압력이 막을 밀 때 명확한 딤플이 나타난다. 압력을 해제하고 씰이 형성되기 시작할 때 전류 펄스가 평평 해지는지 확인하십시오. 즉시 clamp에서 과분극 된 전위 (-70 mV)로 전환되고 GΩ 씰이 달성되면 피펫 홀더를 통해 가해지는 소량의 음압으로 세포막이 파열됩니다. </li><li> 일단 전체 세포 구성, 자발적인 해마 진동 ( 그림 3B ) 동안 식별 PV 세포의 생리 특성을 검사하십시오. </li><li> PV 세포에서 세포 내막 전위 기록은 진행중인 CA1 / SUB 쎄타 리듬과 동기화되는 빠른 전위 행동 및 파열 작용 전위를 특징으로한다는 것을 관찰하십시오. </li><li> 전압 클램프로 전환하고 본질의 리듬 활동에 의해 생성 된 흥분성 대 억제 성 시냅스 전류의 비율을 특성화하기 위해 세포를 다른 멤브레인 전위로 유지합니다. 비교를 위해 피라미드 셀로부터의 패치 클램프 기록의 예가 도 3a 에 도시되어있다. </li></ol></li><li> 격리 된 해마의 Optogenetic 제어 </strong&gt; 참고 : hippocampal 네트워크 활동의 optogenetic 제어 들어, 이러한 세포가 고립 된 해마 25 의 주요 세포 인구를 동기화에 중요한 역할을 것으로 나타 났습으로 PV 함유 GABAergic 세포의 리듬 활성화와 관련된 세포 유형의 구체적인 전략은 여기에 사용됩니다. PV 세포에서 흥분성 채널 루돕 신 -2 (ChR2)의 선택적 발현은 PV-Cre 마우스 라인을 ChR2 Cre 의존적으로 발현하는 마우스 (Ai32)와 교차시킴으로써 PV-ChY 마우스를 생성함으로써 달성된다. 또는 CA1 / SUB interneurons에서 흥분성 옵신의 발현을 유도하기 위해 PV-Cre 또는 PV-TOM 마우스 (P15-16)의 해마에 바이러스 벡터 구조물 ( 예 : AAVdj-ChETA-eYFP)을 주입 할 수 있습니다 ( 그림 4A ). 참고 :이 전략은 이전에 설명되었습니다 25 . <ol><li> CA1 / SUB 영역에 LFP 전극을 놓고 격리 된 hippoc에 인근 피라미드 셀을 패치하십시오PV 신경 세포에서 청색 빛 민감성 흥분성 옵신 ChR2를 발현하는 마우스의 ampus. </li><li> 광섬유 광 가이드 (직경 0.2 - 1mm)를 해마 제제 위에 놓고 기록 된 부위의 중앙에 놓습니다. 세타 주파수 (4 - 12 Hz)에서 전달되는 광 펄스 (트랜지스터 - 트랜지스터 논리 신호에 의해 트리거되는 10 - 20 ms) 또는 사인파 전압 명령으로 구성된 광 발생 자극을위한 LED 소스의 청색 빛 (473 nm)을 사용하십시오. 참고 : 사용자 정의 LED 기반 광 자극 어셈블리는 다른 곳에서 설명했습니다 25 . </li><li> 전류 클램프로 전환하고 자발적인 세타 진동 동안 피라미드의 활동을 특성화합니다. </li><li> 자극 프로토콜을 시작하고 빛의 반응을 기록합니다. 기록 된 신경 세포에서 현장 진동과 시냅스 활동이 광학 유전 자극 동안 점점 더 동기화되고 PV 세포의 리듬 페이싱이 두 주파수( 그림 4 ). </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

급성 hippocampal 조각에서 electrophysiological 녹음은 표준 체외 기술을 구성하는 동안, 여기에 제시된 방법은 고전적인 접근 방식과 크게 다릅니다. 특정 세포 층이 표면에서 볼 수 있고 직접 검사 할 수있는 얇은 슬라이스 준비와 달리 손상되지 않은 해마 준비물은 개별 층을 통과하면서 전극을 대상 뇌 영역으로 낮추는 생체 내 구성과 유사합니다. 해마의 무결성은 기능적 연결성 및 국부 연결 인구의 특성과 함께 보존됩니다. 이것은 해마에서 소규모 및 대규모 네트워크 진동을 조사하기위한 복잡하고 강력한 도구를 제공합니다. 예를 들어 네트워크에 사전 배선 된 회로와 셀 유형의 특정 특성이 결합되어있어 본질적으로 자발적으로 생성 된 리드 미칼 한 세타 및 감마 진동을 생성하여 히포카의 중요한 특징을 모방합니다생체 내에서의 mpal 활성. 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하면 해마는 설치류의 뇌에서 신속하게 추출 할 수 있으며 빠르게 흐르는 aCSF 환경에서 몇 시간...

Hippocampal theta oscillations (4 - 12 Hz)는 포유 동물의 뇌에서 가장 두드러진 리듬 활동 중 하나이며, 시공간 정보의 처리 및 일란성 기억 1 , 2 , 3의 형성과 같은인지 기능에서 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 공간 탐색 및 병변 연구와 함께 theta-modulated place-cell의 관계를 강조하는 몇 가지 생체 내 연구와 임상 증거는 hippocampal theta oscillations이 기억 형성 4 , 5 , 6에 관여한다는 견해를 뒷받침한다. 해마 생성의 세타 진동은 아직 완전히 이해되지 않았다. 초기 생체 내 조사는 세타 활성이 외인성 발진기, 특히 리듬 입력에 주로 의존한다고 제안했다중격과 entorhinal 피질 같은 구 심성 뇌 구조에서 7 , 8 , 9 , 10 . 내인성 요인 - 해마 신경 세포의 내부 연결성과 해마 뉴런의 성질 -은 시험관 내 관찰 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 근거하여 가정되었다. 그러나 몇 가지 획기적인 연구 19 , 20 , 21 을 제외하고 간단한 체외 조각 준비에서 생리적으로 현실적인 인구 활동을 복제 할 수있는 접근법을 개발하는 데 어려움이 있습니다오랫동안 해마와 그 주변의 본질적인 능력을 세타 진동을 스스로 발생시키는 데 더 상세한 실험적 검사를 지연시켰다. 체외의 얇은 슬라이스 실험 환경 에서 표준의 중요한 단점은 뇌 구조의 3D 세포 및 시냅스 조직이 일반적으로 손상된다는 것입니다. 즉, 공간적으로 분산 된 세포 어셈블리를 기반으로하는 여러 형태의 협동 네트워크 활동이 하나 이상의 뇌 영역 (&gt; 1mm)에 걸쳐있는 국소 그룹 (반경 ≤1mm)에서 뉴런 인구에 이르기까지 지원 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세타 진동이 해마에서 어떻게 나타나고 관련 피질 및 피질 하부 구조로 전파되는지 연구하는 데는 다른 유형의 접근법이 필요했습니다. 최근 몇 년 동안 양방향 intera를 검사하기위한 &quot;완전한 septo-hippocampal&quot;준비의 초기 개발두 구조물 (22) 및 「격리 해마 &quot;제제 계속되는 진화 ctions는 고유 진동 세타 리듬 외부 입력 (23)이 결여 된 해마에서 자발적으로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법의 값은 이들 영역의 전체 기능 구성이 체외 (22)에서의 세타 리듬 발전기로서 작동하기 위해 유지했다 초기 통찰력에 놓여있다.

<table><tbody><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - 인산나트륨 일염기</td>성 <td>시그마 알드리치</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>뇌 추출</td></tr><tr><td>메스 손잡이 # 4, 14cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>뇌 추출</td></tr><tr><td>필터 집게, 편평한 턱, 직선 (11cm)</td> <td>WPI</td><td>500456</td><td>뇌 추출</td></tr><tr><td>파라곤 스테인레스 스틸 메스 블레이드 # 20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>뇌 추출</td></tr><tr><td>미세 포인트 곡선 해부 가위</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>뇌 추출</td></tr><tr><td>테프론 (PTFE) 코팅 얇은 주걱</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>Hayman 스타일 마이크로 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>실험실 숟가락</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>붕규산 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>면도날 단일 모서리</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>렌즈 종이 (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>유리 페트리 접시 (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>해마 준비</td></tr><tr><td>얼음용 플라스틱 트레이; 크기 30 x 20 x 5 cm</td><td>n.a.n.a</td><td>.해</td><td>마 준비</td></tr><tr><td>단일 인라인 솔루션 히터</td><td>워너 인스트루</td><td>먼트SH-27B</td><td>관류 시스템</td></tr> 버<tr><td>블링 용 수족관 에어 스톤</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td> <td>관류 시스템</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 튜빙 (ID 1/16 OD 1/8)</td> <td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>관류 시스템</td></tr><tr><td>전기 프라이팬</td><td>블랙 & Decker</td><td>n.a</td><td>.관류 시스템</td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 가스 혼합물(발탄원)&nbsp;</td><td>Vitalaire</td><td>SG466204A</td><td>관류 시스템</td></tr><tr><td>유리병/플라스크(4 x 1 L)</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td>관류 시스템</td></tr><tr><td>수중 녹음 챔버</td><td>맞춤형 설계(FM)</td><td>n.a.</td><td>상업적 대안 사용 가능</td></tr><tr><td>유리 피펫(1.5/0.84 OD/ID(mm) )</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz 노이즈 제거기</td><td>Quest Scientific</td><td>Q-Humbug</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>MULTICLAMP</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Commander Program</td><td>분자 장치</td><td>MULTICLAMP</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>디지털/아날로그 컨버터</td><td>분자 장치</td><td>DDI440</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>분자 장치</td><td>PCLAMP10</td><td>전기생리학</td></tr><tr><td>진동 절연 테이블&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.electrophysiology</td><td></td></tr> <tr><td>Micromanipulators (수동 작동)</td> <td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MX130</td><td>전기생리학(LFP)</td></tr><tr><td>미세 조작기(자동)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>전기생리학(패치)</td></tr><tr><td>오디오 모니터&nbsp;</td><td>A-M 시스템</td><td>모델 3300</td><td>전기 생리학</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 / 패치 피펫 풀러</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>전기 생리학</td></tr><tr><td>맞춤형 직립 형광 현미경</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.Imaging</td><td></td></tr> <tr><td>아날로그 비디오 카메라</td><td>COHU</td><td>4912-2000 / 0000</td><td>이미징</td></tr><tr><td>디지털 프레임 그래버 이미징 소프트웨어</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>이미징</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>이미징</td></tr><tr><td>Olympus 40X 물 이머젼 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>이미징</td></tr><tr><td>맞춤형 발광 다이오드(LED) 시스템&nbsp;</td><td>맞춤형</td><td>n.a.</td><td>광유전학적 자극 (Amhilon et al., 2015)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>재고 번호 008069</td><td>허용&nbsp; PV 중간뉴런에서 Cre 지시 유전자 발현</td></tr><tr><td>구성-조건부 Ai9 마우스(R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))</td><td>Jackson Laboratory</td><td>재고 번호 007905</td><td>Express TdTomato Following Cre-mediated recombination</td></tr><tr><td>Ai32 마우스(R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 012569</td><td>Cre에 노출된 후 개선된 channelrhodopsin-2/EYFP 융합 단백질을 표현합니다. recombinase</td></tr><tr><td>PVChY 마우스</td><td>자체 사육</td><td>n.a.PV-Cre</td> <td>라인을 Ai32 마우스 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP)와 교배하여 얻은 자손</td></tr></tbody></table>

hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 septohippocampal circuit에서 기록하는 방법론

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

이 프로토콜은 세타 진동의 연구를위한 방법론 및 응용 프로그램의 최근 개선과 함께 고립 된 전체 해마, WT 및 유전자 변형 생쥐에서 준비하고 녹음 절차를 설명합니다. 고립 해마 준비의 간단한 특성 분석을 통해 내부 hippocampal theta 발진기와의 관계를 cornum ammonis-1 (CA1) 및 subiculum (SUB) 영역의 피라미드 세포 및 GABA 신경계 인터페론의 활성과 함께 검사합니다. 전반적으로, 우리는 고립 된 해마가 체외에서 본질적인 세타 진동 을 생성 할 수 있으며, 해마 내에 생성 된 리듬이 parvalbumin 양성 (PV) 신경 세포의 광학 유전 자극에 의해 정확하게 조작 될 수 있음을 보여줍니다. 시험관에서 분리 된 해마 제제는 시각적으로 확인 된 neu에서 동시에 현장 및 세포 내 패치 클램프 기록을 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다theta 리듬 세대의 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

<html> 이 섹션 은 체외에서 마우스 격리 hippocampal 준비 에 세타 진동을 공부하여 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 분리 된 해마를 추출하기위한 해부 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 준비를 사용하여 내장 된 세타 진동은 여러 필드 전극을 배치하는 동안 검사 할 수 있으며 전반적인 활동을 기록하고 격리 된 해마의 여러 ​​지역 및 레이어에있는 연결 인구에 대한 시냅스 입력을 동기화 할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 동시 전체 세포 패치 클램프 및 세포 외 녹음의 대표 결과는 자발적인 해마 세타 진동 ( 그림 3 ) 동안뿐만 아니라 리듬 활동의 optogenetic 조작 중에 특정 세포 유형의 발화 및 시냅스 특성을 특성화하기 위해 제공됩니다g &quot;...

여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 전체 해마 표본을 추출하는 절차를 제시하고, 필드, 단일 및 패치 클램프 기록과 광유전학적 자극을 사용하여 리드미컬한 뉴런 네트워크의 생성을 탐구하는 것입니다. 이 방법은 해마의 리듬성 진동의 기초가 되는 세포 및 시냅스 메커니즘 연구를 크게 용이하게 함으로써 학습 및 기억이라는 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최적화된 표본을 사용하여 해마 의존적 기억 정보에서 결정적인 역할을 하는 세부 진동 회로를 조사할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 뇌를 해부 접시 위에 똑바로 놓은 후 면도날로 소뇌를 제거하고, 정중 시상면(mid sagittal plane)을 따라 뇌를 반으로 자른 뒤 분리된 두 반구를 보관 챔버로 옮깁니다. 다음으로, 반으로 나눈 뇌 한쪽을 해부 접시 위에 똑바로 놓습니다. 정중 시상 구조가 실험자를 향하고, 시상 내측의 얇은 배 모양 조직 층으로 중격 복합체(septal complex)의 내장된 윤곽이 보일 때까지 접시를 회전시킵니다.그런 다음, 코팅된 스파튤라를 중격 아래에 삽입하고 해부 접시가 보일 때까지 끝부분을 아래로 이동시켜 중격 부위를 가로지르는 섬유들을 절단합니다. 이제 중격의 전방 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하여 뇌의 전방 부위와 연결된 섬유들을 절단합니다. 스파튤라로 해마 바로 위 피질의 내측 부분을 가볍게 잡고 수직으로 세운 상태에서, 마이크로스파튤라를 사용하여 시상, 시상하부 및 나머지 뇌줄기 핵들을 조심스럽게 아래로 끌어내립니다.그 다음, 스패튤라를 사용하여 분리된 조직을 절단하여 제거합니다. 이후, 코팅된 스패튤라를 배측 해마의 주둥이 쪽 끝 아래에 있는 외측 뇌실에 삽입합니다. 스패튤라를 반구 절제된 뇌의 정중시상면과 일직선이 되도록 수평으로 잡고, 팁이 심장 쪽으로 나올 때까지 뇌실벽의 매끄러운 윤곽을 따라 밀어 넣습니다.해마 아래에 스패출러를 잡고 해마가 상위 피질과 연결되는 안쪽 층의 연결 섬유를 가볍게 누릅니다. 그런 다음 이 층의 바깥쪽에 마이크로스패출러를 대고 코팅된 스패출러 방향으로 눌러 연결 섬유를 절단합니다. 적출을 완료하려면 해단 접시를 회전시키고 코팅된 스패출러를 복측 해마 아래로 삽입합니다. 스패출러로 해마를 가볍게 잡고, 스패출러에 대고 썰어내는 동작으로 내분비 연결 부위를 절단합니다.분리가 완료되면 해마를 접시 위에 둔 상태로 유지하고, 냉각 상태를 유지하기 위해 얼음처럼 차가운 수크로스 용액 한 방울을 첨가합니다. 남아 있는 피질과 섬유를 조심스럽게 다듬고, 면삭(fornix) 부위에 면도날을 부드럽게 대어 해마를 중격(septum)으로부터 분리합니다. 그 후, 준비물을 상온의 수크로스 용액으로 옮겨 15분에서 30분 동안 회복시킨 다음 기록 챔버로 옮깁니다.이 단계에서는 산소화된 ACSF가 지속적으로 고속 유입될 수 있도록 중력식 관류 시스템을 설정합니다. 그런 다음 ACSF 흐름을 중단하고, 유리 피펫의 넓은 끝부분을 사용하여 해마를 기록 챔버로 옮깁니다. 수크로스가 포화된 표본이 바닥으로 가라앉아 안정될 때까지 기다립니다.CA1과 하각(subiculum)의 매끄러운 표면이 위로 향하도록 하여 준비된 조직을 기록 챔버 중앙에 배치하십시오. 중격 및 측두 말단에 작은 추를 놓아 해마를 고정하고 ACSF 흐름을 다시 시작하십시오. 이 과정에서 LFP 전극을 해마 표면까지 내립니다.LFP 전극을 파라미터 층(parameter layer)을 통해 진입시키면서, 개별 뉴런의 단일 단위 방전(single unit discharge)이 감지됨에 따라 세포 외 스파이킹 활동이 증가하는 것을 관찰하십시오. 전극을 더 낮추어 팁이 방사상층(radiatom)으로 진입함에 따라 스파이킹이 다시 사라지기 시작하는 것을 확인하십시오. 기록 위치가 방사상층을 통해 내려감에 따라 세타 주파수 범위의 네트워크 진동이 뚜렷하게 나타나며 최대 진폭에 도달하는 것을 관찰하십시오.CA1 영역 전체에서 자발적인 theta 진동의 공간적 특성을 테스트하려면, 두 번째 LFP 전극을 CA1 부위에 배치하여 CA1 theta 진동이 넓은 거리에서 동기화되는지 관찰하십시오. 해마 층 전체에서 theta 진동의 특성을 테스트하려면, 기준 LFP 전극을 CA1 radiatum 부위에 그대로 둡니다. stratum oriens 바로 위에서 시작하여, 두 번째 전극을 pyramidal cell layer와 radiatum을 통해 아래로 내리십시오.파라미터 층(parameter layer) 전체에 걸쳐 LFP 신호가 점진적으로 반전되는 것을 관찰하십시오. 온전한 해마에서 감마 진동과 세타-감마 결합을 테스트하려면, 필드 전극을 CA1 subiculum 경계에 배치하고 파라미터 층과 분자 층(molecular layer) 사이의 접점에 위치할 때까지 내리십시오. 이 수준에서는 국소 세타 리듬에 위상 잠금된 진폭 변화를 보이며 뚜렷한 감마 진동을 나타내는 필드 전위가 기록될 수 있습니다.그런 다음, 세타 감마 결합의 느린 시간 척도를 관찰하기 위해 스케일을 조정합니다. 감마 버스트는 진행 중인 LFP 신호 내의 밴드 분석을 통해 느린 감마 범위와 빠른 감마 범위라는 두 개의 뚜렷한 주파수 대역에서 발생함을 알 수 있습니다. in vitro 해마 세타 진동 중 전체 세포 패치 클램프 기록을 위해, 저배율 및 고배율 형광 비디오 현미경을 사용하여 PV tom 마우스의 해마 표본 표면 근처에 위치한 tdTomato 양성 인터뉴런을 시각화합니다.해마의 저배율 뷰에서, 패치 클램프 실험을 준비하는 동안 세타 진동을 모니터링하기 위해 CA1 하구(subiculum)에 LFP 전극을 배치하십시오. 그런 다음, 40배 배율로 전환하고 대물렌즈를 표적 영역 위로 침전시키십시오. 형광 현미경 하에서 상층부가 보일 때까지 렌즈를 내린 후, 형광 PV tom 세포를 선택하고 표준 세포 내 용액이 채워진 패치 피펫으로 접근하십시오.전세포 기록(whole cell configuration) 상태가 되면, 자발적인 해마 진동 동안 확인된 PV 세포의 생리학적 특성을 조사합니다. 빠른 스파이킹 동작과 지속적인 CA1 하구(subiculum) 세타 리듬에 동기화된 활동 전위 버스트가 특징인 PV 세포의 세포 내 막전위 기록을 관찰하십시오. 이 절차에서는 CA1 하구 영역에 LFP 전극을 배치하고, PV 인터뉴런에 청색광 민감성 흥분성 옵신인 CHR2를 발현하는 마우스의 분리된 해마 내 인접한 파라미터 세포를 패치합니다.해마 표본 위에 광섬유 라이트 가이드를 배치하고 기록 영역의 중심에 맞춥니다. 광유전학적 자극을 위해 LED 광원의 청색광을 사용하며, 이는 세타 주파수로 전달되는 10~20밀리초의 빛 펄스 또는 사인파 전압 명령으로 구성됩니다. 전류 클램프 모드에서 자발적 세타 진동 동안 기록된 세포의 활성을 분석합니다.그런 다음, 자극 프로토콜을 시작하고 빛 반응을 기록합니다. 광유전학적 자극 동안 장의 진동과 시냅스 활성 및 기록된 뉴런이 점점 더 동기화되며, PV 세포의 리듬감 있는 페이싱이 세타 진동의 주파수와 전력 모두를 강력하게 제어함을 관찰하십시오. 여기에 제시된 것은 세타 진동 중에 파라미터 세포에서 기록된 전기생리학적 활성입니다.전류 클램프 기록에서는 휴지기 동안 자발적이지만 리듬감이 없는 발화가 나타나며, 천천히 나타나는 LFP 진동과 명확하게 동기화되지 않은 억제성 시냅스 후 전위가 관찰됩니다. 전압 클램프 기록 결과, 이에 대응하는 억제성 시냅스 후 전류의 역전 전위는 약 -70 mV입니다. 그리고 여기, 세타 진동 동안 fast-spiking 형광 PV 인터뉴런에서 기록된 전기생리학적 활성이 있습니다.전류 고정(current clamp) 모드에서, 이 세포는 휴지 상태에서 자발적으로 발화하고 있었으며, 안정적인 LFP 진동과 위상 잠금된 리듬감 있는 흥분성 후시냅스 전위에 의해 강하게 유도되었습니다. 전압 고정(voltage clamp) 기록에서, 흥분성 후시냅스 전류의 역전 전위는 약 0 mV였습니다. 숙련되면 이 기술은 2~3시간 내에 수행할 수 있으며, 이 절차를 시도할 때는 용액에 산소를 충분히 공급하고 전생리학적 기록 동안 표본 위로 따뜻한 ACSF가 고속이면서도 일정하게 흐를 수 있도록 하는 관류 시스템을 사용하는 것이 중요함을 기억해야 합니다.이 절차 이후에, 광유전학적 자극이나 특정 세포군-의 억제와 같은 다른 방법들을 사용하여 해마에서 세타 진동자를 형성하는 세포 하위 유형을 식별하는 것과 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경과학 분야의 연구자들은 in vitro에서 해마의 중격-측두축에 걸친 세타 진동의 역동성을 체계적으로 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 전위, 유닛 및 패치 클램프 기록과 광유전학적 자극을 이용하여 리듬성 신경망의 기능을 탐구하기 위해 해마 전체 조직을 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 GABAergic 내측 중격 뉴런에 빛에 민감한 이온 채널이 있는 유전자 조작 마우스 모델에서 세타 진동을 조절하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 광 펄스를 해마에 전달함으로써 뉴런 활동을 동기화하고 국소 자기장 전위로 기록되는 세타 진동을 생성하는 것을 목표로 합니다.

마우스 모델에서 Theta Oscillations의 선택적 조작

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응을 기록하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에 자극 및 기록 전극을 배치하고 시냅스 반응 강도를 평가하기 위해 fEPSP(field excitatory postsynaptic potential)를 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응 기록

이 비디오는 마우스 모델의 해마에 와이어 전극 어레이와 광섬유를 정위 이식하는 방법을 보여줍니다.

전극 배열과 광섬유를 마우스 해마에 이식

이 비디오는 고립된 해마에서 세타 진동이라고도 하는 리드미컬한 뉴런 네트워크 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 전극은 세타 진동을 감지하고 분석하기 위해 다양한 층과 공간 위치에 삽입됩니다. 이것은 독특한 뉴런 구성과 해마의 여러 층에 걸친 뉴런 네트워크의 연결성을 보여줍니다.

마우스 해마의 세타 진동에 대한 시험관 내 기록

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 유전적으로 변형된 빛에 민감한 인터뉴런을 활성화하여 세타 진동 동기화를 향상시키고 신경 회로 동작을 연구함으로써 광유전학을 사용하여 해마 네트워크 역학을 조절하는 방법을 보여줍니다.

해마 네트워크 역학의 광유전학적 제어

해마의 세타 활동은 특정인지 및 행동 단계와 관련이 있습니다. 여기에서는 시간-주파수(즉, 웨이블릿 분석) 기반 접근 방식을 사용하여 해마 내에서 고도로 조직화된 세타 진동을 감지하는 분석 방법을 설명합니다.

쥐 EEG에서 매우 조직 된 세타 진동의 자동 감지

우리 동작 쥐에서 hippocampal 세타 진동 (5-10 Hz)의 선택적 조작에 대 한 optogenetics 및 electrophysiological 기록의 사용을 설명합니다. 리듬 유입의 효능은 사용 하 여 로컬 필드 가능성을 모니터링 하 고 있다. 광학-및 pharmacogenetic 저해의 조합 해결 hippocampal 동기화의 원심 판독 합니다.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

이 프로토콜 로컬 필드 전위 선형 실리콘 프로브 멀티 생크와의 녹음을 설명 합니다. 현재 소스 밀도 분석을 사용 하 여 신호 변환 마우스 해 마에 지역 전기 활동의 개조를 허용 한다. 이 기술을 공간적으로 제한 된 뇌 진동 자유롭게 마우스를 이동에 공부 될 수 있다.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

우리는 세로 해마 뇌 슬라이스에 기록 및 자극 전극을 사용하고 세포 외 후유증 전위를 불러 일으키고 입증하기 위해 생체 내 등도 해마에서 세로 로 배치 된 기록 및 자극 전극을 사용했습니다. 세로 인터라멜라 CA1을 따라 장기 시냅스 가소성.

전기 생리학 필드 기록에 의하여 인터라멜라 해마 CA1에 있는 장기 시냅스 가소성 조사

이 프로토콜은 국소 자기장 전위를 기록하고 쥐 해마와 전전두엽 피질의 정보 흐름을 조사하기 위해 맞춤형으로 설계된 기록 장치와 전극의 사용을 간략하게 설명합니다.

Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex의 Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex(생쥐 해마와 전전두엽 피질의 이중 세포외 기록)

학습하세요 격리된 설치류 해마에서 쎄타 및 감마 진동을 필드, 유니터리, 패치클램프 기록 및 광유전학 자극을 사용하여 연구하는 방법을. 이 기법은 해마 의존 기억의 신경 회로와 세포 메커니즘을 탐구하는 데 필수적입니다.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝

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